涪陵青菜頭泡菜發(fā)酵過程中的細菌多樣性分析

任亭，劉玉凌，彭玉梅，曾勝，賀云川，欒興霞，羅遠莉*

(1.重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學院，重慶 408000；2.重慶市涪陵榨菜集團股份有限公司，重慶 408000)

我國泡菜歷史悠久，屬四川泡菜最為有名，已成為西南地區(qū)餐桌上常見的配菜。由于泡菜在泡制過程中蔬菜原料一直處于常溫下，且以乳酸菌發(fā)酵為主，在較好保存蔬菜原料維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的同時也擁有大量益生菌，使其具有抑制腸道致病菌、抑菌、抗癌等多種功效[1-2]。泡菜從發(fā)酵開始到成熟是一個極為復雜的微生物發(fā)酵系統(tǒng)，其菌落結(jié)構(gòu)與發(fā)酵條件、發(fā)酵底物、制作工藝均有著較大聯(lián)系。有研究報道，泡菜食鹽濃度對乳酸菌多樣性有一定影響，低鹽濃度泡菜中乳酸菌多樣性高于高鹽泡菜[3]。朱琳等[4]發(fā)現(xiàn)蘿卜泡菜發(fā)酵過程中細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性伴隨著亞硝酸鹽濃度變化也發(fā)生演替。康建依等[5]研究表明山西地方自然發(fā)酵蔬菜在發(fā)酵前期細菌多樣性豐富，發(fā)酵中后期，細菌多樣性降低，其主要菌屬為乳桿菌屬(Lactobacillus)。

青菜頭是重慶市涪陵區(qū)特產(chǎn)蔬菜，當?shù)剞r(nóng)戶喜好用其制作泡菜。青菜頭泡菜具有脆嫩爽口、風味鮮美、營養(yǎng)豐富等特點。目前，采用高通量測序技術(shù)對青菜頭泡菜中微生物菌群結(jié)構(gòu)的研究尚未見報道。本研究以青菜頭為泡菜原料，當?shù)仃惸昱莶怂疄槟杆谱髋莶?，分析研究其發(fā)酵過程中泡菜品質(zhì)、微生物菌落的動態(tài)變化，在明確青菜頭泡菜品質(zhì)特性的同時更全面地了解青菜頭泡菜發(fā)酵過程中的微生物多樣性，為青菜頭泡菜產(chǎn)品的研發(fā)與生產(chǎn)提供了理論支撐，同時為泡菜發(fā)酵優(yōu)良菌株的分離鑒定提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

泡菜原料：鮮青菜頭、食鹽、大蒜、鮮姜、辣椒、花椒，購于重慶涪陵某菜市場。

陳年泡菜母水：重慶市涪陵區(qū)二度村某農(nóng)戶。

1.2 青菜頭泡菜的制備

青菜頭清洗瀝干水分后切塊，按青菜頭∶泡菜母水∶涼開水(鹽濃度4%)為2∶1∶4的比例入壇，再添加冰糖、姜、大蒜、辣椒、花椒，于25 ℃密封發(fā)酵。在發(fā)酵第0，1，3，5，7，9天取泡菜水進行各項指標的檢測。

1.3 微生物指標測定方法

參照GB 4789.35-2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》、GB 4789.2-2016《食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》。

1.4 理化指標測定方法

1.4.1 pH值、總酸含量的測定

pH值采用pH計測定，總酸參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》。

1.4.2 亞硝酸鹽含量的測定

參照國標GB 5009.33-2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》。

1.4.3 樣品總DNA提取、PCR擴增

采用細菌基因組DNA抽提試劑盒提取樣品總DNA，提取步驟根據(jù)說明書進行。擴增結(jié)束后，PCR 擴增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖進行凝膠電泳檢查擴增效果。

1.4.4 高通量測序分析

將樣品的PCR產(chǎn)物送至重慶博愛麥迪遜生物科技公司，在Illumina-HiSeq平臺上進行高通量測序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 青菜頭泡菜發(fā)酵過程中微生物指標測定結(jié)果

圖1 青菜頭泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)與細菌總數(shù)的變化Fig.1 Changes of lactic acid bacteria and total number of bacteria during the fermentation of Brassica juncea pickles

由圖1可知，菌落總數(shù)在發(fā)酵第0天較高，這是由于涪陵青菜頭泡菜采用陳年泡菜水為母水引子進行發(fā)酵而成，而陳年泡菜水中菌落總數(shù)和乳酸菌數(shù)較多[6]，且青菜頭本身帶有部分細菌。發(fā)酵1～5 d，乳酸菌數(shù)、菌落總數(shù)增加迅速，并在第5天達到峰值8.53，8.71 lg CFU/mL，此時乳酸菌含量達到97.93%，說明乳酸菌已快速生長繁殖成為青菜頭泡菜的優(yōu)勢菌群。也有研究表明添加泡菜老湯水能促進泡菜中的乳酸菌迅速成為優(yōu)勢菌群[7]。發(fā)酵5～9 d，乳酸菌數(shù)、菌落總數(shù)逐漸減少并趨于平穩(wěn)，在發(fā)酵后期乳酸菌產(chǎn)生大量乳酸導致乳酸菌生長受到反饋抑制。

