鹽度對(duì)SBR短程硝化系統(tǒng)中硝化細(xì)菌的影響*

余志英，龔澤平，王小蘭

(廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006)

由于目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于高鹽滲濾液的研究極少涉及鹽度對(duì)SBR短程硝化過(guò)程中硝化細(xì)菌的影響，因此，逐步增加鹽度至25 g/L，探究SBR反應(yīng)器中AOB與NOB在數(shù)量與種群多樣性的變化，可以為處理高鹽滲濾液的短程硝化工藝提供污水可處理鹽度參考范圍。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)材料取自胡雪柳[11]的SBR短程硝化系統(tǒng)處理模擬垃圾滲濾液過(guò)程中的活性污泥。模擬垃圾滲濾液水質(zhì)情況如表1所示。從初始鹽度為5 g/L的垃圾滲濾液中取出的活性污泥作為樣品1，逐步提高鹽度至25 g/L的垃圾滲濾液中取出的活性污泥作為樣品2，均在提高鹽度后運(yùn)行周期的中后期取樣。各周期出水的三氮濃度、亞硝化率和氨氮去除率情況如圖1所示。

表1 模擬垃圾滲濾液水質(zhì)Table 1 Water quality of simulated landfill leachate

圖1 不同鹽度下的出水水質(zhì)Fig.1 Effluent quality under different salinities

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熒光定量PCR法

絕對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法一般是利用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將在相同的條件下目的基因測(cè)得的熒光信號(hào)量同標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而得到目的基因的量[12]。本實(shí)驗(yàn)將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為10-5～10-9五個(gè)濃度梯度，然后進(jìn)行定量PCR，以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的CT值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)質(zhì)?？截悢?shù)公式：

C=6.02×1023×C0/M

(1)

式中：C為拷貝數(shù)(copies/μL)；C0為質(zhì)粒濃度(g/mL)；M為含目的基因質(zhì)粒的分子量(g/mL)。

采用PowerBiofilmTMDNA Isolation Kit試劑盒分別提取2個(gè)活性污泥樣品總DNA，經(jīng)梯度PCR，重組DNA的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選鑒定和熒光定量PCR，最后測(cè)出2種樣品中AOB和NOB的CT值即可計(jì)算出拷貝數(shù)。

1.2.2 DNA提取與測(cè)序

采集樣品1和2的活性污泥，使用PowerBiofilmTMDNA Isolation Kit試劑盒提取總的DNA，外加相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

AOB-F:5'-GGAGGAAAGTAGGGGATCG-3'

AOB-R:5'-CGTCCTCTCAGACCARCTACTG-3'

NOB-F:TTTTTTGAGATTTGCTAG

NOB-R:CTAAAACTCAAAGGAATTGA。

然后用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行DNA純化，得到目標(biāo)AOB和NOB的DNA條帶，回收，通過(guò)T載體連接、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，得到AOB與NOB文庫(kù)。從文庫(kù)中選取培養(yǎng)成功的菌外加接種到SOC Amp培養(yǎng)基上的菌落送至生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹽度(25g/L)對(duì)AOB與NOB數(shù)量的影響

圖2中以紅點(diǎn)繪制的AOB標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式為Y=-3.672X+48.705，線性范圍為105～109，擴(kuò)增效率為87.211%，確定系數(shù)R2=0.992。

圖2 AOB熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果Fig.2 AOB Real-time PCR results

圖3中，以紅點(diǎn)繪制的NOB標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為Y=-3.876X+48.15，線性范圍為105～109，擴(kuò)增效率為79.881%，確定系數(shù)R2=0.982。

圖3 NOB熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果Fig.3 NOB Real-time PCR results

處理樣品數(shù)據(jù)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出拷貝數(shù)，整理得表2和圖4。發(fā)現(xiàn)將垃圾滲濾液中的氯化鈉含量由5 g/L經(jīng)70個(gè)周期逐步增加至25 g/L，AOB平均拷貝數(shù)下降了57%，而NOB平均拷貝數(shù)卻提高了3倍。由于拷貝數(shù)和菌的數(shù)量有直接的關(guān)系，所以拷貝數(shù)的下降意味著菌種數(shù)量的減少。結(jié)合張宇坤[9]的研究結(jié)果，當(dāng)鹽度突然增加到25 g/L時(shí)，AOB的活性降低了68%?？梢?jiàn)，在25 g/L的鹽度沖擊下，AOB的數(shù)量與活性都下降了一半以上。

