木瓜蛋白酶輔助提取丹皮中多酚、總黃酮的響應(yīng)面優(yōu)化及抗氧化活性研究

馬 曉,陳 剛

(1.河南職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河南 鄭州450046;2.鄭州師范學(xué)院,河南 鄭州450044)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)是毛茛科芍藥屬落葉灌木,是原產(chǎn)自中國(guó)的名貴木本花卉[1]。丹皮是牡丹干燥的根皮,味道微苦、辛,微寒,據(jù)《本草綱目》記載有涼血清熱、活血化瘀的效用[2]。植物多酚是植物體內(nèi)廣泛存在的一種芳香族羥基衍生物的總稱,已知的酚類物質(zhì)已有8 000種以上[3]。20世紀(jì)中期以后,植物多酚抗氧化、清除自由基等功效被逐步發(fā)現(xiàn),相關(guān)研究日益增多[4-5],在醫(yī)學(xué)上表現(xiàn)出抑菌、鎮(zhèn)痛、抗過敏、提高機(jī)體免疫功能等多種功效。純天然的黃酮類物質(zhì)具有一定的抗氧化活性[6-7],還具有抗腫瘤[8]、增強(qiáng)免疫力[9]等功效,可用來研發(fā)黃酮類保健飲料、黃酮類速食保健品等,同時(shí)黃酮類物質(zhì)的抗輻射功能也在化妝品的研發(fā)上越來越受到重視。DPPH自由基(DPPH·)是一類具有單電子穩(wěn)定性的、以氮為中心的順磁化合物,當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí),DPPH·接受一個(gè)電子或氫原子形成穩(wěn)定的DPPH-H化合物[10],DPPH·清除率為考察物質(zhì)抗氧化性的常用指標(biāo)。各類自由基在生物體內(nèi)具有一定的生物活性,但是過量的自由基會(huì)對(duì)體內(nèi)代謝產(chǎn)生破壞作用,導(dǎo)致正常細(xì)胞和組織損壞,引發(fā)心血管疾病、帕金森癥、人體衰老等[11-12]。響應(yīng)面分析法是一種采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值函數(shù)關(guān)系的優(yōu)化方法[13],具有精密度高、預(yù)測(cè)性好、便于觀察等優(yōu)點(diǎn)[14]。本研究以丹皮為原料,以木瓜蛋白酶酶解輔助提取丹皮中的多酚和總黃酮,并采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化多酚、總黃酮得率以及DPPH自由基清除率,預(yù)測(cè)3個(gè)指標(biāo)分別達(dá)到最優(yōu)時(shí)的試驗(yàn)因素水平以及3個(gè)指標(biāo)同時(shí)達(dá)到較優(yōu)時(shí)的試驗(yàn)因素水平,獲得多元二次回歸方程,以期為丹皮的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取七年生植株的新鮮、無病蟲害、無霉變的“鳳丹”丹皮為試驗(yàn)材料,于65℃烘至質(zhì)量恒定,粉碎后過孔徑150μm篩,取篩下物貯于棕色廣口瓶封口保存?zhèn)溆?。木瓜蛋白?寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司,10 000 U/g;福林試劑、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、無水乙醇、亞硝酸鈉、無水碳酸鈉、氫化氧鈉、硝酸鋁等,均為市售分析純。

1.2 提取液制備與響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱取1.00 g丹皮粉末于燒杯中,按表1中的實(shí)驗(yàn)方案添加不同Na2HPO4-檸檬酸緩沖液體積與丹皮粉末質(zhì)量的比(液料比,mL∶g)、不同pH值、不同木瓜蛋白酶添加量(以丹皮粉末質(zhì)量計(jì))的提取液,攪拌均勻后置于45℃水浴鍋內(nèi)酶解相應(yīng)時(shí)間,期間不斷攪拌,提取結(jié)束后,以三層濾紙過濾后得到提取液用于后續(xù)測(cè)定。

選取酶添加量(X1)、液料比(X2)、pH值(X3)和酶解時(shí)間(X4)為影響因素,設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn),共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn),其中零水平重復(fù)5次,設(shè)為5個(gè)中心點(diǎn),用以估計(jì)試驗(yàn)誤差,其余24個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)為析因點(diǎn),分別分析4個(gè)影響因素對(duì)多酚得率(Y1)、總黃酮得率(Y2)和DPPH自由基清除率(Y3)的影響。

