大黃素通過下調(diào)miR-1224緩解高糖誘導(dǎo)的心肌細胞損傷

余 敏,崔 躍,黎鵬飛,謝 丹,陳 芬(武漢市紅十字會醫(yī)院心血管內(nèi)科,武漢 43005;華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科;通訊作者,E-mail:54887500@qq.com)

糖尿病會引起心肌病,并增加心臟衰竭的風(fēng)險,而與高血壓和冠心病無關(guān),這被稱為“糖尿病性心肌病”[1]。該病的發(fā)病機制是多因素的,普遍認為胰島素抵抗和高血糖癥是糖尿病性心肌病主要的促發(fā)因素[2]。糖尿病性心肌病對受影響的患者產(chǎn)生不利的預(yù)后影響,目前尚無目標(biāo)療法。大黃素(1,3,8-三羥基-6-甲基-9,10-蒽二酮,C15H10O5)是從一些傳統(tǒng)中草藥(包括大黃和虎杖)中分離出來的一種蒽醌成分。據(jù)報道,大黃素通過上調(diào)高糖處理小鼠足細胞中的miR-29a-5p靶向MDM2,緩解足細胞的凋亡[3]。大黃素通過上調(diào)miR-138表達保護H9C2細胞免受缺氧損傷[4]。然而,關(guān)于大黃素在糖尿病性心肌病中的作用的研究仍然有限。多種微小RNA(microRNA,miRNA)可以介導(dǎo)大黃素的功效,例如miR-199a[5]、miR-1271[6]和miR-145[7]。miR-1224是已鑒定的miRNA,據(jù)報道,Kim等[8]通過miRNA表達譜分析發(fā)現(xiàn),miR-1224在高血清C-反應(yīng)蛋白與心肌缺血再灌注損傷的大鼠心肌中高表達。miR-1224的下調(diào)通過調(diào)節(jié)肝細胞生長因子來預(yù)防氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的急性肝損傷[9]。但尚不清楚大黃素是否通過調(diào)節(jié)miR-1224的表達并影響高糖誘導(dǎo)的心肌細胞損傷。因此,我們的研究旨在探索大黃素對高糖處理的大鼠心肌細胞H9C2凋亡和炎癥的影響,并研究大黃素調(diào)節(jié)miR-1224的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

大黃素(20 mg;含量≥96.0%;中國食品藥品檢定研究院),大鼠心肌細胞H9C2(美國典型培養(yǎng)物保藏中心),miR-1224 mimic、陰性對照miR-NC(GenePharma),白細胞介素(interleukin,IL)-6酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒、RIPA裂解緩沖液(英國Abcam公司),膜聯(lián)蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙錠(propidium iodide,PI)細胞凋亡檢測試劑盒(北京Biosea公司),BCA蛋白測定試劑盒(上海Sangon Biotech)。

1.2 細胞培養(yǎng)

H9C2細胞(1×104細胞/ml)接種到含10%(V/V)胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)的燒瓶中,并于37 ℃、95%空氣和5%CO2的潮濕條件下孵育。

1.3 實驗分組

為研究大黃素作用,H9C2細胞分為對照組、模型組、低劑量大黃素組、中劑量大黃素組、高劑量大黃素組。對照組以5.5 mmol/L葡萄糖處理,模型組以30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)72 h[10],低、中、高劑量大黃素組分別以5,10,15 μmol/L大黃素[4]+30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)72 h。其中,大黃素以100 mmol/L的濃度溶于二甲基亞砜中,并制成5,10,15 μmol/L濃度備用。

為探討大黃素的作用機制,H9C2細胞分為高劑量大黃素+miR-NC組、高劑量大黃素+miR-1224組。高劑量大黃素+miR-NC組以15 μmol/L大黃素+30 mmol/L葡萄糖+轉(zhuǎn)染miR-NC培養(yǎng)72 h,高劑量大黃素+miR-1224組以15 μmol/L大黃素+30 mmol/L葡萄糖+轉(zhuǎn)染miR-1224 mimic培養(yǎng)72 h。H9C2細胞轉(zhuǎn)染時,依照Lipofectamine 2000制造商的說明步驟進行,將24孔板中2×104細胞用指定的miR-1224 mimic和miR-NC(50 nmol/L)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后4-6 h,將轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基替換為含15 μmol/L大黃素和30 mmol/L葡萄糖的新鮮培養(yǎng)基,72 h后收集H9C2細胞用于后續(xù)測定。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

