生脈制劑指紋圖譜研究進展

連 艷，鄧莉娟

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 中藥材標準化教育部重點實驗室，四川 成都 611137)

隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化的不斷推進，建立更加科學(xué)、系統(tǒng)的中藥質(zhì)量標準是亟待解決的問題。以往依靠一種有效成分的含量測定來控制中藥的質(zhì)量，已經(jīng)不能適用于中藥現(xiàn)代化的進程。中藥指紋圖譜可以在不清楚全部化學(xué)成分的情況下，有效控制中藥的質(zhì)量，提高中藥質(zhì)量的穩(wěn)定性[1-2]。生脈散出自《醫(yī)學(xué)啟源》[3-4]，因其簡潔的配伍、顯著的臨床藥效，一直傳承至今，形成了生脈飲、生脈膠囊、生脈注射液等多劑型的系列產(chǎn)品。生脈系列產(chǎn)品對于心血管疾病有著良好的治療效果，改變君藥之后的生脈飲(黨參方)更是當下人們補氣血的常備藥。正是這樣一個有著悠久歷史傳承和廣泛現(xiàn)代應(yīng)用的藥物，目前卻并沒有科學(xué)、完善的質(zhì)量標準。國家標準中的單一成分檢測已經(jīng)不能滿足藥品檢測的更高要求，人們開始探索生脈飲系列制劑的指紋圖譜，嘗試建立一套更加適合中藥，更加科學(xué)全面的評價體系。目前生脈注射液的指紋圖譜研究相對較多，而生脈飲等口服制劑還沒有建立標準的指紋圖譜。本研究通過簡述近20年來指紋圖譜技術(shù)的發(fā)展和中藥領(lǐng)域指紋圖譜的應(yīng)用，梳理近年來關(guān)于生脈系列制劑的指紋圖譜研究，探究其在質(zhì)量標準建立中的成果和亟待解決的問題。

1 中藥指紋圖譜概述

1.1 指紋圖譜的由來

指紋圖譜分析，最早用于法醫(yī)根據(jù)人的指紋進行鑒定[5-7]。人體指紋分為拱形、環(huán)形和螺紋形，有一定的相似性，但存在細微區(qū)別，每一個人的指紋都是獨一無二的，由此我們可以根據(jù)指紋找到相對應(yīng)的人。隨著生化科技的發(fā)展，“指紋”的特性被運用到各個領(lǐng)域。在生物鑒定方面我們開始應(yīng)用比傳統(tǒng)指紋更精確的DNA指紋圖譜作為鑒定標準；在生物分類中，我們可以通過DNA指紋圖譜所顯示的共性與個性，更好地找到生物之間的聯(lián)系；在天然藥物方面，我們可以通過各種不同的化學(xué)分析所得到的指紋圖譜來全面展示天然藥物中復(fù)雜的成分。

1.2 指紋圖譜的應(yīng)用

在推動中藥現(xiàn)代化的進程中，許多學(xué)者開始嘗試采用現(xiàn)代化學(xué)手段研究中藥；但在諸多的單一成分研究后，人們開始意識到，中藥本身的特性就是多成分間的相互作用，而非單一化學(xué)藥物的簡單相加。目前我們尚不能將一味藥材或一種中藥制劑的所有成分全部分析清楚，但可以依靠指紋圖譜，全面展現(xiàn)藥材或制劑中的化學(xué)成分及相關(guān)含量。

國家藥品監(jiān)督管理局于2000年8月發(fā)布的《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》中提到：“中藥材指紋圖譜是指中藥材經(jīng)適當處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標示該中藥材特性的共有峰的圖譜；如原藥材需經(jīng)過特殊炮制(如醋制、酒制、炒炭等)，則應(yīng)制定原藥材和炮制品指紋圖譜的檢測標準?！盵8]世界各地的藥品監(jiān)管機構(gòu)，如世界衛(wèi)生組織(WHO)、中國食品藥品監(jiān)督管理局(CFDA)、美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)、歐洲藥品監(jiān)督管理局(EMA)和韓國食品藥品安全部(MFDS)等都認可用指紋圖譜的概念來評價中草藥的質(zhì)量[9-10]。