1.3 分析方法

1.3.1多酚得率的測(cè)定參考蔡慶生[15]的方法,配制質(zhì)量濃度為0.05 g/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液于試管,分別加入蒸餾水6、5.8、5.6、5.4、5.2、5.0 mL,加入福林試劑1 mL,最后加入3 mL 7.5%的碳酸鈉溶液,充分搖勻后靜置反應(yīng)2 h。在765 nm處測(cè)定吸光度,并計(jì)算得線性回歸方程:y=0.014 8x-0.018 6,R2=0.997 9,其中y為吸光度,x為沒食子酸質(zhì)量濃度(mg/L),試驗(yàn)結(jié)果顯示沒食子酸質(zhì)量濃度在10～50 mg/L之間與吸光度有良好的線性關(guān)系。吸取1 mL丹皮提取液(如濃度過大,應(yīng)適當(dāng)稀釋)于試管中,分別加入福林試劑和碳酸鈉溶液反應(yīng),并測(cè)定765 nm處吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算該反應(yīng)體系中多酚(以沒食子酸表示)的質(zhì)量并根據(jù)式(1)計(jì)算多酚得率,重復(fù)3次,取平均值。

式中:Y1—多酚得率,mg/g;C—根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的反應(yīng)體系中多酚的質(zhì)量濃度,mg/L;N—提取液稀釋倍數(shù);V—多酚提取液總體積,mL;m0—所取丹皮的質(zhì)量,g。

1.3.2總黃酮得率的測(cè)定參考徐曌[16]的方法,精確配制質(zhì)量濃度為0.2 g/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確量取0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL容量瓶中,各加體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液至10 mL,分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL,混合均勻,室溫下靜置5 min;再各加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL,混合均勻,室溫下靜置6 min;再分別加入4%氫氧化鈉溶液5 mL,混合均勻,用70%乙醇定容至25 mL,室溫下靜置15 min,以第一瓶反應(yīng)液作為空白對(duì)照,于510 nm處測(cè)其吸光度,將所得結(jié)果作標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得回歸方程為:y=11.479x-0.005 6,R2=0.999 3,x為蘆丁質(zhì)量濃度(g/L),y為吸光度。吸取1 mL的丹皮提取液(如濃度過大,應(yīng)適當(dāng)稀釋)于25 mL容量瓶中,按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的操作方法測(cè)定吸光度值,計(jì)算出總黃酮(以蘆丁表示)的質(zhì)量濃度,并根據(jù)式(2)計(jì)算總黃酮得率,重復(fù)3次,取平均值。

式中:Y2—總黃酮得率,mg/g;C'—總黃酮質(zhì)量濃度,g/L。

1.3.3DPPH自由基清除率的測(cè)定 參考孫麗萍等[17]的方法。精確稱取0.019 7 g的DPPH粉末,用無水乙醇溶解定容至250 mL,配制成0.2 mmol/L的DPPH儲(chǔ)備液,0℃下保存。取酶解后的丹皮提取液0.5 mL,加入2.5 mL的DPPH儲(chǔ)備液,在28℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min;同時(shí)以無水乙醇代替丹皮提取液作為空白對(duì)照,于517 nm測(cè)定樣品溶液及空白對(duì)照的吸光度值,按式(3)計(jì)算DPPH自由基(DPPH·)清除率,重復(fù)3次,取平均值。

式中:Y3—DPPH·清除率,%;A空白—無水乙醇代替樣品溶液所得吸光度;A樣品—樣品溶液的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次試驗(yàn)的平均值,用Microsoft Excel 2010整理,用Design-Expert 7.0進(jìn)行回歸分析與顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Design and results of response surface experiment

續(xù)表1

2.2 多酚得率的響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1模型建立與方差分析據(jù)表1中多酚得率的試驗(yàn)結(jié)果,建立關(guān)于4個(gè)影響因素X1、X2、X3、X4與多酚得率(Y1)之間的多元二次回歸模型,得到方程如下:

模型的回歸決定系數(shù)(R2)為0.988 7,表明有98.87%的響應(yīng)面值符合此模型,受試驗(yàn)因素影響較大,相關(guān)性高;校正決定系數(shù)為0.977 3,說明有97.73%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)變化可用此模型作參考;精密度是有效信號(hào)與噪音的比值,大于4.0視為合理,本試驗(yàn)精密度值為27.295,方程有較好的擬合效果;變異系數(shù)為2.71%,數(shù)值較小,說明此方程具有較高的穩(wěn)定性和可靠性。