收集大黃素作用實驗和機制實驗分組H9C2細胞,添加適量的新鮮胰蛋白酶進行消化。當(dāng)細胞開始變圓時,加入等量的10%胎牛血清終止胰蛋白酶消化,在4 ℃和500 r/min下離心5 min。然后加入1 ml預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)懸浮細胞沉淀,并將懸浮液在4 ℃和500 r/min下離心5 min。離心和懸浮3次后,將H9C2細胞懸浮在結(jié)合緩沖液(500 μl)中,加入Annexin Ⅴ-FITC(5 μl)和PI(5 μl)染色液。H9C2細胞懸浮室溫下放置15 min后,在1 h內(nèi)進行流式細胞術(shù)分析。

1.5 免疫印跡實驗檢測蛋白表達

收集大黃素作用實驗和機制實驗分組H9C2細胞,使用RIPA裂解緩沖液從H9C2細胞中提取總蛋白,并通過BCA蛋白測定試劑盒測量蛋白濃度。等量的蛋白質(zhì)通過10% SDS/PAGE凝膠分離,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜。使用的抗體如下:GAPDH(1 ∶5 000),B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2,1 ∶3 000)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax,1 ∶3 000)。然后在室溫下使用相應(yīng)的二抗孵育1 h。蛋白條帶使用增強的化學(xué)發(fā)光液顯像。通過使用Image J軟件和GAPDH作為內(nèi)部參照,通過密度分析定量蛋白表達的水平。

1.6 ELISA法檢測IL-6、IL-1β和TNF-α水平

收集大黃素作用實驗和機制實驗分組H9C2細胞,使用IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒確定H9C2細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平。在Wellscan MK3酶標(biāo)儀中檢測到吸光度OD450值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定各組H9C2細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測miR-1224表達

根據(jù)Invitrogen制造的TRIzol試劑的指示,從H9C2細胞中提取總RNA。隨后,使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)TaKaRa實時PCR試劑盒進行PCR檢測。U6用作內(nèi)部對照,2-ΔΔCt方法計算miR-1224的相對表達。本研究使用的引物序列如下。miR-1224 F:5′-GCCTGTGACCATCATCCACTG-3′,miR-1224 R:5′-GGATTAAGTGACGAGGCTCAG-3′;U6 F:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,U6 R:5′-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大黃素對高糖處理H9C2細胞凋亡的影響

與對照組比較,模型組、低劑量大黃素組、中劑量大黃素組和高劑量大黃素組高糖處理H9C2細胞的凋亡率升高,Bcl-2蛋白表達水平降低,Bax蛋白表達水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,低劑量大黃素組、中劑量大黃素組、高劑量大黃素組細胞凋亡率逐漸降低,Bcl-2蛋白表達水平逐漸升高,Bax蛋白表達水平逐漸降低,且低劑量大黃素組與模型組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),中劑量大黃素組、高劑量大黃素組與模型組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與低劑量大黃素組相比,中劑量大黃素組和高劑量大黃素組H9C2細胞的凋亡率均降低,Bcl-2蛋白表達水平升高,Bax蛋白表達水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與中劑量大黃素組相比,高劑量大黃素組H9C2細胞的凋亡率均降低,Bcl-2蛋白表達水平升高,Bax蛋白表達水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖1,2)。

與對照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05;與低劑量大黃素組相比,&P<0.05;與中劑量大黃素組相比,△P<0.05圖1 大黃素對高糖處理H9C2細胞凋亡率的影響Figure 1 Effect of emodin on cell apoptosis rate of H9C2 treated with high glucose

與對照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05;與低劑量大黃素組相比,&P<0.05;與中劑量大黃素組相比,△P<0.05圖2 大黃素對高糖處理H9C2細胞中Bcl-2、Bax表達的影響Figure 2 Effect of emodin on the expression of Bcl-2 and Bax in H9C2 cells treated with high glucose