表2 AOB與NOB定量PCR拷貝數(shù)Table 2 AOB and NOB Quantitative PCR copy number

圖4 AOB與NOB定量PCR結(jié)果柱狀圖Fig.4 AOB and NOB quantitative PCR results histogram

為進(jìn)一步驗(yàn)證逐步增加鹽度對(duì)硝化細(xì)菌數(shù)量的影響，是否能說(shuō)明SBR反應(yīng)器中的短程硝化轉(zhuǎn)變?yōu)槿滔趸?，將兩個(gè)樣品的拷貝數(shù)進(jìn)行整理得到圖5。多數(shù)研究報(bào)告指出，全程硝化工藝中AOB與NOB的數(shù)量比(A/N)要高于1:2，而要實(shí)現(xiàn)短程硝化的穩(wěn)定進(jìn)行，其中的A/N就必須接近于1:0[14,17]。結(jié)合圖5分析可知，低鹽環(huán)境下的短程硝化過(guò)程，AOB從數(shù)量上看為優(yōu)勢(shì)菌，且NOB數(shù)量很少，符合短程硝化NO2--N積累的特點(diǎn)。但AOB與NOB的數(shù)量比為87:13，在數(shù)量級(jí)上A/N并不是很接近1:0。而25 g/L鹽度下，AOB數(shù)量的下降與NOB數(shù)量的上升，使得A/N比變?yōu)?0.7:59.3，約等于0.69，高于1:2。如此一來(lái)，說(shuō)明在SBR反應(yīng)器中，硝化細(xì)菌的變化可以間接的判斷反應(yīng)器中硝化過(guò)程的類型。高鹽環(huán)境下，短程硝化系統(tǒng)會(huì)被破壞，轉(zhuǎn)變?yōu)槿滔趸?/p>

圖5 氯化鈉(25 g/L)抑制前與抑制后AOB與NOB在硝化細(xì)菌中的占比Fig.5 The proportion of AOB and NOB in nitrifying bacteria before and after inhibition of sodium chloride(25 g/L)

2.2 鹽度(25 g/L)對(duì)AOB群落結(jié)構(gòu)的影響

圖6 樣品1測(cè)序結(jié)果用Neighbour-joint 法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Sample 1 sequencing results phylogenetic tree constructed with Neighbour-joint

本實(shí)驗(yàn)中樣品1送樣31個(gè)，樣品2送樣31個(gè)。測(cè)序結(jié)果在數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank 采用BLAST 程序進(jìn)行同源性檢索，把同源性較高的認(rèn)為是同一種屬，如若出現(xiàn)多個(gè)相似度高的不同種屬，則選其中一種為代表。其中樣品1 BLAST結(jié)果為14個(gè)不同可培養(yǎng)的OTU，樣品2結(jié)果為15個(gè)不同的OUT。在 NCBI 上搜索參考序列，利用軟件 MEGA-X 對(duì)樣品1與樣品2的序列進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，采用Neighbour-joint 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖6，圖7所示。

圖7 樣品2 測(cè)序結(jié)果用Neighbour-joint 法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.7 Sample 2 Sequencing results Phylogenetic tree constructed with Neighbour-joint(注：括號(hào)里的數(shù)字表示為所含序列數(shù)，以98%的序列相似性劃分菌種，每個(gè)菌種隨機(jī)挑選一條代表序列用于構(gòu)建AOB序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。)(Note:The numbers in parentheses indicate the number of sequences contained,and the strains are divided by 98% sequence similarity.Each strain is randomly selected to represent the phylogenetic tree of AOB sequence.)