多酚得率回歸方程的方差分析結(jié)果見表2。由表2可知,失擬項(xiàng)P值為0.315 3,說明模型失擬不顯著,表明試驗(yàn)因素選擇恰當(dāng),該方程具有較高的擬合度,誤差小;該模型方程P＜0.000 1,說明該模型顯著性極好。項(xiàng)影響極顯著(P＜0.000 1),X2X3、X3X4項(xiàng)影響顯著(P＜0.05)。分析F值可知,4個(gè)影響因素對(duì)多酚得率的影響順序?yàn)橐毫媳龋久柑砑恿浚緋H值＞酶解時(shí)間。

表2 多酚得率回歸方程的方差分析Table 2 Analysisi of variance for the regression equation of polyphenol yield

續(xù)表2

2.2.2驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)通過回歸模型優(yōu)化計(jì)算得到多酚提取的最佳工藝為酶添加量418 U/g,液料比20.7∶1(mL∶g,下同),pH值5.7,酶解時(shí)間119.8 min,為操作方便,將最佳工藝調(diào)整為酶添加量400 U/g,液料比21∶1,pH值5.5,酶解時(shí)間119 min。經(jīng)過驗(yàn)證,調(diào)整工藝條件下多酚得率為28.96 mg/g,與預(yù)測(cè)的得率31.69 mg/g,比預(yù)測(cè)值低8.61%。

2.3 總黃酮得率的響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1模型建立與方差分析據(jù)表1中總黃酮得率的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果,建立關(guān)于4個(gè)影響因素X1、X2、X3、X4與總黃酮得率(Y2)之間的多元二次回歸模型,得到方程如下:

總黃酮得率回歸方程的R2為0.941 2,說明有94.12%的響應(yīng)面值符合此模型,試驗(yàn)因素影響較大,相關(guān)性高;為0.882 5,說明有88.25%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)變化可用此模型作參考;精密度值為13.033,說明方程有較好的擬合效果;變異系數(shù)為4.74%,數(shù)值較小,說明此方程具有較高的可靠性。

總黃酮得率回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。根據(jù)表3可知,失擬項(xiàng)P值較大,說明該方程失擬項(xiàng)不顯著,具有較高的擬合度,誤差小;該模型方程P＜0.000 1,說明該模型顯著性極好。X1X4項(xiàng)均表現(xiàn)出極顯著的影響(P＜0.01),X3X4項(xiàng)影響顯著(P＜0.05)。分析F值可得,4個(gè)影響因素對(duì)總黃酮得率的影響由大到小順序?yàn)橐毫媳龋久附鈺r(shí)間＞pH值＞酶添加量。

表3 總黃酮得率回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression equation of flavonoids yield

續(xù)表3

2.3.2驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)通過回歸模型優(yōu)化計(jì)算得到總黃酮得率的最佳工藝為酶添加量396 U/g,液料比19.7∶1,pH值5.9,酶解時(shí)間121.5 min。為操作方便,將最佳工藝調(diào)整為酶添加量400 U/g,液料比20∶1,pH值6.0,酶解時(shí)間121 min。經(jīng)過驗(yàn)證,調(diào)整工藝條件下總黃酮得率為44.32 mg/g,與預(yù)測(cè)的得率47.80 mg/g,比預(yù)測(cè)值低7.28%。

2.4 DPPH·清除率的響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1模型建立與方差分析據(jù)表1中DPPH·清除率的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果,建立關(guān)于4個(gè)影響因素X1、X2、X3、X4與DPPH·清除率(Y3)之間的多元二次回歸模型,得到方程如下:

DPPH·清除率回歸方程的R2為0.930 7,說明有93.07%的響應(yīng)面值符合此模型,試驗(yàn)因素影響較大,相關(guān)性高;為0.861 4,說明有86.14%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)變化可用此模型作參考;精密度值為12.285,說明方程有較好的擬合效果;變異系數(shù)為7.72%,說明此方程具有較高的合理性。