1.3 中藥指紋圖譜的作用

指紋圖譜研究分為兩個步驟，第一步是圖譜信息的獲得；第二步是圖譜信息的處理[11-12]。中藥指紋圖譜可以通過高效液相色譜法、氣相色譜法、分光光度法、薄層色譜法等分析方法得到化學(xué)成分圖譜。不同的分析方法對于成分的體現(xiàn)也是有區(qū)別的，目前最為常用和研究最多的是應(yīng)用高效液相色譜法得到圖譜信息。高效液相色譜法可以檢測較多的成分，還可以進行含量測定，分析速度快、圖譜呈現(xiàn)清晰，適用于中藥的指紋圖譜研究。中藥指紋圖譜既可以展示同一藥材或制劑的共性成分，也可以體現(xiàn)出成分之間的含量差異。因此，指紋圖譜分析常用于判定藥材或制劑的真?zhèn)?，評價藥材或制劑的質(zhì)量高低。

2 中成藥指紋圖譜研究現(xiàn)狀

2.1 中成藥指紋圖譜概述

中藥成方是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，其處方組成依據(jù)中醫(yī)藥理論體系的理法方藥、辨證施治的基本原則，在疾病的診療預(yù)防中具有整體觀的特點[13-14]。中藥在現(xiàn)代化發(fā)展的過程中，為適應(yīng)新時代的快節(jié)奏，必須做到開藥方便、用藥方便。成方制劑往往是多味中藥，成分復(fù)雜，每一味藥材都需要經(jīng)過嚴格凈制、炮制等多道工序處理，符合飲片標準之后才能投入生產(chǎn)使用。在整個過程中，可能出現(xiàn)藥材產(chǎn)地不同、藥材加工方式不同、劣品偽品混雜等因素，導(dǎo)致藥材質(zhì)量參差不齊，藥品質(zhì)量難以控制。因此，中成藥從新藥上市到藥品檢查，都需要進行嚴格的成分檢查、質(zhì)量評價。

針對中成藥的復(fù)雜情況，研究人員開始引入指紋圖譜法對中成藥進行分析研究和質(zhì)量評價。色譜法是分析化學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展最為快速、應(yīng)用最為廣泛的方法，也是指紋圖譜建立的最常用方法[15-16]。鄒純才等[17]開展指紋圖譜研究，將中藥色譜指紋圖譜相似度評價分為三個階段：直觀比較階段(1988-1999年)、相似度比較起步階段(2000-2009年)、相似度評價完善階段(2010-2017年)；在其文章中，對中藥指紋圖譜歷年的文獻數(shù)量進行了統(tǒng)計，從表格中可以看出，自2000年后，中藥指紋圖譜研究開始快速增加，進入黃金發(fā)展時期。

盂憲生[18]、張潔等[19]、謝培山等[20]、張鐵軍等[21]、詹雪艷等[22]、馮碧等[23]采用指紋圖譜對不同中成藥進行了研究，結(jié)果表明指紋圖譜可以將藥物的大部分化合物特征展現(xiàn)出來，不受成分研究的限制，將化學(xué)信息以圖譜的形式呈現(xiàn)，直觀簡潔，這是目前公認的最適合中藥及天然藥物物質(zhì)群質(zhì)量控制的手段之一[24-27]。采用指紋圖譜的方法，可以實現(xiàn)對中藥的整體性評價，達到有效控制質(zhì)量的目的。

2.2 《中國藥典》關(guān)于圖譜的應(yīng)用

1985年版《中國藥典》開始將色譜、光譜技術(shù)應(yīng)用于中藥的檢驗標準[28]。從1990年版《中國藥典》開始，藥材、飲片以及成方制劑的鑒定和測定增加了薄層色譜鑒別，不再是以單一成分檢測為主。對照品的設(shè)置和薄層色譜特征鑒別的方法已經(jīng)在逐漸向著更加全面、完善的化學(xué)分析方向進步，為指紋圖譜的出現(xiàn)和應(yīng)用埋下了伏筆。2000年國家藥品監(jiān)督管理局頒布了第一版《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》，學(xué)者們開始對不同的中成藥進行了指紋圖譜研究。對于研究次數(shù)較多、研究內(nèi)容較完整的藥物，《中國藥典》對其質(zhì)量檢測標準作出了修改，加入了特征圖譜、指紋圖譜作為檢測標準。從2010年開始，《中國藥典》正式將指紋圖譜收錄為中藥檢測標準。

