分子印跡的SiO2熒光探針制備及對(duì)兒茶酚的探測(cè)

孫文潭，程 燕，張 潁

(1 安徽皖欣環(huán)境科技有限公司,安徽 合肥 230000；2 合肥市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站,安徽 合肥 230000)

兒茶酚常被用作染發(fā)劑、硬化劑、皮膚殺菌、電鍍添加劑和照相顯影劑等，是化工、醫(yī)藥和農(nóng)藥的中間體[1-2]。兒茶酚對(duì)人體呼吸道具有強(qiáng)烈的刺激性及致癌性，已被列入致癌物清單，因此，迫切需要尋求對(duì)兒茶酚的高選擇性識(shí)別和高敏感探測(cè)的方法。目前檢測(cè)兒茶酚的方法主要有高效液相色譜法、電化學(xué)法、固相萃取-高效液相色譜聯(lián)用法及毛細(xì)管電泳-化學(xué)發(fā)光法[3-6]，盡管這些方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)兒茶酚的檢測(cè)，但仍存在步驟繁瑣、成本高昂、重現(xiàn)性差等缺點(diǎn)。傳統(tǒng)分子印跡聚合物有著制備簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、可重復(fù)使用，且具有特異識(shí)別性、構(gòu)效預(yù)定性和廣泛實(shí)用性等優(yōu)點(diǎn)[7]，但是缺點(diǎn)是有效識(shí)別位點(diǎn)少，結(jié)合量小，吸附速率慢，進(jìn)入識(shí)別位點(diǎn)的目標(biāo)分析物自身無信號(hào)輸出。納米材料表面印跡和識(shí)別位點(diǎn)功能化修飾可以解決傳統(tǒng)分子印跡的缺點(diǎn)，已成為近年研究熱點(diǎn)[8-12]。

本文將納米合成、分子印跡技術(shù)與光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)理相結(jié)合，在SiO2納米粒子的表面構(gòu)建了熒光標(biāo)記兒茶酚分子印跡的識(shí)別位點(diǎn)的探針，對(duì)其等溫吸附量及選擇性探討，進(jìn)一步利用其熒光特性與兒茶酚濃度關(guān)系作為信號(hào)輸出實(shí)現(xiàn)了對(duì)兒茶酚高選擇性識(shí)別和高敏感探測(cè)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 納米二氧化硅的制備

首先將TEOS和適量的乙醇混合加入到500 mL帶有磨口塞的三口圓底燒瓶中，用磁力攪拌器以固定轉(zhuǎn)速500 rpm攪拌3 min，使TEOS與乙醇充分混合，然后將氨水迅速加入到上述反應(yīng)液中，以750 rpm攪拌3 min后，再次將轉(zhuǎn)速降至500 rpm，持續(xù)攪拌18～24 h，制得二氧化硅凝膠溶液。

1.2 二氧化硅納米粒子表面兒茶酚分子的印跡

避光下，將2 mg NBD和1 mL APTS加入到15 mL無水乙醇中，超聲分散5 min，放入振蕩器中在室溫下振蕩20 h。將上述制備好的NBD-APTS溶液與上述制備的納米SiO2凝膠溶液混合，避光條件下用磁力攪拌器以500 rpm攪拌24 h，得到NBD-APTS和氨丙基修飾的SiO2納米粒子，將修飾后的SiO2納米粒子平均分裝在四支50 mL的離心管中，進(jìn)行離心分離和溶劑的置換。分別用95%的乙醇和無水乙醇溶液依次離心、分散和置換3次。取上述10 mL NBD-NH2-SiO2納米粒子溶液放入磨口的100 mL錐形瓶中，加入50 mL乙醇稀釋，超聲分散5 min后，加入30 mg兒茶酚、1 mL APTS、1.5 mL的TEOS和10 mg CTAB繼續(xù)超聲5 min，在磁力攪拌器上以350 rpm的轉(zhuǎn)速反應(yīng)10 h。非印跡的SiO2納米粒子的制備與上述過程相同，僅未加兒茶酚。

