基于微衛(wèi)星標(biāo)記的圖們江大麻哈魚遺傳多樣性分析

閆春梅，鄭偉，高春山，韓葉，李忠強(qiáng)，李秀穎

（吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院，長春 吉林 130033）

大麻哈魚Oncorhychus keta 屬鮭形目Salmoniformes 鮭科Salmonidae 太平洋鮭屬Oncorhynchus的冷水性洄游魚類[1]，在中國分布于黑龍江、圖們江、烏蘇里江、松花江、琿春河、密江、綏芬河、嫩江、牡丹江以及臺(tái)灣省的大甲溪等水系。水利工程阻礙了大麻哈魚洄游通道，破環(huán)了自然產(chǎn)卵場和索餌場，大麻哈魚自然種群數(shù)量急劇下降，2007 年被列入《中國國家重點(diǎn)保護(hù)經(jīng)濟(jì)水生動(dòng)植物資源名錄（第一批）》，多年來依靠人工增殖放流補(bǔ)充其自然資源量。近年來，有關(guān)大麻哈魚的群體年齡組成及生長性狀[2-4]、繁殖力[5-7]、種群結(jié)構(gòu)[8-11]、生物學(xué)性狀[12-14]及放流標(biāo)記方法[15-17]和放流效果評估[18,19]等已有研究。但人工增殖放流活動(dòng)對圖們江大麻哈魚野生自然種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的影響未見報(bào)道。

遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)的分析是評估種質(zhì)資源現(xiàn)狀的主要途徑和種質(zhì)保護(hù)的核心內(nèi)容，也是增殖放流工作的重要環(huán)節(jié)，具有重要的作用[20]。用于增殖放流的群體必須具有豐富的遺傳多樣性。在群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析過程中，微衛(wèi)星標(biāo)記法的分辨率高，可以檢測共顯性遺傳，已成為有效的熱門標(biāo)記手段[21-25]。本實(shí)驗(yàn)利用已發(fā)表的10 對微衛(wèi)星引物[26]，分析了2015、2016、2017 及2018 年在圖們江采捕到的大麻哈魚親魚的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，并分析人工增殖放流是否會(huì)影響大麻哈魚群體的遺傳多樣性，可為大麻哈魚種質(zhì)資源保護(hù)、恢復(fù)大麻哈魚野生自然群體資源量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用大麻哈魚樣品采捕于中國吉林省圖們江流域，總計(jì)169 尾，其中2015 年62 尾，2016 年29 尾，2017 年28 尾，2018 年50 尾，分別取鰭條樣本置于95%乙醇中備用。

1.2 基因組DNA 提取

用超純水沖洗鰭條樣本，去除殘余乙醇。晾干后剪碎，按照DNA 提取試劑盒（鼎國昌盛生物公司）說明書提取基因組DNA。經(jīng)OD260/280分析測定DNA 濃度后，稀釋至100 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR 擴(kuò)增

本研究所用10 對微衛(wèi)星引物均由本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)，引物多態(tài)性良好，GenBank 登錄號(hào)為MH619620-MH619629（表1）。由上海生物工程有限公司合成熒光引物。PCR 反應(yīng)體系中含有10×PCR Buffer 1 μL，dNTP 0.2 μL，MgCl20.4 μL，引物各0.2 μL，Ex Taq 酶0.04 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至10 μL。94℃2 min，（94℃30 s，Tm 30 s，72℃30 s）5 個(gè)循環(huán)，（94℃30 s，50℃30 s，72℃30 s）30 個(gè)循環(huán)，72℃5 min。應(yīng)用3730xl 基因分析儀檢測PCR 產(chǎn)物。

表1 引物序列Tab.1 The sequences of primer used in the experiment

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用PopGen 32 軟件處理，計(jì)算等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、香農(nóng)信息指數(shù)（I）、Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)（P）、近交系數(shù)（Fis）、分化系數(shù)（Fst）和基因流（Nm）。采用PIC-CALC 計(jì)算平均多態(tài)信息含量（PIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 基因分型結(jié)果

利用10 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對169 尾大麻哈魚鰭條樣本進(jìn)行熒光PCR 反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)血管電泳檢測后，根據(jù)熒光標(biāo)記的顏色，用軟件Genemapper 分析基因型，讀取單個(gè)大麻哈魚樣本在各個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型片段大?。▓D1）。