2010年版《中國藥典》一部加入了6種成方制劑檢查項中的指紋圖譜[29-31]。其中復(fù)方丹參滴丸將指紋圖譜加入到質(zhì)量評價中，對制劑的質(zhì)量控制水準起到了極大的提高作用，這也是指紋圖譜在中成藥質(zhì)量評價中的一次大膽嘗試。2015年版《中國藥典》比2010年版又新收錄了9種成方制劑的指紋圖譜[32]。此版藥典中記載了標準指紋圖譜，嚴格規(guī)定了參照物、共有峰、相似度等標準，使中藥質(zhì)量評價進一步規(guī)范化和精準化。到目前為止，包括片劑、顆粒劑、膠囊劑、注射劑等多種劑型均有指紋圖譜收載。指紋圖譜和特征圖譜的加入，為相關(guān)藥品的檢測提供了法定依據(jù)，有力保障了藥品的質(zhì)量安全和質(zhì)量水平。兩版《中國藥典》中收載指紋圖譜的中成藥情況統(tǒng)計，見表1。

表1 《中國藥典》中收載了指紋圖譜的中成藥統(tǒng)計

3 生脈系列制品溯源

“生脈散”首載于金元時期張元素所著《醫(yī)學(xué)啟源》，定型于《內(nèi)外傷辨惑論》，完善于《醫(yī)方考》[13]。根據(jù)《醫(yī)學(xué)啟源》的記載，該方由人參、麥冬、北五味子組成，主治熱傷元氣、陰液虧耗的氣陰兩虛證[13]。近些年生脈散已廣泛應(yīng)用于治療各類心血管疾病，如病毒性心肌炎、冠心病、心肌缺血、心律失常、心力衰竭等，甚至用于治療各種休克，成為中醫(yī)治療急癥的常用方劑[33]。古方生脈散在適應(yīng)不同臨床需求的情況下產(chǎn)生了多種劑型，如口服液、片劑、膠囊劑、注射劑等。常見的生脈飲制劑，又分為黨參方和人參方，黨參方藥味平和，更適宜日常使用，人參方補氣效果更強，為了更易吸收，多使用紅參，而非生曬參。

3.1 生脈系列制品成分研究

生脈方中的紅參、麥冬和五味子均為常用中藥，關(guān)于其的相關(guān)成分研究較多[34]。生脈制劑藥味較少，臨床使用廣泛，全方研究也較多。目前主要采用液相、氣相、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法進行定性、定量分析。生脈制劑化學(xué)成分主要包括皂苷類、黃酮類、木脂素、多糖等成分，見表2。

根據(jù)表2可知，生脈制劑研究包括傳統(tǒng)的成分分析、不同君藥對生脈制劑的影響。成分研究中最常用的方法就是高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用，HPLC法分析速度快、適用性強、各成分分離度高，其與質(zhì)譜聯(lián)用可同時判定成分性質(zhì)和成分含量。隨著研究水平的提高，生脈制劑中能確定的化學(xué)成分越來越多，檢測速度也越來越快。在成分研究的物質(zhì)基礎(chǔ)上，結(jié)合動物藥理實驗、臨床案例分析、網(wǎng)絡(luò)藥理模擬等方法，可進一步開展生脈制劑的適用病癥、作用機理、質(zhì)量控制等多方面研究。

表2 生脈制劑主要成分研究進展

3.2 生脈制劑質(zhì)量標準研究

3.2.1 生脈制劑質(zhì)量研究現(xiàn)狀 通過中國知網(wǎng)對文獻進行關(guān)鍵詞篩選，選取1979-2020年所收錄的所有文獻，篩選得到篇名含關(guān)鍵詞“生脈”的文獻5 202篇；通過檢索關(guān)鍵詞“臨床、病例”，篩選得到臨床研究方向文獻1 370篇；通過檢索關(guān)鍵詞“藥理、機制、機理”篩選得到藥理研究方向文獻916篇；通過檢索關(guān)鍵詞“成分分析、成分、含量、測定”篩選得到成分研究方向文獻1 009篇；通過檢索關(guān)鍵詞“質(zhì)量控制、質(zhì)量標準、質(zhì)量評價、指紋圖譜”篩選得到質(zhì)量研究方向文獻244篇；再從244篇關(guān)于生脈制劑質(zhì)量研究的文獻中，細分出不同的制劑研究文獻。具體情況，見表3。

通過以上分析發(fā)現(xiàn)，針對生脈系列不同制劑的研究主要圍繞成分研究、藥理研究和臨床研究，相比較而言，生脈系列制劑的質(zhì)量研究較少，并集中于某幾種有效成分的含量測定，而關(guān)于指紋圖譜等整體質(zhì)量控制的研究較少。從研究劑型來看，生脈注射液是研究最多的劑型；其次是口服液。生脈注射液和生脈飲是生脈系列中使用最多的兩種類型，所以相關(guān)研究較多；其他劑型，如散劑、膠囊、片劑等，使用較少，文獻研究也較少。隨著中藥注射劑安全性和穩(wěn)定性的提高，生脈注射液已被廣泛應(yīng)用于心血管疾病。在最近的新冠肺炎治療中，國家頒布的第七版診療方案將生脈注射液收載為輔助治療藥物[41]。