DPPH·清除率回歸方程方差分析結(jié)果見表4。根據(jù)表4可知,失擬項(xiàng)的P值較大,說明該模型具有較高的擬合度,誤差小;該模型方程P＜0.000 1,說明該模型顯著性極好。項(xiàng)均表現(xiàn)出極顯著的影響(P＜0.01),分析F值可得,4個(gè)影響因素對(duì)DPPH·清除率的影響順序由大到小為液料比＞pH值＞酶添加量＞酶解時(shí)間。

表4 DPPH自由基清除率回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance for the regression equation of DPPH radical scavenging rate

續(xù)表4

2.4.2驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)通過回歸模型優(yōu)化計(jì)算得到DPPH·清除率的最佳工藝為酶添加量404 U/g,液料比21∶1,pH值5.8,酶解時(shí)間123 min。為操作方便,將最佳工藝調(diào)整為酶添加量400 U/g,液料比21∶1,pH值6.0,酶解時(shí)間123 min。經(jīng)過驗(yàn)證,調(diào)整工藝條件下DPPH·清除率為66.87%,與預(yù)測(cè)的得率73.90%,比預(yù)測(cè)值低9.51%。

2.5 最佳組合工藝的確定及驗(yàn)證

通過回歸模型計(jì)算得到以多酚得率、總黃酮得率、DPPH·清除率同時(shí)為優(yōu)化對(duì)象的最佳工藝為酶添加量401 U/g,液料比20.7∶1,pH值5.9,酶解時(shí)間121.8 min,為操作方便,將最佳工藝調(diào)整為酶添加量400 U/g,液料比21∶1,pH值6.0,酶解時(shí)間122 min。經(jīng)過驗(yàn)證,調(diào)整工藝條件下多酚得率、總黃酮得率和DPPH·清除率分別為28.25 mg/g、42.96 mg/g和66.72%,與預(yù)測(cè)的多酚得率、總黃酮得率和DPPH·清除率30.89 mg/g、47.55 mg/g和73.84%,分別比預(yù)測(cè)值低8.54%、9.65%和9.64%。各項(xiàng)指標(biāo)的實(shí)際值與理論值的誤差均小于10%,表明用響應(yīng)面法可以有效地預(yù)測(cè)丹皮提取液多酚得率、總黃酮得率及DPPH·清除率。

為考察木瓜蛋白酶對(duì)多酚得率、總黃酮得率和DPPH·清除率的影響,在優(yōu)化的提取條件,但不加木瓜蛋白酶的情況下進(jìn)行了驗(yàn)證,該條件下多酚得率、總黃酮得率和DPPH·清除率分別為25.43 mg/g、38.16 mg/g與47.80%。可以看出,使用木瓜蛋白酶的優(yōu)化提取條件的多酚得率、總黃酮得率與DPPH·清除率分別提高了11.09%、12.58%與39.58%,表明木瓜蛋白酶對(duì)多酚、總黃酮的提取得率以及DPPH·清除率有較大的提升作用。

3 結(jié) 論

采用木瓜蛋白酶法輔助提取丹皮中的多酚和總黃酮,以多酚得率、總黃酮得率以及DPPH自由基(DPPH·)清除率為考察指標(biāo),采用響應(yīng)面法對(duì)提取條件(酶添加量、液料比、pH值和酶解時(shí)間)進(jìn)行優(yōu)化,建立多元二次回歸方程模型,通過對(duì)模型的分析,預(yù)測(cè)3個(gè)指標(biāo)分別達(dá)到最優(yōu)的最佳提取工藝以及3個(gè)指標(biāo)同時(shí)達(dá)到較優(yōu)時(shí)的提取工藝并進(jìn)行驗(yàn)證,最優(yōu)工藝為酶添加量400 U/g,液料比21∶1(mL∶g),pH值6.0,酶解時(shí)間122 min,該條件下多酚得率、總黃酮得率與DPPH·清除率分別為28.25 mg/g、42.96 mg/g與66.72%。試驗(yàn)表明,采用響應(yīng)面法建立的回歸方程模型,具有較好的擬合效果和可靠性,能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)丹皮多酚得率、總黃酮得率以及DPPH·清除率。

同時(shí)發(fā)現(xiàn),與未添加木瓜蛋白酶相比,添加木瓜蛋白酶輔助提取后的多酚得率、總黃酮得率與DPPH·清除率分別提高了11.09%、12.58%與39.58%。生產(chǎn)中可通過添加木瓜蛋白酶的方法提高多酚得率、總黃酮得率與DPPH·清除率,對(duì)提高DPPH·清除率效果明顯。