圖1 大麻哈魚微衛(wèi)星引物在個(gè)體中的等位基因峰圖Fig.1 Electropherogram peaks of microsatellite primers in chum salmon

2.2 遺傳多樣性

應(yīng)用10 對微衛(wèi)星引物估算了圖們江大麻哈魚2015、2016、2017 及2018 年4 個(gè)群體的Na、Ne、Ho、He、I 和H-W（表2）。由表2 可知，4 個(gè)年度群體中共檢測到Na 397 個(gè)，Ne 為4.7853～6.1309，Ho 為0.6500～0.7200，He 為0.7663～0.8359，I 為1.8128～1.9836。利用PIC 計(jì)算軟件計(jì)算群體平均多態(tài)信息含量為0.7288～0.8017，均為高度多態(tài)（PIC＞0.5）。

表2 4 個(gè)年度群體的10 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性分析Tab.2 Parameters of genetic diversity analyzed by ten loci in populations of chum salmon in four years

10 對微衛(wèi)星引物在4 個(gè)群體中進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，所有位點(diǎn)均為多態(tài)位點(diǎn)，其中符合H-W 平衡的位點(diǎn)有18 個(gè)（P＞0.05），其他22 個(gè)位點(diǎn)偏離H-W 平衡（P＜0.05）。

2.3 群體間遺傳結(jié)構(gòu)

2015—2018 四年的大麻哈魚群體的10 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記近交系數(shù)中，分別有8、7、9、5 個(gè)位點(diǎn)為正值，平均值為0.0298～0.1758。通過基因流（Nm）和群體間遺傳分化系數(shù)（Fst）分析可知（表3），Nm＜1 的位點(diǎn)0 個(gè)，1＜Nm＜4 的位點(diǎn)6 個(gè)，其他4 個(gè)位點(diǎn)Nm＞4。群體間平均遺傳分化系數(shù)為0.0755。

表3 10 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳分化系數(shù)及基因流Tab.3 Fst and gene flow of 10 polymorphic loci

這4 個(gè)年度大麻哈魚群體的遺傳相似系數(shù)為0.4505～0.8249，其中2015 年和2017 年群體遺傳相似系數(shù)最大（0.8249），2016 年和2018 年群體遺傳相似系數(shù)最?。?.4505）。遺傳距離為0.1925～0.7974，其中2016 年和2018 年群體遺傳距離最大（0.7974），2015 年和2017 年群體遺傳距離最?。?.1925）。

3 討論

3.1 圖們江大麻哈魚生殖洄游群體遺傳多樣性

本研究利用10 對已發(fā)表的高度多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)（PIC＞0.5）分析了圖們江4 個(gè)年度大麻哈魚群體的遺傳結(jié)構(gòu)及多樣性。這些位點(diǎn)遺傳多樣性較豐富，適宜用于大麻哈魚群體的遺傳多樣性評估[26]。

表4 大麻哈魚4 個(gè)群體Nei 氏遺傳相似系數(shù)（上三角）及遺傳距離（下三角）Tab.4 Nei’s genetic identity（diagonal above）and genetic distance（diagonal below）in four groups of chum salmon

遺傳多樣性是種內(nèi)個(gè)體之間或一個(gè)群體內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異總和，是一個(gè)物種成功應(yīng)對人為干擾的決定因素。遺傳多樣性程度決定著其進(jìn)化趨勢[27]。本研究利用10 對微衛(wèi)星標(biāo)記分析了圖們江大麻哈魚4 個(gè)年度生殖洄游群體的遺傳多樣性，主要分析了等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、雜合度、多態(tài)信息含量、香農(nóng)指數(shù)和Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)等。結(jié)果表明，4 個(gè)群體平均等位基因數(shù)：9.7～10.6；平均有效等位基因數(shù)：4.7853～6.1309；平均觀測雜合度為0.6500～0.7200，平均期望雜合度為0.7663～0.8359。雜合度是指隨機(jī)抽取的樣本中兩個(gè)等位基因不相同的可能性。期望雜合度主要是根據(jù)種群內(nèi)當(dāng)前優(yōu)勢等位基因的分布頻率來推算的。而觀測雜合度是隨機(jī)抽取的兩個(gè)樣本的等位基因不相同的概率。雜合度越高說明遺傳多樣性越豐富[28]。雖然圖們江大麻哈魚人工增殖放流活動(dòng)已開展十余年，但其群體遺傳多樣性仍較豐富，平均期望雜合度甚至略高于Chen 等[29]2005 年對圖們江流域大麻哈魚群體的評估結(jié)果。