目前對生脈飲的主要質(zhì)控手段是對產(chǎn)品中的單一指標成分進行含量測定?！吨袊幍洹?020版中收錄的生脈飲(紅參方)和生脈膠囊兩種劑型[32]，僅僅采用薄層色譜法鑒別和高效液相色譜法測定單一成分含量。生脈注射液療效顯著，應(yīng)用廣泛，對其研究最多，質(zhì)量控制也最為嚴格。2011年頒布的生脈注射液新質(zhì)量標準中，增加了指紋圖譜檢測，嚴格把控注射劑質(zhì)量；同時生脈注射液的指紋圖譜研究較多，供試品制備方法和色譜條件都較為完善，而生脈飲等口服制劑的指紋圖譜研究較少，藥典等國家標準未加入標準指紋圖譜評價體系。

由于成方制劑中化學(xué)成分多樣，薄層色譜或含量測定對于中藥質(zhì)量控制并不全面，想要整體分析成方制劑，不僅要看主要成分，更要結(jié)合臨床研究、藥理研究，關(guān)注有效成分和多成分的協(xié)同作用[42-43]。相關(guān)研究表明[44-48]，基于代謝組學(xué)的“七指標”作為質(zhì)量標準有助于藥品的質(zhì)量控制，這類用幾種主要成分或總含有量的濃度來對目前的質(zhì)量控制標準進行補充的方法具有一定科學(xué)性。近年來，生脈系列制劑的質(zhì)量評價系統(tǒng)研究和指紋圖譜研究日益增加。在成分測定的基礎(chǔ)上，質(zhì)量研究方向有了進一步拓展，開始引入了指紋圖譜概念。

3.2.2 生脈口服制劑指紋圖譜研究進展 林美斯等[49]、陳建真等[50]研究表明，生脈制劑檢驗項目通常具有較大局限性，很難在圖譜中全面應(yīng)用。與全成分分析不同，潘曉麗[51]將生脈飲分別用正丁醇和乙酸乙酯提取，建立了生脈飲正丁醇部分和乙酸乙酯部分的對照指紋圖譜。2012年王艷慧等[36]應(yīng)用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，進一步對生脈系列產(chǎn)品進行了質(zhì)量評價分析。指紋圖譜研究不是簡單的圖譜呈現(xiàn)，結(jié)合質(zhì)譜等技術(shù)，可以進一步深挖化學(xué)信息，全面評價中藥質(zhì)量。

生脈口服制劑類型多樣，包括口服液、膠囊劑、片劑、顆粒劑等，還有諸多加味系列產(chǎn)品。但單獨一項產(chǎn)品的研究較少，指紋圖譜研究局限于簡單的高效液相色譜分析，紫外光譜、質(zhì)譜聯(lián)用等新技術(shù)使用少，多成分含量測定、生物活性成分結(jié)合等新方法使用少?？诜苿┑馁|(zhì)量波動大，質(zhì)量控制困難，更應(yīng)該加大對于口服制劑的研究，以控制質(zhì)量，嚴格把控生廠加工過程。

3.2.3 生脈注射劑指紋圖譜研究進展 關(guān)于生脈注射液指紋圖譜的研究已經(jīng)有近20年的歷史。隨著人們的不斷嘗試，檢驗技術(shù)不斷提高，生脈注射液指紋圖譜的建立方法逐漸成熟。在早期研究中，常采用自制中藥煎劑進行研究。王勤等[52]、BAI[53]利用HPLC建立參麥注射液的指紋圖譜，對圖譜中的各個峰進行藥材歸屬分析。近5年來，超高效液相技術(shù)使用越來越多。柴瑞平等[54]采用超高效液相色譜法分析生脈注射液，并建立了UPLC指紋圖譜，確定了44個共有峰，對其中11個色譜峰相對應(yīng)的化學(xué)成分進行了含量測定。目前，生脈注射液已建立了多張液相色譜指紋圖譜，但這只能反映某一波長下化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)，并不能完整呈現(xiàn)藥品的化學(xué)特征。目前，物理指紋圖譜的研究已逐漸起步，這是中藥質(zhì)量評價方法的新探索方向。梁悅[55]在研究生脈注射液時，結(jié)合了八種物理參數(shù)，即pH值、折光率、電導(dǎo)率、運動黏度、相對密度、固含物、濁度、滲透壓摩爾濃度，建立了生脈注射液的物理指紋圖譜，用雷達圖的方式直觀展現(xiàn)了藥品的物理性質(zhì)。梁悅[56]還建立了生脈注射液的紫外、紅外指紋圖譜，此為對其質(zhì)量標準進行再評價研究的大膽探索。