2.2 青菜頭泡菜發(fā)酵過程中理化指標測定結(jié)果

2.2.1 pH值、總酸在青菜頭泡菜發(fā)酵過程中的變化

圖2 青菜頭泡菜發(fā)酵過程中pH值、總酸的變化Fig.2 Changes of pH values and total acids during the fermentation of Brassica juncea pickles

泡菜發(fā)酵過程中產(chǎn)出的代謝產(chǎn)物對其口感(酸度、甜度、脆度、苦味等)和風味均有重要影響，而pH值和總酸含量直接影響著泡菜微生物的生長和代謝產(chǎn)物的生成。由圖2可知，在整個發(fā)酵過程中，pH值呈先上升后降低的趨勢，相應的總酸含量呈先下降后上升的趨勢，在發(fā)酵前期(0～3 d)，pH值含量明顯升高，總酸含量迅速降低，可能是由于青菜頭泡菜按青菜頭∶泡菜母水∶涼開水為2∶1∶4的比例制作，泡菜母水中有機酸和H+含量較高，導致新制青菜頭泡菜乳酸代謝途徑因泡菜母水乳酸的積累產(chǎn)生反饋抑制作用，使總酸含量呈現(xiàn)一定的下降趨勢[8]，發(fā)酵中后期(3～9 d)，青菜頭泡菜的pH值迅速降低，總酸含量迅速上升，此時乳酸菌已大量繁殖成為優(yōu)勢菌群，產(chǎn)酸，與圖1乳酸菌數(shù)的變化一致。

2.2.2 亞硝酸鹽含量在青菜頭泡菜發(fā)酵過程中的變化

圖3 青菜頭泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.3 Changes of nitrite during the fermentation of Brassica juncea pickles

青菜頭泡菜在整個發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量整體較低，在0.19～0.27 mg/kg之間。在發(fā)酵初期(0～1 d)，亞硝酸鹽含量迅速增加，在發(fā)酵第1天達到峰值，由于青菜頭表面攜帶大量微生物通過硝酸還原酶將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽而形成“亞硝峰”。而隨著發(fā)酵的進行，在發(fā)酵1～9 d，泡菜中乳酸菌數(shù)迅速增加，亞硝酸鹽含量迅速降低，有研究表明乳酸菌中含有亞硝酸還原酶能分解亞硝酸鹽[9]，康建依等研究表明乳酸菌數(shù)與亞硝酸鹽含量呈此消彼長得趨勢。

2.2.3 樣品細菌稀釋曲線

通過對傳統(tǒng)青菜頭泡菜不同發(fā)酵時期(0，1，3，5，7 d)的泡菜鹽水進行細菌16S rDNA基因V3～V4區(qū)測序，5個樣品產(chǎn)生1，106，326條高質(zhì)量序列(重復5次)，統(tǒng)計所有樣品優(yōu)質(zhì)序列長度平均約為450 bp。由圖4可知，隨著測序量的增加，細菌稀釋曲線(Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù))接近平臺期達到飽和，表明測序數(shù)據(jù)足以代表整個種群。

圖4 樣品的細菌稀釋曲線Fig.4 The bacterial dilution curves of samples

2.2.4 樣品的信息以及微生物多樣性

各樣品Alpha多樣性指數(shù)值統(tǒng)計見表1。

表1 樣品的信息以及微生物多樣性Table 1 The samples＇ information and microbial diversity

由表1可知，ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)在發(fā)酵第1天時最大，細菌種類數(shù)最高，說明陳年泡菜水能快速啟動泡菜發(fā)酵系統(tǒng)；Shannon指數(shù)的變化與Simpson指數(shù)的變化呈負相關(guān)，Shannon指數(shù)隨著發(fā)酵的進行呈先下降再升高的趨勢，在發(fā)酵第0天Shannon指數(shù)最大，說明物種多樣性在發(fā)酵初期第0天最大，隨著發(fā)酵的進行，細菌多樣性下降，到發(fā)酵后期又有一定上升，這可能是由于第0天加入的新鮮青菜頭上附著大量的細菌，而隨著發(fā)酵的進行，泡菜逐漸成熟，乳酸菌迅速繁殖成為優(yōu)勢菌群，抑制了其他雜菌的成長[10]。

2.2.5 樣品細菌菌群結(jié)構(gòu)分析

圖5 青菜頭泡菜發(fā)酵過程中屬水平菌落結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Analysis of bacterial colony structure of Brassica juncea pickles at genus levelin the fermentation process

