蜂房栓劑制備工藝及抑痔藥效學(xué)研究

王紹仙 趙若丹 王 瑩 王玉新 陳旭冰

大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671000

痔瘡是直腸下端的肛墊出現(xiàn)病理性肥大的表現(xiàn)，民間常說(shuō)“十人九痔”，可見(jiàn)痔瘡是一種常見(jiàn)病，其臨床表現(xiàn)為局部炎癥、水腫、疼痛、糜爛、便血，甚則脫肛[1-2]。在痔瘡的諸多治療方法中，局部給藥能直接作用于發(fā)病部位，更好地發(fā)揮藥效，是一種較理想的給藥途徑，其中以栓劑應(yīng)用最為廣泛。栓劑對(duì)初期內(nèi)痔及二、三期內(nèi)痔有止血、止痛、收斂、消炎等作用，對(duì)全身癥狀和直腸炎癥也有治療作用。蜂房是胡蜂的巢，《本草綱目》、《本草綱目彩色藥圖》記載，蜂房具有祛風(fēng)、攻毒、殺蟲(chóng)、止痛的功效，可以治療痔瘡[3-4], 《神農(nóng)本草經(jīng)》也記載，蜂房能治腸痔?，F(xiàn)代研究[5]發(fā)現(xiàn)，蜂房中含有黃酮類化合物，黃酮類化合物具有抗炎的作用，為古籍療法提供了一定的科學(xué)依據(jù)。為了探討蜂房對(duì)痔瘡的治療作用，本文將蜂房提取物制成栓劑，并進(jìn)行了藥效學(xué)評(píng)價(jià)。

1 材料與儀器

1.1 材料 金環(huán)胡蜂蜂房購(gòu)自云南省大理市下關(guān)鎮(zhèn)，經(jīng)云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊自忠教授鑒定為膜翅目(Hymenoptera)胡蜂科(Vespidae)胡蜂屬(Polistes)昆蟲(chóng)金環(huán)胡蜂Vespa mandarinia Smith的蜂房。乙醇為國(guó)產(chǎn)分析純，水為蒸餾水，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：100080-200707，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，混合脂肪酸甘油酯(批號(hào)：20160928，上海源葉生物科技有限公司)。

1.2 儀器 R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)，JY2002電子天平(上海精其儀器有限公司)，METTLER TOLEDO分析天平(上海梅特勒—托利多儀器有限公司)，HWS-12型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，DHG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，搖擺式中藥粉碎機(jī)(上海燁昌食品機(jī)械有限公司)。

2 栓劑的制備

2.1 浸膏的制備 取金環(huán)胡蜂蜂房(如圖1所示)1000 g，加入3000 mL 50%乙醇加熱回流提取2 h，提取液經(jīng)棉花過(guò)濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮后得浸膏，將浸膏置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)在70℃條件下烘4 h，恒重，得浸膏100 g，研磨，過(guò)80目篩，備用。

圖1 金環(huán)胡蜂蜂房

2.2 總黃酮含量的測(cè)定

2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取0.0106 g蘆丁，加入適量50%乙醇完全溶解后轉(zhuǎn)移至25 mL的棕色容量瓶中，定容，備用。

2.2.2 顯色方法 取待測(cè)樣品溶液1 mL于l0 mL比色管中，加50%乙醇定容至2.0 mL。加入5%的亞硝酸鈉溶液0.5 mL，混勻，靜置6 min后加入10%的硝酸鋁溶液0.5 mL，混勻，靜置6 min后再加入4%的氫氧化鈉溶液4.0 mL，用50%的乙醇定容，靜置15 min后測(cè)定吸光度。取1 mL 50%乙醇溶液作為待測(cè)樣品按上述操作配制空白對(duì)照溶液[5]。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL于10 mL棕色容量瓶中，按上述顯色方法顯色后，在360 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。每個(gè)樣品重復(fù)操作3次取平均值，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]。

2.2.4 總黃酮含量的測(cè)定 取0.02 g浸膏溶于10 mL甲醇溶液中，取1 mL溶液按上述操作步驟測(cè)定吸光度值，測(cè)3次取平均值，將吸光度值帶入回歸方程，得到總黃酮的濃度，計(jì)算出總黃酮的含量為0.39 mg/g。

2.3 主藥劑量確定 露蜂房浸膏粉在每枚栓中的含量根據(jù)總黃酮的含量和臨床栓劑質(zhì)量確定。

2.4 栓劑的制備

2.4.1 純基質(zhì)栓的制備 將10 g混合脂肪酸甘油酯置于蒸發(fā)皿中，70 ℃條件下水浴加熱至熔化，灌入涂有液體石蠟油的栓模中，靜置凝固，削去溢出部分，啟模(如圖2所示)，選取5枚稱重分別為0.98、0.95、0.96、0.94、0.97 g，平均栓重G為0.96 g。

圖2 純基質(zhì)栓

2.4.2 含藥栓的制備 將混合脂肪酸甘油酯置于蒸發(fā)皿中，70 ℃條件下水浴加熱至熔化，再加露蜂房浸膏粉，灌入涂有液體石蠟油的栓模中，靜置凝固，削去溢出部分，啟模(如圖3所示)，選取5枚稱重分別為1.24、1.23、1.21、1.22、1.20 g，平均栓重M為1.22。

圖3 蜂房栓

2.4.3 計(jì)算置換價(jià) 根據(jù)公式DV=W/[G-(M-W)]計(jì)算置換價(jià)，W為一枚含藥栓中的平均含藥質(zhì)量，經(jīng)計(jì)算置換價(jià)為1.62。