1.3 洗脫處理

水解聚合反應(yīng)后，離心分離印跡SiO2納米粒子，用乙醇反復(fù)洗滌三次以去除溶脹劑及殘余的有機(jī)單體等有機(jī)物，所得的印跡SiO2納米粒子反復(fù)在體積比為8:1:1(甲醇/乙酸/乙腈)的混合液中回流以提取兒茶酚模板分子，直到提取液在278.5 nm左右無紫外吸收峰為止，再用乙醇洗滌去除殘留的乙酸，然后在丙酮溶液中浸泡過夜，最后常溫真空干燥至恒重，得到對(duì)兒茶酚特異性識(shí)別的NBD-NH2-SiO2納米粒子熒光探針。

2 結(jié)果與討論

圖1 SiO2納米粒子表面NBD標(biāo)記的兒茶酚分子印跡識(shí)別位點(diǎn)的熒光探針的制備過程示意圖Fig.1 Schematic illustration of a preparation process for the fluorescence probe of catechol molecules imprinted forming recognition sites labeled by NBD fluorescein on the SiO2 nanoparticle surface

圖1說明具有高選擇性識(shí)別和敏感探測(cè)的熒光標(biāo)記兒茶酚分子印跡的納米粒子的制備過程。1-2：NBD-APTS復(fù)合物、過量的硅烷化試劑APTS在SiO2的表面與羥基水解縮合反應(yīng)，使得SiO2表面修飾上氨基和熒光殘基基團(tuán)(NBD-NH2-)；2-3：模板分子兒茶酚、功能單體APTS和交聯(lián)劑TEOS通過水解縮合反應(yīng)制備得到了在SiO2納米粒子表面NBD標(biāo)記的兒茶酚分子印跡識(shí)別位點(diǎn)的熒光探針，3-4：NBD熒光標(biāo)記的兒茶酚分子印跡SiO2納米通過洗脫模板分子兒茶酚后(熒光閉)與再結(jié)合(熒光開)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物兒茶酚分子選擇性識(shí)別和敏感性探測(cè)的過程。洗脫了在識(shí)別位點(diǎn)中的模板分子兒茶酚后，SiO2熒光探針的熒光強(qiáng)度變?nèi)?；?dāng)目標(biāo)分子兒茶酚再次進(jìn)入到識(shí)別位點(diǎn)后，探針的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，通過熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)兒茶酚分子的選擇性識(shí)別和敏感性探測(cè)。

圖2說明的是用乙醇作為參比溶液，測(cè)得NBD、APTS和NBD-APTS的紫外可見吸收光譜。a，b和c線分別表示的是NBD、NBD-APTS和APTS紫外-可見吸收光譜。APTS和NBD反應(yīng)后在可見區(qū)460 nm處出現(xiàn)了新的吸收峰，表明NBD-APTS復(fù)合物的生成。

圖2 3種化合物在乙醇溶液中的紫外-可見吸收光譜圖a，b和c線分別表示的是NBD、NBD-APTS和APTS紫外-可見吸收光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectra of the three compounds in ethanol solution.The curve lines for a,b and c represent the UV-Vis absorption spectra of NBD,NBD-APTS and APTS,respectively

圖3 熒光標(biāo)記兒茶酚分子印跡的NBD-NH2-SiO2納米粒子掃描電鏡圖Fig.3 SEM image of NBD-NH2-SiO2 nanoparticles imprinted with catechol molecules

圖3是熒光標(biāo)記兒茶酚分子印跡的NBD-NH2-SiO2納米粒子的掃描電鏡，所制備的SiO2納米粒子表面修飾和兒茶酚印跡后仍為單分散球形納米粒子，且表面較為光滑，粒徑分布均勻，大小約200 nm。

圖4 印跡材料對(duì)兒茶酚(a)和對(duì)苯二酚(b)，以及非印跡材料對(duì)兒茶酚(c)的吸附等溫線Fig.4 The adsorption isotherm of imprinted materials to catechol (a)and hydroquinone(b)and non-imprinted materials to catechol(c),respectively

圖4中印跡材料對(duì)兒茶酚的(a)和結(jié)構(gòu)類似物對(duì)苯二酚等溫吸附線(b)，以及非印跡材料對(duì)兒茶酚的等溫吸附線(c)。選取與兒茶酚結(jié)構(gòu)類似物的對(duì)苯二酚驗(yàn)證印跡材料的選擇性。

