基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接研究化濕行瘀清熱方治療口腔扁平苔蘚的作用機(jī)制※

鄧倩瀾 路月亭 路華林 靳睿哲 許彥枝 劉鐵軍 趙 乾

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院口腔科，河北 石家莊 050019)

口腔扁平苔蘚是一種病因不明的自身免疫性炎癥疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率在0.5%～1.5%，多見(jiàn)于中年女性患者[1]?？谇槐馄教μ\多發(fā)生于頰、舌部位，臨床表現(xiàn)以網(wǎng)狀、萎縮、糜爛型常見(jiàn)[2]?？谇槐馄教μ\有癌變潛能，被世界衛(wèi)生組織(WHO)定義為“癌前狀態(tài)”，惡性轉(zhuǎn)化率為0.5%～2%[3]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要采取西藥、手術(shù)、物理治療方式控制該病進(jìn)展，但部分患者療效不甚理想。中醫(yī)藥在口腔扁平苔蘚的預(yù)防治療中發(fā)揮了重要作用。中醫(yī)學(xué)將口腔扁平苔蘚歸為口瘡、口糜范疇，為熱毒與濕積聚、氣血失和、濕熱循經(jīng)上逆熏蒸于口舌所致，以化濕醒脾、清熱降火、活血化瘀為原則，形成了化濕行瘀清熱方，在長(zhǎng)期臨床治療中取得了較好療效[4]?；瘽裥叙銮鍩岱接牲S柏、佩蘭、砂仁、薏苡仁、茯苓、赤芍、紅花、牡丹皮、甘草、白鮮皮、金銀花11味藥組成，然而其治療口腔扁平苔蘚的具體機(jī)制尚未闡明。

目前，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已成為一項(xiàng)成熟的技術(shù)，其基于系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)及多向藥理學(xué)方法，系統(tǒng)研究藥物靶點(diǎn)與疾病基因之間復(fù)雜多樣的關(guān)系，從整體角度闡明各種藥物有效成分的藥理作用機(jī)制[5]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，預(yù)測(cè)化濕行瘀清熱方治療口腔扁平苔蘚的有效活性成分、潛在靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路，探究其治療作用機(jī)制，并且通過(guò)分子對(duì)接對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.1 化濕行瘀清熱方的活性成分及其作用靶點(diǎn)挖掘 使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)[6](http://tcmspw.com/tcmsp.php) 和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)[7](http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)獲得化濕行瘀清熱方劑中各組分的有效成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，藥物相似度(drug likeness，DL)≥0.18為條件，篩選有效成分對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)。TCMSP是一個(gè)系統(tǒng)的藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)，整合了藥物的化學(xué)成分和靶點(diǎn)、相關(guān)疾病的靶點(diǎn)及相互作用網(wǎng)絡(luò)，有利于分析中藥的作用機(jī)制。BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)是一種中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具，該數(shù)據(jù)庫(kù)基于中藥成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和后續(xù)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。OB用于描述藥物的劑量進(jìn)入人體循環(huán)的比例；DL指化合物與已知藥物的相似性。使用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org/)和PERL編程語(yǔ)言(https://www.perl.org/，版本：5.30.1)獲得藥物有效成分靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因符號(hào)。

1.2 口腔扁平苔蘚相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genecards.org)中，輸入關(guān)鍵詞“口腔扁平苔蘚”，獲得疾病靶點(diǎn)。

1.3 藥物-疾病共同靶標(biāo)篩選 將化濕行瘀清熱方有效成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的基因符號(hào)及疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入到Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在線工具，得到藥物和疾病的共同靶點(diǎn)，交集部分認(rèn)為是化濕行瘀清熱方治療口腔扁平苔蘚的關(guān)鍵靶點(diǎn)(藥效靶點(diǎn))。