2.2 大黃素對高糖處理H9C2細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的影響

與對照組比較,模型組、低劑量大黃素組、中劑量大黃素組和高劑量大黃素組高糖處理H9C2細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,低劑量大黃素組、中劑量大黃素組和高劑量大黃素組高糖處理H9C2細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均逐漸降低,且低劑量大黃素組與模型組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),中劑量大黃素組、高劑量大黃素組與模型組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與低劑量大黃素組相比,中劑量大黃素組、高劑量大黃素組高糖處理H9C2細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與中劑量大黃素組相比,高劑量大黃素組高糖處理H9C2細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

表1 大黃素對高糖處理H9C2細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的影響Table 1 Effect of emodin on IL-6, IL-1β and TNF-α in H9C2 cells treated with high

2.3 大黃素對高糖處理H9C2細胞中miR-1224的影響

與對照組比較,模型組、低劑量大黃素組、中劑量大黃素組和高劑量大黃素組H9C2細胞中miR-1224的表達水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,低劑量大黃素組、中劑量大黃素組、高劑量大黃素組H9C2細胞中miR-1224的表達水平逐漸降低,且低劑量大黃素組與模型組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),中劑量大黃素組、高劑量大黃素組與模型組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與低劑量大黃素組相比,中劑量大黃素組、高劑量大黃素組H9C2細胞中miR-1224的表達水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與中劑量大黃素組相比,高劑量大黃素組H9C2細胞中miR-1224的表達水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。

與對照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05;與低劑量大黃素組相比,&P<0.05;與中劑量大黃素組相比,△P<0.05圖3 大黃素對高糖處理H9C2細胞中miR-1224的影響Figure 3 Effect of emodin on miR-1224 in H9C2 cells treated with high glucose

2.4 上調(diào)miR-1224表達逆轉(zhuǎn)了大黃素對高糖處理H9C2細胞凋亡的影響

與高劑量大黃素+miR-NC組比較,高劑量大黃素+miR-1224組H9C2細胞的miR-1224表達水平、凋亡率升高,Bcl-2蛋白表達水平降低,Bax蛋白表達水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖4,5)。

與高劑量大黃素+miR-NC組比較,*P<0.05圖4 上調(diào)miR-1224表達逆轉(zhuǎn)了大黃素對高糖處理H9C2細胞凋亡率的影響Figure 4 Up-expression of miR-1224 reverses the effect of emodin on cell apoptosis rate of H9C2 treated with high glucose

與高劑量大黃素+miR-NC組比較,*P<0.05圖5 上調(diào)miR-1224表達逆轉(zhuǎn)了大黃素對高糖處理H9C2細胞中Bcl-2、Bax表達的影響Figure 5 Upregulation of miR-1224 reverses the effect of emodin on the expression of Bcl-2 and Bax in H9C2 cells treated with high glucose

2.5 上調(diào)miR-1224表達逆轉(zhuǎn)了大黃素對高糖處理H9C2細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的影響

與高劑量大黃素+miR-NC組比較,高劑量大黃素+miR-1224組H9C2細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

表2 上調(diào)miR-1224表達逆轉(zhuǎn)了大黃素對高糖處理H9C2細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的影響Table 2 Up-expression of miR-1224 reverses the effect of modin on IL-6, IL-1β and TNF-α in H9C2 cells treated with high

3 討論

糖尿病性心肌病中心肌細胞凋亡在心室重塑和心功能衰竭中起重要作用。高血糖是導(dǎo)致糖尿病性心肌病的最初因素,因此,高血糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡是糖尿病性心肌病發(fā)生中必不可少的事件[11]。研究報道,30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)72 h,心肌細胞凋亡率顯著增加,而24 h和48 h心肌細胞凋亡率沒有顯著變化[10]。本研究以高葡萄糖培養(yǎng)H9C2細胞72 h,發(fā)現(xiàn)心肌細胞的凋亡率明顯高于正常葡萄糖培養(yǎng)的細胞凋亡,與前人研究吻合[10]。與細胞凋亡密切相關(guān)的Bcl-2家族成員可以分為兩類:一類抑制細胞凋亡,例如Bcl-2,Bcl-xl;另一類促進凋亡的細胞,包括Bax,Bak和Bid[12]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)H9C2細胞在高葡萄糖中培養(yǎng)時,心肌細胞的Bax表達增加,Bcl-2表達減少,這與流式細胞儀檢測細胞凋亡的結(jié)果相符。眾所周知,高血糖癥是糖尿病的主要臨床表現(xiàn),它與慢性炎癥相關(guān),高血糖癥可增加促炎細胞因子(如IL-6、IL-1β和TNF-α)的表達和釋放[13]。抑制炎癥已成為對抗糖尿病性心肌病的有吸引力的策略[14]。本研究同樣檢測到高糖使H9C2細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高,與以前的報告一致。