根據(jù)圖6、圖7的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所測(cè)樣品全部屬于變性菌綱(Proteobacteria)的β-亞綱下的亞硝化單胞菌群(Nitrosomonas)。樣品1中的8個(gè)菌種在樣品2中未檢測(cè)到，推測(cè)其為不耐鹽菌，因高鹽度形成的高滲透壓環(huán)境，以及高氯離子對(duì)微生物產(chǎn)生的毒害作用，微生物的代謝功能與活性受到強(qiáng)烈的抑制，所以在25 g/L的鹽度沖擊下大量死亡[8]。樣品2中新增了8類菌種，但序列數(shù)均不超過(guò)2，占全部AOB序列的66.7%。這與鄒高龍[5]的觀點(diǎn)一致，即由于微生物強(qiáng)大的環(huán)境適應(yīng)能力，部分AOB為適應(yīng)高鹽環(huán)境，會(huì)改變其代謝途徑，最終引起菌種的改變。然而，由于AOB平均代時(shí)長(zhǎng)，缺少由不耐鹽菌轉(zhuǎn)變?yōu)槟望}菌的緩沖期，使得耐鹽菌未能在短時(shí)間內(nèi)成為優(yōu)勢(shì)菌，超過(guò)半數(shù)的不耐鹽菌因失水死亡，氨氧化過(guò)程受到一定的影響。

2.3 鹽度(25 g/L)對(duì)NOB群落結(jié)構(gòu)的影響

將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行整理得到NOB的11類不同序列，位點(diǎn)差異情況如表3所示。

表3 堿基差異位點(diǎn)表Table 3 Base difference locus table

表2表明，送去測(cè)序的菌中有62.5%的序列相同，其中差異點(diǎn)主要為35號(hào)位點(diǎn)A的嵌入或丟失，少數(shù)有差異位點(diǎn)的菌與大多數(shù)序列一致的菌差異位點(diǎn)不超過(guò)三個(gè)，同一個(gè)位置的差異位點(diǎn)在其他序列中差異數(shù)不超過(guò)兩個(gè)。由此可認(rèn)為序列中NOB種類可能不是很多，即原來(lái)菌群的種類不多。

將序列上傳到NCBI的BLAST進(jìn)行比對(duì)并整理，以考察序列的物種名稱。由于相似度很高且匹配度與匹配值相同，所以3、4、5 可能有以下兩個(gè)種類：Nitrobacter sp.strain Nato、Nitrobacter winogradskyi(ATCC 25381)。同理1、2、6、7、8、9、10、11可能有以下四個(gè)種類：Nitrobacter sp.NKU、Nitrobacter sp.NBW1、Nitrobacter winogradskyi strain Nb-255和Nitrobacter sp.Strain 311。

圖8 Clustalw進(jìn)化樹(shù)Fig.8 Clustalw phylogenetic tree

將序列上傳到Clustal W進(jìn)行分析，以分析序列間起源關(guān)系，得出圖8。根據(jù)親緣關(guān)系及相似性，我們將3和5歸為Group I；將6、7、8歸為Group II；4單獨(dú)歸為Group III；2、11、10歸為Group IV；9、1歸為Group V。因此，認(rèn)為加鹽抑制后SBR反應(yīng)器中一共有5種類型的NOB。高鹽環(huán)境下，NOB數(shù)量、種群多樣性增加，一定存在Nitrobacter winogradskyi(ATCC 25381)和Nitrobacter sp.strain Nato兩種菌，而Nitrobacter sp.NKU、Nitrobacter sp.NBW1、Nitrobacter winogradskyi strain Nb-255和Nitrobacter sp.Strain 311四種菌中一定存在三種。

3 結(jié) 論

(1)通過(guò)測(cè)定樣品中AOB與NOB特定基因序列含量，比較低鹽度5 g/L與高鹽度25 g/L環(huán)境下各自拷貝數(shù)的差異，發(fā)現(xiàn)鹽度增加后AOB數(shù)量下降了57%，而NOB數(shù)量卻提高了3倍，硝酸化過(guò)程被激活，短程硝化系統(tǒng)被破。

(2)SBR短程硝化系統(tǒng)中優(yōu)勢(shì)菌為AOB，逐步增加鹽度至25 g/L后則轉(zhuǎn)變?yōu)镹OB。鹽度的增加使得SBR反應(yīng)器中的短程硝化轉(zhuǎn)變?yōu)槿滔趸?，即可通過(guò)硝化細(xì)菌數(shù)量的變化規(guī)律簡(jiǎn)單判斷硝化過(guò)程的類型。

(3)NOB與AOB相比，在逐步增加鹽度馴化過(guò)程中更容易適應(yīng)高滲環(huán)境，出現(xiàn)耐鹽菌種。