1.4 藥物-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 使用PERL編程語(yǔ)言(https://www.perl.org/ver.5.30.1)，篩選得到藥效靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的藥物活性成分。將藥效靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)的藥物活性成分共同導(dǎo)入Cytoscape軟件(http://cytoscape.org/，版本：3.7.2)，構(gòu)建化濕行瘀清熱方活性成分與靶點(diǎn)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.5 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI) 將藥物-疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)構(gòu)建PPI，限定物種為“人”，結(jié)果以TSV文件格式保存。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)相互作用圖，并使用“Network Analyzer”功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，得到核心靶點(diǎn)。使用6個(gè)參數(shù)來(lái)評(píng)估蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)湫再|(zhì)：自由度(Degree，DC)，介度(Betweenness Centrality，BC)，中心性(Closeness Centrality，CC)，特征向量中心(Eigenvector Centrality，EC)，基于局部平均連接的方法中心性(Local Average Connectivity-based method Centrality，LAC)和網(wǎng)絡(luò)中心(Network Centrality，NC)。首先選擇蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中6個(gè)參數(shù)值均大于中值的節(jié)點(diǎn)構(gòu)建子網(wǎng)絡(luò)；生成的子網(wǎng)絡(luò)再通過(guò)“6個(gè)參數(shù)值均大于或等于中值”這一條件再次進(jìn)行篩選，并構(gòu)建核心蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.6 基因本體論(GO)和京都基因和基因組百科全書(shū)(KEGG)富集分析 利用R軟件中Bioconductor 安裝包(http://www.bioconductor.org)的功能對(duì)藥物-疾病共同靶點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)行GO基因功能富集分析和KEGG通路分析。篩選條件為P<0.05，Q<0.05，以便進(jìn)一步分析。

1.7 分子對(duì)接 分子對(duì)接是一種評(píng)價(jià)藥物活性成分與藥物靶點(diǎn)結(jié)合能力的方法。從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載靶點(diǎn)位于前4位的藥物有效成分2D結(jié)構(gòu)，并通過(guò)ChemOffice軟件將2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu)。在PDB(http://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載核心蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的蛋白三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)PyMol軟件，將蛋白中的水分子和小分子配體刪除。利用AutoDock1.5.6軟件將藥物有效成分和核心蛋白的PDB格式轉(zhuǎn)換為PDBQT格式，并尋找活性口袋。最后運(yùn)行Vina進(jìn)行分子對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 化濕行瘀清熱方有效成分及潛在靶點(diǎn) 根據(jù)OB和DL (OB≥30%，DL≥0.18)的篩選條件，從化濕行瘀清熱方中共獲得169個(gè)不重復(fù)有效成分及260個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，其中有效成分白鮮皮18個(gè)，赤芍29個(gè)，茯苓15個(gè)，甘草92個(gè)，紅花22個(gè)，黃柏37個(gè)，金銀花23個(gè)，牡丹皮11個(gè)，佩蘭11個(gè)，砂仁10個(gè)，薏苡仁9個(gè)，見(jiàn)圖1。由于每種中藥組分中含有效成分有重復(fù)部位，我們繪制韋恩圖對(duì)每種組分中所含有效成分進(jìn)行歸納，見(jiàn)圖2，在化濕行瘀清熱方中各組分分布范圍較廣的有效成分是豆甾醇、谷固醇、槲皮素、谷甾醇、木樨草素、山奈酚。圖2中左側(cè)柱狀圖代表化濕行瘀清熱方各藥物組分及所包含活性成分?jǐn)?shù)目，上方柱狀圖代表藥物共有的活性成分?jǐn)?shù)量，中間黑色圓點(diǎn)代表含有此種活性成分的每種藥物組分。

圖1 化濕行瘀清熱方各組分所含有效成分所占比例情況

圖2 化濕行瘀清熱方各組分所含有效成分分布韋恩圖

2.2 口腔扁平苔蘚相關(guān)靶點(diǎn) 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中以“口腔扁平苔蘚”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，經(jīng)過(guò)檢索共獲得了387個(gè)疾病靶基因。

2.3 藥物-疾病共同靶基因 利用R軟件和Venny2.1.0在線工具對(duì)260個(gè)藥物靶點(diǎn)和387個(gè)疾病靶點(diǎn)取交集，兩者相交后，共獲得了58個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn)，用于后續(xù)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。