2.4.4 處方最大含藥量確定 稱取3份20 g混合脂肪酸甘油酯于70℃條件下水浴加熱至熔化，分別加入5 g、10 g和15 g露蜂房浸膏粉，灌入涂有液體石蠟油的栓模中，靜置凝固，削去溢出部分，啟模，分別得到含主藥20%、33%和43%的栓劑。以外觀、成型和硬度為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，選擇最大含藥量為33%。

2.4.5 融變時(shí)限 將自制蜂房栓3枚，分別置于融變儀中測(cè)定融變時(shí)限。3枚蜂房栓均在(22±2)內(nèi)融化、軟化，符合油脂性基質(zhì)要求。

3 蜂房栓對(duì)痔瘡的作用

3.1 材料

3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，6周齡，SPF級(jí)，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：S(湘)2016-0002。25 ℃室溫喂養(yǎng)，給予大鼠專用標(biāo)準(zhǔn)飼料、純凈水，自由取食飲水，所有實(shí)驗(yàn)研究均符合中國(guó)倫理委員會(huì)有關(guān)動(dòng)物研究指導(dǎo)原則。

3.1.2 藥品及試劑 IL-1β試劑盒(批號(hào)：20170901)、IL-6 試劑盒(批號(hào)：20170901)、TNF-α試劑盒(批號(hào)：20170901)、iNOS試劑盒(批號(hào)：20170901)等均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

3.2 方法

3.2.1 分組 50只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為空白組、模型組、治療組高、低劑量組和陽(yáng)性藥組(消炎痛栓組)，每組10只。

3.2.2 造模 空白組大鼠未處理，其余組用水合氯醛行腹腔麻醉。模型組和實(shí)驗(yàn)組均用浸吸巴豆油混合液的棉球插入麻醉后的大鼠肚門內(nèi)，將大鼠頭朝上提起直立，10 s后拔出[6]。

3.2.3 給藥 陽(yáng)性對(duì)照組和受試藥組分別給予消炎痛栓和蜂房栓劑，加熱融化后，按大鼠重量制成小塊納入大鼠肛門，并用膠布固定。除空白組和模型組外，其余組于造模6 h后開(kāi)始給藥，共給藥2次，每次間隔6 h。末次給藥6 h后，動(dòng)物處死取肛周組織。

3.2.4 取材 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以棉簽插入肛門為指引，沿肛周0.5 cm環(huán)形分離肚門，深至直腸上1.0～1.5 cm，剪斷腸管，冰浴上充分研磨，離心后取其上清液移至管中放入冰箱保存。

3.3 結(jié)果

3.3.1 肛周組織形態(tài)改變 空白組大鼠肛門回縮，無(wú)水腫等異常情況；模型組大鼠肛周組可見(jiàn)紅腫，大量分泌物，偶見(jiàn)輕度糜爛，未見(jiàn)出血點(diǎn)。陽(yáng)性藥組大鼠肛周組織仍有輕度紅腫，但無(wú)分泌物、糜爛和出血。蜂房栓劑低劑量組大鼠肛周組中度紅腫，有少量分泌物，無(wú)出血和糜爛。蜂房栓劑高劑量組大鼠肛周組輕度紅腫，有少量分泌物，無(wú)出血和糜爛。如表1。

表1 蜂房栓劑對(duì)肛周組織形態(tài)的影響

3.3.2 蜂房栓劑對(duì)TNF-α、IL-6、IL-1β和iNOS含量的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠組織中TNF-α、IL-6、IL-1β及iNOS含量顯著升高(P<0.01)。與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性組大鼠組織中TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS含量顯著降低 (P<0.01)，低劑量組除iNOS含量顯著降低外(P<0.01)，對(duì)其它炎癥因子無(wú)明顯影響，高劑量組顯著降低組織中TNF-α、IL-6、IL-1β及iNOS含量(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 蜂房栓劑對(duì)肛周及直腸組織中炎癥因子的影響

4 討論

栓劑形式給藥既可以避免胃酸和消化道酶對(duì)藥物的破壞，又可以避免藥物對(duì)胃黏膜的刺激，同時(shí)能直接作用于病灶部位而迅速發(fā)揮作用，提高患者的生活質(zhì)量，栓劑在腔道給藥中尤其具有優(yōu)勢(shì)[7]。栓劑的制備過(guò)程中，基質(zhì)的選擇尤為重要，在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)分別選用水溶性基質(zhì)聚乙二醇(PEG)和脂溶性基質(zhì)混合脂肪酸甘油酯為栓劑基質(zhì)，以外觀、成型和硬度為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)混合脂肪酸甘油酯為基質(zhì)制備的栓劑優(yōu)于聚乙二醇為基質(zhì)制備的栓劑，因此選擇混合脂肪酸甘油酯為栓劑基質(zhì)。民間常用蜂房喂牛、馬等牲畜來(lái)預(yù)防疾病?！侗静菥V目》記載，蜂房可以治療痔瘡，但對(duì)其抑痔作用的藥效學(xué)研究未見(jiàn)報(bào)道。為進(jìn)一步深入挖掘蜂房的藥用價(jià)值，本研究將蜂房提取物制成栓劑，并進(jìn)行了初步的藥效學(xué)評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)蜂房栓劑明顯減輕痔周組織的炎癥反應(yīng)，模型動(dòng)物肛周紅腫范圍明顯縮小，分泌物減少，炎癥因子顯著降低，結(jié)果證明蜂房栓劑對(duì)痔瘡有一定的治療作用，在治療痔瘡上具有開(kāi)發(fā)價(jià)值。另有報(bào)道稱其藥效作用物質(zhì)可能為黃酮類化合物[5，8]，蜂房藥效物質(zhì)基礎(chǔ)至今仍不明確，還需進(jìn)一步研究。