大黃素具有多種生物學(xué)活性,例如抗腫瘤[15]、抗細菌、抗病毒[16]、抗炎和抗氧化[17]。最近的研究表明,大黃素可以通過上調(diào)miR-9來保護PC-12細胞中高血糖誘導(dǎo)的損傷。同時,這些觀察結(jié)果與p21,p16,Bax等的下調(diào)以及cyclin D1和Bcl-2的上調(diào)相符[18],本研究與此結(jié)果一致,即10,15 μmol/L大黃素提高高糖處理H9C2細胞的凋亡率、Bax水平,降低Bcl-2水平。此外,大黃素通過上調(diào)miR-21防止HaCaT細胞中脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的炎癥損傷[19]。本研究中,10,15 μmol/L大黃素顯著減少IL-6、IL-1β和TNF-α水平,大黃素顯示出減輕炎癥作用,這與以前的研究一致,此前Yang等[20]報告大黃素能夠拮抗LPS刺激的H9C2細胞活力降低,以及凋亡、IL-1β、IL-6和TNF-α釋放增加,減輕LPS引起的心肌細胞炎癥損傷。值得注意的是,本研究觀察到,5 μmol/L大黃素對高糖處理H9C2細胞損傷無明顯影響。這些結(jié)果說明,大黃素可以保護心肌細胞免受高糖損傷,其功效與大黃素的濃度密切相關(guān)。

miRNA在藥物功效和毒性中起著關(guān)鍵作用,并且通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達對藥物產(chǎn)生潛在的臨床意義[21]。據(jù)報道,大黃素可通過調(diào)節(jié)miRNA的表達來保護細胞,包括miR-21[19]、miR-223[20]和miR-25[22]。同時,糖尿病性心肌病也被證明與miRNA密切相關(guān)[23,24]。根據(jù)報道,miR-1224在H2O2處理的肝細胞中表達增強,其敲除減輕了H2O2誘導(dǎo)的肝細胞活力抑制和細胞凋亡[9]。體內(nèi)和體外缺血再灌注后,肝細胞中的miR-1224被上調(diào),miR-1224通過靶向抗凋亡基因Nfib抑制急性肝衰竭細胞增殖[25]。注射LPS 6 h的小鼠脾臟中,miR-1224表達增加了5.7倍,miR-1224轉(zhuǎn)染到RAW264.7細胞中會導(dǎo)致LPS誘導(dǎo)的TNF,IL-1β和IL-6表達降低[26]。這些研究顯示miR-1224通過調(diào)節(jié)凋亡和炎癥而對細胞損傷產(chǎn)生保護作用。在我們的研究中,H9C2細胞中miR-1224的表達被高糖處理顯著上調(diào),而被10,15 μmol/L大黃素所下調(diào)。此外,miR-1224過表達逆轉(zhuǎn)了大黃素對高糖所致H9C2細胞損傷的保護作用,表現(xiàn)為15 μmol/L大黃素和miR-1224的過表達使高糖處理H9C2細胞的凋亡率、Bax蛋白表達、IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高,而Bcl-2水平降低。這說明大黃素通過下調(diào)miR-1224發(fā)揮了對高糖處理心肌細胞的保護效果。

總之,本研究的結(jié)果表明,大黃素在高糖處理H9C2細胞損傷中具有保護功能。大黃素可能通過下調(diào)miR-1224來減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和炎癥。因此,大黃素和miR-1224干預(yù)可能潛在地幫助治療糖尿病性心肌病。