2.4 構(gòu)建并分析藥物有效成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 應(yīng)用PERL語(yǔ)言，我們共獲得了58個(gè)疾病藥物共同靶基因和對(duì)應(yīng)的136個(gè)有效成分，通過(guò)Cytoscape軟件構(gòu)建藥物有效成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)共有194個(gè)節(jié)點(diǎn)，497條邊，見(jiàn)圖3，中心矩形代表藥物的活性成分，外圍矩形代表藥物治療疾病的靶點(diǎn)。白色矩形代表白鮮皮的有效成分，棕色代表赤芍，橙色代表茯苓，綠色代表甘草，紅色代表紅花，粉色代表黃柏，黃色代表金銀花，深藍(lán)色代表佩蘭，灰色代表薏苡仁，淡粉色代表化濕行瘀清熱方劑中2種或2種以上成分的共同成分。對(duì)靶點(diǎn)不低于5的有效成分信息進(jìn)行整理，見(jiàn)表1?；瘽裥叙銮鍩岱街邪悬c(diǎn)最多的化合物為槲皮素(MOL000098)，其他依次為：木犀草素(MOL000006)、漢黃芩素(MOL000173)、山奈酚(MOL000422)等。槲皮素中有49個(gè)靶點(diǎn)，木犀草素中有29個(gè)靶點(diǎn)，漢黃芩素中有17個(gè)靶點(diǎn)，山奈酚中有16個(gè)靶點(diǎn)，表明它們?cè)谥委熆谇槐馄教μ\中發(fā)揮更大的作用，可能是關(guān)鍵的有效活性成分。

圖3 活性化合物和疾病共同靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)

表1 化濕行瘀清熱方中有效成分信息

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI) 原始PPI (圖4A)通過(guò)DC、BC、CC、EC、LAC和NC的值進(jìn)行2次篩選，最終得到核心蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。核心PPI由14個(gè)節(jié)點(diǎn)和168條邊組成，如圖4C所示。根據(jù)PPI的拓?fù)浞治鼋Y(jié)果，圖4A網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)連接度的中位數(shù)為31，介度的中位數(shù)為16.741，緊密度的中位數(shù)為 0.683，特征向量中心為0.135，基于局部平均連接的方法中心性為24.151，網(wǎng)絡(luò)中心為26.057，6個(gè)參數(shù)均超過(guò)中位數(shù)的靶點(diǎn)有25個(gè)，見(jiàn)圖4B。圖4B網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)連接度的中位數(shù)為31，介度的中位數(shù)為24，緊密度的中位數(shù)為 1，特征向量中心為0.207，基于局部平均連接的方法中心性為22，網(wǎng)絡(luò)中心為24，6個(gè)參數(shù)均超過(guò)中位數(shù)的靶點(diǎn)有14個(gè)，如圖4C所示，推測(cè)這些靶點(diǎn)可能是化濕行瘀清熱方治療口腔扁平苔蘚的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖4 核心PPI的構(gòu)建過(guò)程

2.6 GO和KEGG富集分析 以P<0.05和Q<0.05為篩選條件，對(duì)這58個(gè)共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO富集分析，這些基因包括BP、CC和MF，最后我們得到了2169個(gè)GO項(xiàng)目。結(jié)果(圖5)顯示，化濕行瘀清熱方通過(guò)調(diào)節(jié)多種生物過(guò)程(BP)發(fā)揮重要作用。主要5種是細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)(GO： 0062197)，對(duì)金屬離子的反應(yīng)(GO：0010038)，對(duì)脂多糖的反應(yīng)(GO：0032496)，對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)(GO：0002237)，對(duì)輻射的反應(yīng)(GO：0009314)。前五大細(xì)胞成分(CC)項(xiàng)(P<0.05)為：膜筏(GO：0045121)，膜微區(qū)(GO：0098857)，膜區(qū)(GO：0098589)，細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物(GO：0000307)，質(zhì)膜外側(cè)(GO：0009897)。而主要的5個(gè)分子功能(MF)項(xiàng)(P<0.05)為：細(xì)胞因子受體結(jié)合(GO：0005126)，細(xì)胞因子活性(GO：0005125)，受體配體活性(GO：0048018)，信號(hào)受體激活劑活性(GO：0030546)，蛋白磷酸酶結(jié)合(GO：0019903)。通過(guò)運(yùn)行R語(yǔ)言，對(duì)58個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，共獲得131條KEGG通路。KEGG途徑富集分析基于P< 0.05，結(jié)果(圖6)顯示排名前30的信號(hào)通路。根據(jù)P值大小、富集靶基因多少和治療口腔扁平苔蘚的相關(guān)性，認(rèn)為重要的信號(hào)通路包括IL-17信號(hào)通路(hsa04657)和腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路(hsa04668)。為分析化濕行瘀清熱方治療靶點(diǎn)在白細(xì)胞介素17(IL-17)信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路的作用，利用R語(yǔ)言，得到IL-17信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路的模式圖，見(jiàn)圖7、8。