指紋圖譜的建立不是簡單的將圖譜導(dǎo)入軟件即可[57-61]。本研究通過分析以HPLC方法建立生脈注射液指紋圖譜的文獻，統(tǒng)計共有峰與參照峰信息，得到以下研究結(jié)果，見表4。

表4 生脈注射液指紋圖譜研究進展

根據(jù)表4所示，在建立生脈注射液指紋圖譜的過程中，最常使用的參照峰為人參皂苷Rb1，人參皂苷Rb1在液相分析中色譜峰分離度高、峰面積較大、保留時間適宜，還是生脈注射液的主要有效成分，所以常常作為參照峰(表5)。分析表5發(fā)現(xiàn)，生脈注射液的指紋圖譜建立中標定的共有峰大約在20個以上，確定的共有峰對應(yīng)化學(xué)成分一般為含量較多的成分，包括人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、五味子醇甲等。分析指紋圖譜中確認的化合物可以看出，生脈注射液的主要成分來自人參。結(jié)合成分研究，可知在生脈制劑中麥冬、五味子相關(guān)成分體現(xiàn)較少。單一的液相或氣相色譜只能勾勒出圖譜的形狀，結(jié)合質(zhì)譜儀分析，可以確定色譜峰所對應(yīng)的化合物，通過完善圖譜信息，為“一測多評”提供了研究基礎(chǔ)。

表5 生脈注射液指紋圖譜中確認的化合物

4 結(jié)語

中藥質(zhì)量與中藥臨床療效息息相關(guān)，只有嚴格進行中藥質(zhì)量控制，才能產(chǎn)生良好的臨床效果。隨著中成藥應(yīng)用的加大，中成藥面臨的質(zhì)量評價、統(tǒng)一精細標準等諸多問題亟待解決。生脈飲作為心血管疾病的常用藥，藥典所載鑒定和測定標準尚不完善。由于注射液要求嚴格，差異較小，容易構(gòu)建指紋圖譜，因此目前只有生脈注射液的指紋圖譜研究相對較多，并于2013年出版了生脈注射液國家標準指紋圖譜。由于口服制劑各廠家、各批次差異略大，現(xiàn)有的指紋圖譜研究較少，還沒有標準指紋圖譜的建立，如何選擇特征峰、建立穩(wěn)定的標準指紋圖譜、有效反映產(chǎn)品質(zhì)量將成為研究的重點和難點。

生脈系列配伍簡單，有效成分研究較為清晰，可以進一步改善分析技術(shù)，優(yōu)化質(zhì)量評價方法，如采用超高效液相、紫外全波段檢測、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、“一測多評”等方法。相信隨著檢測儀器和檢測方法的改進，生脈注射液的質(zhì)量標準控制將越來越科學(xué)完善。

生脈系列有著多種不同的制劑類型，但關(guān)于不同劑型間差異的研究較少。目前僅靠單一成分研究，不同劑型間的差異難以發(fā)現(xiàn)。生脈制劑中有人參方和黨參方，但關(guān)于這兩者的化學(xué)成分對比、藥效對比、臨床應(yīng)用差異等研究較少。指紋圖譜研究也只是針對一種藥物分析，沒有比較研究。如果能夠建立生脈系列不同劑型的指紋圖譜，以共有成分作為參照，就能清晰反映不同劑型間成分的含量分布區(qū)別，進一步研究不同劑型的成分與藥效差別。

開展指紋圖譜研究，一般是為了制定藥物的質(zhì)量檢測和評價標準，但光這些遠遠不夠。指紋圖譜的化學(xué)信息、藥效學(xué)的對癥研究、病例的臨床分析，這些綜合相加，才能體現(xiàn)完整的中藥信息學(xué)?？傊嗅t(yī)藥現(xiàn)代化是一個浩大的工程，還有漫長的道路要走，指紋圖譜研究只是中醫(yī)藥現(xiàn)代化的一個小推手、一塊發(fā)展的小基石，但也正是這一塊塊基石，才搭建起了中醫(yī)藥現(xiàn)代化的高樓。