由圖5可知，在屬水平上的細菌屬主要有片球菌屬(Pediococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、腸桿菌屬(Enterobacter)和歐文氏菌屬(Erwinia)，其中，片球菌是其優(yōu)勢菌屬，李恒等[11]通過對傳統(tǒng)泡菜中微生物群落的動態(tài)變化研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬是泡菜母水中的主要細菌屬，于文平等[12]研究表明，消化乳桿菌和植物乳桿菌為青菜泡菜發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群，汪冬冬等[13]通過對二輪鹽漬工業(yè)泡菜微生物群落結(jié)構(gòu)解析研究表明豇豆、蘿卜和榨菜的主要優(yōu)勢細菌為芽孢桿菌屬，均與本研究結(jié)果不同，可能是由于地域、泡菜原料、輔料及加工工藝等存在差異。通過比較發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵前期(0～1 d)，片球菌屬含量從65.13%迅速增加至83.35%，明串珠菌屬含量從0.67%增加至0.72%；在發(fā)酵中后期(3～7 d)，片球菌含量基本不變，明串珠菌含量從0.69%迅速降低至0.03%，由此可推測片球菌與明串珠菌能快速啟動發(fā)酵，在發(fā)酵初期發(fā)揮主要作用，黃存輝等[14]也研究表明明串珠菌能快速啟動發(fā)酵。明串珠菌含量在發(fā)酵后期迅速降低，是因為其不耐酸，而泡菜水中總酸在后期含量較高。隨著發(fā)酵的進行，乳桿菌屬含量從30.49%降到8.86%，假單胞菌屬含量從0.2%降到0.02%，腸桿菌屬含量從1.2%降到0.56%，歐文氏菌屬含量從1.47%降到0.58%，然后升高到0.71%，說明乳桿菌屬在陳年泡菜母水中含量較高，而其含量隨著發(fā)酵的進行逐漸降低并趨于穩(wěn)定，發(fā)酵后期泡菜水的酸度增加，抑制了部分微生物的繁殖生長。

2.2.6 樣品細菌群落相似性分析

PCA分析見圖6，在發(fā)酵第3天細菌種類分散度最高，然后依次為第1，5，0，7天。其中，發(fā)酵第7天優(yōu)勢菌比例最高并且細菌種類分散度最低，此時總酸含量最高，pH值最低；發(fā)酵第3天優(yōu)勢菌比例最低并且細菌種類分散度最高，而此時總酸含量最低，pH值最高?？赡苁怯捎诳偹岷枯^低時，一些非優(yōu)勢菌能大量生長，從而降低了優(yōu)勢菌所占的比例，導致細菌種類分散度升高。

圖6 青菜頭泡菜發(fā)酵過程中細菌菌落相似性分析Fig.6 The similarity analysis of bacterial colony of Brassica juncea pickles in the fermentation process

2.2.7 樣品聚類分析

圖7 青菜頭泡菜發(fā)酵過程中聚類熱圖Fig.7 The cluster heat diagram of Brassica juncea pickles in the fermentation process

由圖7可知，對不同發(fā)酵時間的5個樣品在屬分類水平的物種豐度相似性進行聚類分析。通過對顏色梯度及相似程度進行分析，D0與其他樣品差距較大，D1和D3基本接近，D5和D7基本接近，說明隨著泡菜發(fā)酵的成熟，樣品之間的微生物差異性減少，物種豐度越來越相似。發(fā)酵前期D1中含量較多的假單胞菌(Pseudomonas)、腸桿菌(Enterobacter)和歐文氏菌(Erwinia)均屬于變形菌門，有研究表明，變形菌門能促使泡菜水亞硝酸鹽的生成[15]，與泡菜樣品中亞硝酸鹽含量在第1天達到峰值的結(jié)果相對應。在發(fā)酵后期，泡菜樣品的微生物多樣性相對減少，主要含有乳桿菌屬(Lactobacillus)和片球菌屬(Pediococcus)均屬于厚壁菌門。

3 結(jié)論

以陳年泡菜水為母水引子發(fā)酵青菜頭泡菜，在整個發(fā)酵過程中乳酸菌與菌落總數(shù)逐漸增加，而微生物多樣性與豐度逐漸降低，到發(fā)酵末期菌群結(jié)構(gòu)相似性較大。在屬水平上，片球菌為優(yōu)勢菌群，隨著泡菜發(fā)酵時間的推移(0～7 d)，片球菌含量從65.13%增加到88.47%，發(fā)酵前期存在假單胞菌(Pseudomonadaceae)、腸桿菌(Enterobacteriaceae)和歐文氏菌(Erwinia)等變形菌門菌群。pH值呈先上升后降低的趨勢，總酸含量呈先下降后上升的趨勢，亞硝酸鹽含量整體較低，在0.19～0.27 mg/kg之間。