圖5 58個(gè)藥物疾病共同基因的GO富集分析

圖6 58個(gè)藥物疾病共同基因的KEGG富集途徑

圖7 IL-17信號(hào)通路

2.7 分子對(duì)接結(jié)果 為進(jìn)一步驗(yàn)證化濕行瘀清熱方治療口腔扁平苔蘚的的分子機(jī)制，從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中提取化濕行瘀清熱方的關(guān)鍵有效成分作為配體，從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載PPI核心網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)作為受體，使用AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接。一般認(rèn)為配體和受體結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定，結(jié)合能越低，作用的可能性越大，以小于或等于-5.0 kcal/mol的結(jié)合能作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。分子對(duì)接結(jié)果(表2)顯示，化濕行瘀清熱方的關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol，表明化濕行瘀清熱方劑的關(guān)鍵活性成分與口腔扁平苔蘚治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合活性。其中山奈酚與核心靶蛋白結(jié)合情況最佳，蛋白激酶B1(Akt1)是化濕行瘀清熱方中關(guān)鍵化學(xué)成分結(jié)合活性最優(yōu)的靶蛋白。結(jié)合能最高的前4組對(duì)接情況如圖9所示，藍(lán)色代表藥物有效成分；綠色代表藥物活性成分靶點(diǎn)；黃色虛線代表藥物活性成分與靶點(diǎn)形成的氫鍵作用，其中Akt1通過(guò)氨基酸殘基ASP-274、VAL-271和ASN-204與山奈酚形成氫鍵作用；基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)通過(guò)氨基酸殘基ALA-189與槲皮素形成氫鍵作用，通過(guò)氨基酸殘基LEU-188與木犀草素形成氫鍵作用；TNF通過(guò)氨基酸殘基ILE-58與槲皮素形成氫鍵作用。

圖8 TNF信號(hào)通路

3 討論

目前，口腔扁平苔蘚的病因尚不清楚，大多數(shù)研究認(rèn)為口腔扁平苔蘚是自身細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。中醫(yī)學(xué)將口腔扁平苔蘚歸為口瘡、口糜范疇，主要分為濕熱蘊(yùn)結(jié)型、氣滯血瘀型、氣陰兩虛型和肝腎陰虛型，濕熱蘊(yùn)結(jié)型和氣陰兩虛型較常見(jiàn)[8]?；瘽裥叙銮鍩岱揭曰瘽裥哑?、活血化瘀、清熱降火為原則，主要由黃柏、赤芍、佩蘭、甘草等11味中藥組成。方中黃柏、砂仁清熱燥濕，健脾化濕；佩蘭、茯苓、薏苡仁健脾利濕；赤芍、紅花、牡丹皮行氣活血化瘀；白鮮皮、金銀花清熱燥濕；甘草加強(qiáng)清熱益水之功。

現(xiàn)代藥理研究表明，赤芍可降低血管通透性，改善微循環(huán)，促進(jìn)免疫功能，有利于黏膜上皮修復(fù)[9]；黃柏可抗炎抑菌，促進(jìn)組織愈合[10]；佩蘭有抗炎、抗病原微生物作用[10]；甘草可保護(hù)、修復(fù)黏膜[4]。前期研究顯示，化濕行瘀清熱方具有調(diào)節(jié)免疫、炎性反應(yīng)，改善患者臨床癥狀作用[4，8-12]。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，從化濕行瘀清熱方的11味中藥中提取了136種有效成分和對(duì)應(yīng)的58個(gè)疾病靶點(diǎn)，并通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證。根據(jù)分析，每種有效活性成分作用于至少一個(gè)靶基因，每個(gè)基因至少受一種活性成分的調(diào)控，表明化濕行瘀清熱方通過(guò)多組分、多靶點(diǎn)的方式作用于口腔扁平苔蘚。靶點(diǎn)數(shù)量最多的化濕行瘀清熱方活性成分為槲皮素(MOL000098)、木犀草素(MOL000006)、漢黃芩素(MOL000173)和山奈酚(MOL000422)，它們可能是化濕行瘀清熱方治療口腔扁平苔蘚的關(guān)鍵活性成分。槲皮素具有抗炎、抗病毒及鎮(zhèn)痛作用，用于各種炎癥[10-11]。槲皮素可抑制MMP-9產(chǎn)生，并通過(guò)阻斷核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號(hào)通路，減少白細(xì)胞介素6(IL-6)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)等炎癥因子和趨化因子的產(chǎn)生[13]，還可減輕脂多糖誘導(dǎo)的人口腔角質(zhì)形成細(xì)胞損傷[14]。木犀草素是一種天然類黃酮，具有很強(qiáng)的抗氧化和抗炎作用[15]。研究顯示木犀草素可能通過(guò)抑制NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)/IL-1β信號(hào)通路，減輕牙周組織炎性反應(yīng)、促進(jìn)牙槽骨改建[16]；木犀草素明顯抑制人舌鱗癌細(xì)胞增殖，并且可通過(guò)抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)抑制人舌鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移[17]，此外它可預(yù)防非酒精性脂肪性肝炎[18]，抑制骨關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)炎進(jìn)展[19-20]。漢黃芩素具有多種藥理作用，包括抗炎、抑制腸道炎性反應(yīng)和維持屏障功能。通過(guò)抗炎和抗氧化特性，漢黃芩素可減輕高血糖相關(guān)的心肌細(xì)胞損傷[21]。山奈酚屬于黃酮類苷元，具有較強(qiáng)的抗炎作用[22]，可降低牛皮癬皮膚損害中促炎性因子表達(dá)，包括IL-6、IL-17A 和腫瘤壞死因子α(TNF-α)[23]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)化濕行瘀清熱方治療口腔扁平苔蘚的關(guān)鍵活性化合物進(jìn)行預(yù)測(cè)，部分已在文獻(xiàn)中報(bào)道，另外一些作用機(jī)制研究仍需進(jìn)一步體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