從圖4中可以看出兒茶酚在印跡聚合物微球上的最大平衡吸附量(約60.3 mg·g-1)為非印跡聚合物納米粒子最大平衡吸附量(約26.8 mg·g-1)的2.26倍，是結(jié)構(gòu)類似物的對(duì)苯二酚的2倍，說明兒茶酚印跡的聚合物納米粒子對(duì)兒茶酚有較好的識(shí)別能力，這是因?yàn)橹苽鋬翰璺佑≯E聚合物納米粒子表面殼層中形成了與兒茶酚分子形狀相匹配、大小合適和能相互作用的功能基團(tuán)及空間骨架結(jié)構(gòu)，從而使兒茶酚分子能夠很好的進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)，由于納米殼層具有超薄的特點(diǎn)，使得兒茶酚目標(biāo)分子更容易擴(kuò)散到納米殼層表面的印跡位點(diǎn)，因此，兒茶酚分子印跡材料擁有高的結(jié)合量。印跡材料對(duì)對(duì)苯二酚的最大平衡吸附量約為30.5 mg·g-1，其結(jié)合量是兒茶酚結(jié)合量的0.5倍，結(jié)果證實(shí)了印跡材料具有很高的選擇性識(shí)別能力。

分別對(duì)圖4中的印跡兒茶酚的納米粒子對(duì)兒茶酚、結(jié)構(gòu)類似物對(duì)苯二酚以及非印跡納米粒子對(duì)兒茶酚實(shí)驗(yàn)熱力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到的結(jié)果如圖5和表1所示。

圖5 Langmuir(A)和Freundlich(B)模型熱力學(xué)等溫吸附擬合線：其中a和b線分別為印跡材料對(duì)兒茶酚和對(duì)苯二酚的等溫吸附擬合線；c為非印跡材料對(duì)兒茶酚的等溫吸附擬合線Fig.5 Fitting curves for thermodynamics isothermal adsorption of Langmuir and Freundlich model(A):a and b are the isothermal adsorption fitting curves of imprinted materials to catechol and hydroquinone,respectively,and c is the isothermal adsorption fitting curve of non-imprinted material to catechol

表1 熱力學(xué)等溫吸附模型擬合結(jié)果Table 1 Fitting results of thermodynamics isothermal adsorption model

從擬合結(jié)果來看，所制備的NBD-NH2-SiO2納米粒子對(duì)兒茶酚、對(duì)苯二酚的等溫吸附符合Langmuir模型，而非印跡NBD-NH2-SiO2納米粒子對(duì)兒茶酚等溫吸附也滿足Langmuir模型，并且a、b、c在Langmuir模型中的R2分別為0.988、0.997及0.993，符合程度較高，屬于單分子層吸附過程。

3 結(jié) 論

(1)利用光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)理制備出了兒茶酚印跡的NBD-NH2-SiO2納米粒子熒光探針，該熒光探針的識(shí)別位點(diǎn)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)兒茶酚產(chǎn)生特異性識(shí)別，進(jìn)入識(shí)別位點(diǎn)的兒茶酚分子，使得NBD標(biāo)記熒光基團(tuán)的熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)兒茶酚的高敏感性檢測(cè)。

(2)采用溶膠凝膠法成功的合成二氧化硅納米粒子，其作為組裝納米結(jié)構(gòu)分子印跡和熒光探針的支撐體；其次，二氧化硅納米粒子表面后功能化，使其表面具有功能單體的誘導(dǎo)目標(biāo)分析物富集作用，同時(shí)通過非共價(jià)鍵分子自組裝印跡技術(shù)合成高選擇性、高分散性的兒茶酚分子印跡聚合物納米殼層。

(3)修飾在SiO2納米粒子表面的氨基作為功能單體，兒茶酚為目標(biāo)分析物，NBD作為熒光標(biāo)記物，制備出了兼有分子識(shí)別和熒光信號(hào)輸出的NBD-NH2-SiO2納米粒子熒光探針。

(4)對(duì)制備的分子識(shí)別材料進(jìn)行了熱力學(xué)擬合，結(jié)果顯示其符合Langmuir熱力學(xué)吸附模型。