測(cè)定龍膽草提取液中龍膽苦苷含量方法的建立

胡永志 黃 靜 劉文佳 梁雪松 黃光偉

(柳州兩面針股份有限公司，廣西 柳州 545001)

引言

龍膽為龍膽科植物條葉龍膽Gentiana manshurica Kitag.、龍膽Gentiana scabra Bge.、三花龍膽Gentiana triflora Pall或堅(jiān)龍膽Gentiana rigescens Franch.的干燥根和根莖。龍膽草在中藥制劑中使用非常廣泛，且用量較大。目前藥典中規(guī)定，龍膽草的藥用部位為干燥根[1-2]，而大量的莖、葉、花則棄之。研究發(fā)現(xiàn)其根及根莖含有裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷、生物堿、黃酮、甾體、香豆素及內(nèi)酯等化合物[3]。其中龍膽苦苷含量最高，被《中國(guó)藥典》定為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制的目標(biāo)成分[4]。龍膽苦苷為環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有保肝、利膽、健胃、抗炎、抗菌等功效[5-8]。本研究采用高效液相色譜法測(cè)定龍膽提取液中龍膽苦苷的含量，為龍膽提取液中龍膽苦苷含量的檢測(cè)提供可靠的手段，以期為開(kāi)發(fā)該藥材藥用價(jià)值提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀系統(tǒng)(G7129A 1260Vialsampler, G7111 1260 Quat Pump VL, G7114A 1260VWD)；梅特勒-托利多ML204型電子天平；天津奧特賽恩斯儀器有限公司AS3120型超聲波清洗器；梅特勒-托利多FE20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)；龍膽苦苷對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究所(含量以97.6%計(jì))；Fisher chemical色譜純甲醇；超純?nèi)ルx子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(B)-水(A)，流動(dòng)相梯度如下表1所示；流速為1mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；進(jìn)樣量20 μL。按此色譜條件下測(cè)定，龍膽提取液樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 流動(dòng)相梯度

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取龍膽苦苷對(duì)照品0.01 g，置50mL容量瓶中，加入適量甲醇，振蕩溶解，再加甲醇至刻度，搖勻，備用。

2.3 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取龍膽提取液0.1 g，置10mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾液為供試品溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取2.2龍膽苦苷對(duì)照品儲(chǔ)備液2、4、6、8、10mL分別置于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，依前述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積(Y)對(duì)濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：

Y=13.8381X+7.3008

r=0.99991

結(jié)果表明，龍膽苦苷濃度在40～200μg/mL時(shí)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取龍膽提取液制備的供試品溶液，依前述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定龍膽苦苷含量，結(jié)果見(jiàn)表2。6次進(jìn)樣測(cè)得樣品龍膽苦苷含量平均值為1.6727，RSD為0.48%，結(jié)果表明，該方法精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取龍膽提取液制備的供試品溶液，依前述的色譜條件在0、0.5、1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、24.0 h分別進(jìn)樣，測(cè)定龍膽苦苷含量，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，在24小時(shí)內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好，平均值為1.6611，RSD為0.69%。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一瓶龍膽提取液平行稱(chēng)取樣品6份，依照2.3分別制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。計(jì)算得龍膽提取液中龍膽苦苷平均含量為1.6682，RSD為0.43%，表明分析方法重現(xiàn)性良好。

表4 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的龍膽提取液6份行樣，分別精密加入不同量的龍膽苦苷對(duì)照品，攪勻，依照2.3制成供試品溶液，按上述方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。其平均回收率為99.78%，表明本方法準(zhǔn)確可靠。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定

取龍膽提取液6批，依照2.3分別制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定龍膽苦苷含量，每批檢測(cè)3次，計(jì)算其平均值，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 牙膏中龍膽苦苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)最終確定使用Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，柱溫為35 ℃，流速為1mL/min，在此條件下龍膽苦苷色譜峰分離較為理想。采用本方法測(cè)定龍膽提取液中龍膽苦苷含量，樣品處理方法簡(jiǎn)便，流動(dòng)相組成簡(jiǎn)單，龍膽苦苷濃度在40～200μg/mL與峰面積成良好的線性關(guān)系(r=0.99991)，平均加標(biāo)回收率為99.78%，能準(zhǔn)確測(cè)定龍膽提取物中龍膽苦苷的含量，為控制該藥材質(zhì)量提供了可靠的方法。