表2 中藥關(guān)鍵有效成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能

圖9 山奈酚與Akt1(A)、槲皮素與MMP-9 (B)、木犀草素與MMP-9 (C)、槲皮素與TNF的分子對(duì)接模式圖

我們研究核心PPI發(fā)現(xiàn)，化濕行瘀清熱方的活性成分治療口腔扁平苔蘚的主要靶蛋白為Akt1、VEGFA、TNF、ICAM-1、MMP-9、CASP-3、MMP-2、EGF、EGFR、JUN、IL-4、CXCL-8、TP53、PTGS-2。口腔扁平苔蘚是一種慢性炎癥疾病。蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(Akt/mTOR)介導(dǎo)自噬反應(yīng)可調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的免疫功能[24]，此外，Akt/mTOR信號(hào)通路失調(diào)，影響正常的T淋巴細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞功能，以及使細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)失衡，影響口腔扁平苔蘚的發(fā)展[25]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)經(jīng)基因芯片檢測(cè)，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Reverse Transcription-Rolymerase Chain Reaction，RT-PCR)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在口腔扁平苔蘚患者中表達(dá)增高[26]，并具有很強(qiáng)的促進(jìn)血管生成作用，進(jìn)而介導(dǎo)口腔扁平苔蘚慢性炎癥的進(jìn)展。TNF是炎性反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其促炎作用可通過(guò)改變白細(xì)胞黏附分子、促炎因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)來(lái)體現(xiàn)[27-28]。細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)不僅促進(jìn)免疫和炎性反應(yīng)，還可促進(jìn)白細(xì)胞游離出血管[29]，免疫組化結(jié)果顯示，與正常皮膚相比，口腔扁平苔蘚患者TNF和ICAM-1的陽(yáng)性表達(dá)率較高，且二者之間存在顯著相關(guān)性[30]，受炎性介質(zhì)TNF誘導(dǎo)，MMP-9、VEGF、ICAM-1表達(dá)增加，導(dǎo)致基底細(xì)胞液化變性，口腔扁平苔蘚血管生成，以及淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)到特定部位[30-31]。高表達(dá)的MMP-9和胱天蛋白酶3(CASP-3)可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡[32]，MMP-9和MMP-2與口腔扁平苔蘚的發(fā)生及癌變有關(guān)[33]。表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子/表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(EGF/EGFR)影響細(xì)胞的增殖、分化和遷移[34]，糜爛型口腔扁平苔蘚中EGFR表達(dá)較網(wǎng)狀型及正常組織明顯增高，EGF/EGFR信號(hào)通路可能參與糜爛型口腔扁平苔蘚的癌變[35]。JUN屬于轉(zhuǎn)錄激活因子-1(AP-1)轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，調(diào)節(jié)炎性過(guò)程以及細(xì)胞的增殖分化[36]，JUN與EGFR均是影響口腔扁平苔蘚發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子[37]，此外它們可能參與糜爛型口腔扁平苔蘚的癌變過(guò)程[35]。IL-4表達(dá)水平可作為反映口腔扁平苔蘚嚴(yán)重程度的標(biāo)志物[38]，IL-25通過(guò)增強(qiáng)IL-4和趨化因子CXCL-8表達(dá)可促進(jìn)輔助型T淋巴細(xì)胞2(Th2)在口腔扁平苔蘚疾病中的免疫反應(yīng)[39]。前期臨床試驗(yàn)表明，化濕行瘀清熱方能明顯降低患者唾液、血液中ICAM-1、MMP-9表達(dá)，改善患者臨床癥狀[9，40]。