平均多態(tài)信息含量（PIC）表示一個(gè)后代所獲得某個(gè)等位標(biāo)記來自其親本的同一個(gè)等位標(biāo)記的可能性，分為低度（＜0.25）、中度（介于0.25～0.5 之間）和高度多態(tài)位點(diǎn)（＞0.5）[30]，通常用來評估遺傳多樣性豐度。據(jù)此，本研究中10 個(gè)微衛(wèi)星分析4 個(gè)圖們江大麻哈魚群體的平均多態(tài)信息含量為0.7288～0.8017，均大于0.5，屬于高度多態(tài)性群體。

Hardy-Weinberg 平衡條件是：無限大的群體；隨機(jī)婚配；沒有突變；沒有選擇；沒有遷移；沒有遺傳漂變（小群體內(nèi)基因頻率隨機(jī)波動(dòng)）[31]。但實(shí)際應(yīng)用中，一般沒有完全符合理想情況的群體。用P 值衡量群體的基因型分布與H-W 平衡偏差的程度，P值越低表示偏差越大。本研究中可能樣本量不足、分型有誤或樣本選取偏差，40 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中僅29個(gè)符合H-W 平衡[32]。

3.2 圖們江大麻哈魚生殖洄游群體間遺傳結(jié)構(gòu)

基因流（Nm）和群體間遺傳分化系數(shù)（Fst）是用來分析群體間遺傳分化程度的兩個(gè)重要參數(shù)。Slatkin[33]和Hamrick[34]認(rèn)為，Nm 越小群體分化程度越大。本研究中10 個(gè)位點(diǎn)的平均Nm 值為3.0598，介于1～4 之間，表明群體間發(fā)生了一般程度的基因交流。

通常用Fst（Fixation index）來衡量群體之間的遺傳分化。Fst 為1 說明兩個(gè)群體完全獨(dú)立；0 說明兩個(gè)群體之間自由雜交。Fst 值越大，說明遺傳距離越遠(yuǎn)；值越低，說明大多數(shù)的遺傳變異發(fā)生在同一個(gè)群體內(nèi)。Wright[35]建議，實(shí)際研究中，F(xiàn)st 小于0.05，可以忽略不計(jì)；Fst 介于0.05～0.15 之間，表明遺傳分化程度中等；Fst 高于0.15 則遺傳分化程度較大。本實(shí)驗(yàn)Fst 為0.0755，說明約有92.45%的遺傳變異存在于種群內(nèi)，7.55%的遺傳變異存在于種群間，屬中等程度的遺傳分化。群體內(nèi)近交系數(shù)為正值，表明群體內(nèi)近交明顯。

遺傳相似性和遺傳距離能夠衡量出群體間的遺傳關(guān)系[36]。本研究中，2015 年和2017 年群體遺傳相似系數(shù)最大（0.8249），遺傳距離最?。?.1925），親緣關(guān)系最近。相反，2016 年和2018 年群體遺傳相似系數(shù)最?。?.4505）。遺傳距離最大（0.7974），親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

為補(bǔ)充大麻哈魚種質(zhì)資源量，每年都開展大麻哈魚人工增殖放流活動(dòng)，但由于放流群體和自然群體之間存在遺傳差異，勢必會(huì)對自然種群產(chǎn)生負(fù)面影響[37]，必須建立科學(xué)合理的人工增殖放流體系，檢測人工增殖親本的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，這對保障人工增殖放流效果具有重要意義。本研究表明：中國圖們江大麻哈魚生殖群體遺傳多樣性較高，具有一定的遺傳潛力，可作為選育群體。建議不同增殖群體可在不同流域交叉放流，使群體遺傳多樣性更加豐富，最大限度減少人工增殖放流對野生群體遺傳結(jié)構(gòu)及多樣性的影響[38]。