為深入研究化濕行瘀清熱方治療口腔扁平苔蘚的作用機(jī)制，我們使用R語(yǔ)言對(duì)藥物-疾病共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO分析結(jié)果表明化濕行瘀清熱方治療口腔扁平苔蘚涉及的生物學(xué)過(guò)程主要是對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)，對(duì)脂多糖的反應(yīng)及細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性等分子生物學(xué)過(guò)程。KEGG富集分析結(jié)果表明，藥物-疾病共同靶點(diǎn)主要富集在炎癥免疫、病毒感染以及腫瘤相關(guān)通路，其中IL-17信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路是化濕行瘀清熱方參與治療口腔扁平苔蘚的關(guān)鍵通路。前期使用基因芯片技術(shù)篩選出與口腔扁平苔蘚發(fā)病相關(guān)的8條通路，其中感染類疾病相關(guān)通路在口腔扁平苔蘚的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，這與此次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果一致[41]。IL-17由輔助性T淋巴細(xì)胞17(Th17)細(xì)胞分泌，并被證實(shí)參與炎癥、自身免疫等過(guò)程[42]，IL-17可誘導(dǎo)角化細(xì)胞釋放趨化因子配體20(CCL20)，促進(jìn)炎性細(xì)胞向扁平苔蘚病損的遷徙和浸潤(rùn)[43]，IL-23/IL-17通路的激活與MMP-9的高表達(dá)相關(guān)，并且參與了扁平苔蘚的發(fā)病[44]。在口腔扁平苔蘚中，NF-κB信號(hào)通路的激活，可促進(jìn)TNF-α及IL-1β的高表達(dá)，口腔扁平苔蘚患者唾液中，NF-κB依賴因子TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8的高表達(dá)可用于診斷與治療口腔扁平苔蘚[45-46]。此外，復(fù)方甘草酸苷及養(yǎng)陰益氣、理氣活血中藥治療口腔扁平苔蘚、降低TNF表達(dá)已得到研究[47-50]。由此可見(jiàn)，化濕行瘀清熱方可能通過(guò)IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等發(fā)揮抗炎、抗感染作用，治療口腔扁平苔蘚。

分子對(duì)接結(jié)果表明，中藥關(guān)鍵有效成分槲皮素、木犀草素、漢黃芩素和山奈酚與Akt1、MMP-9和TNF等核心靶點(diǎn)結(jié)合親和力較強(qiáng)，說(shuō)明化濕行瘀清熱方可與受體蛋白穩(wěn)定結(jié)合并發(fā)揮作用，作用機(jī)制多樣活躍，具有潛在的研究?jī)r(jià)值。

口腔扁平苔蘚是一種病因不明的免疫性炎癥性黏膜疾病，可能由多種基因和因素引起，中醫(yī)治療強(qiáng)調(diào)各種中草藥的組合，通過(guò)多方面、多角度的整體治療，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析化濕行瘀清熱方治療口腔扁平苔蘚恰好證實(shí)這一點(diǎn)，然而中藥方劑成分復(fù)雜，需進(jìn)一步研究來(lái)支持本研究結(jié)果。

化濕行瘀清熱方治療口腔扁平苔蘚在臨床中取得了較好的療效，本研究通過(guò)中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，構(gòu)建了藥物疾病網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)了化濕行瘀清熱方劑的主要活性成分和靶點(diǎn)并分析該藥物的作用機(jī)制，通過(guò)分子對(duì)接對(duì)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，與前期研究及文獻(xiàn)報(bào)道治療口腔扁平苔蘚的機(jī)制一致。這表明化濕行瘀清熱方通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)治療口腔扁平苔蘚，作用機(jī)制可能與IL-17信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路相關(guān)。