基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芪治療慢傳輸型便秘作用機(jī)制

楊金玉，王鳳飛，陸文洪，李帥軍*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005)

慢傳輸型便秘(STC)是最常見(jiàn)的慢性便秘之一，其病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與腸神經(jīng)系統(tǒng)、Cajal間質(zhì)細(xì)胞、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、腸道菌群、精神心理、腸道平滑肌等因素相關(guān)[1]，多以結(jié)腸傳輸時(shí)間長(zhǎng)，腸道蠕動(dòng)減慢為特征。國(guó)外流行病學(xué)調(diào)查顯示[2-4]，慢性便秘的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且發(fā)病人群廣，已嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。

中藥黃芪始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、利水消腫、固表止汗、托瘡生肌等功效[5-6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪含有黃芪皂苷、黃芪多糖、多種氨基酸等成分，在調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗衰老、抗腫瘤、抑菌及抑制病毒等方面具有重要作用[7]。其中所含的多糖氨基酸成分，通過(guò)增強(qiáng)腸蠕動(dòng)及平滑肌張力，在改善便秘中發(fā)揮了重要作用[8]。臨床上常使用黃芪治療氣虛型便秘。邱月平[9]通過(guò)對(duì)比分析黃芪湯治療組與乳果糖對(duì)照組的臨床療效發(fā)現(xiàn)，治療組的總有效率達(dá)92%，說(shuō)明黃芪湯可有效緩解便秘患者臨床癥狀。氣血虧虛是便秘的基礎(chǔ)狀態(tài)，調(diào)態(tài)以“補(bǔ)氣養(yǎng)血”為法，黃芪、當(dāng)歸為首選中藥。金益等[10]通過(guò)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸-黃芪是最常出現(xiàn)的配伍藥對(duì)之一，二者配伍可共同發(fā)揮補(bǔ)血活血、養(yǎng)血潤(rùn)腸的作用。

中藥具有多成分、多作用靶點(diǎn)及多作用途徑的特點(diǎn)[11]。黃芪具有治療慢傳輸型便秘的作用，但其成分、靶點(diǎn)與作用機(jī)制等尚不明確。因此，本研究以黃芪為研究對(duì)象，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選黃芪治療STC的有效成分及潛在靶點(diǎn)，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，得到黃芪分子作用機(jī)制，為進(jìn)一步理論研究及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)

利用 Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)可視化圖并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用的主要數(shù)據(jù)庫(kù)為TCMSP、GeneCards、OMIM、UniProt、Venn、STRING、David。

1.2 黃芪活性成分的篩選及其靶點(diǎn)的獲取

在TCMSP(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢黃芪的化學(xué)成分，口服生物利用度 (OB)及藥物相似度 (DL)為常用的活性成分篩選指標(biāo)[12-13]，設(shè)置OB≥30%、DL≥0.18 得到相關(guān)活性成分，點(diǎn)擊“Related Targets”查找所需活性成分相關(guān)的蛋白靶點(diǎn)，并使用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)[14]查詢靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)的基因，對(duì)查詢的基因進(jìn)行歸納整理。

1.3 STC疾病相關(guān)靶基因的獲取

以“slow transit constipation”為關(guān)鍵詞在GeneCards及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索相關(guān)疾病基因，將其進(jìn)行整合，刪除重復(fù)值，并歸納整理最終獲得的靶基因。

1.4 黃芪活性成分與STC靶點(diǎn)的交集

將黃芪有效成分的相關(guān)靶點(diǎn)與STC的靶點(diǎn)導(dǎo)入Venn平臺(tái)，得到黃芪活性成分與STC的交集靶點(diǎn)，并繪制Venn圖。

1.5 蛋白相互作用 (PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“1.4”中得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為“Homo sapiens”(人源)，設(shè)置“minimum required interaction score”為“Medium confidence=0.4”，其余參數(shù)為默認(rèn)值，得到蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)，下載tsv文件，通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行拓?fù)浞治霾⒑Y選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6 GO富集功能分析與KEGG通路富集分析

為進(jìn)一步研究黃芪作用機(jī)制，將交集后所得的靶點(diǎn)導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行GO富集功能分析，包括生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞組分(CC)及分子功能(MF)，并進(jìn)行KEGG通路富集分析，得到黃芪治療STC的主要作用通路，進(jìn)行可視化處理，探討黃芪治療STC可能的作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 黃芪活性成分篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中以“黃芪”為檢索詞進(jìn)行查詢，共得到87個(gè)活性成分，設(shè)置OB≥30%、DL≥0.18，初步篩選出20個(gè)活性成分，見(jiàn)表1。

表1 黃芪活性成分基本信息

2.2 黃芪活性成分靶基因的獲取及活性成分-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將4個(gè)未檢索到靶蛋白的活性成分剔除后得到16個(gè)有效活性成分，將檢索到的靶蛋白進(jìn)行歸納整理，使用 Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)將檢索到的所有靶點(diǎn)蛋白校正為官方名稱 (Officical Symbol)，刪除重復(fù)項(xiàng)后得到 172個(gè)作用靶點(diǎn)。將16個(gè)有效成分，172個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建黃芪“活性成分-基因靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖1)。16個(gè)菱形表示黃芪的活性成分，172個(gè)三角形表示黃芪對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)，365條邊代表靶點(diǎn)及化學(xué)成分之間的相互作用，體現(xiàn)了黃芪多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。經(jīng)計(jì)算，槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇(7-O-methylisomucronulatol)、刺芒柄花素(formononetin)、異鼠李素(isorhamnetin)的Degree值較高，見(jiàn)表2。

表2 關(guān)鍵活性成分

2.3 STC疾病相關(guān)靶基因的獲取

在Gene Cards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索關(guān)鍵詞“slow transit constipation”，獲取STC的潛在靶點(diǎn)，交集映射，去除重復(fù)值后，最終整合STC疾病靶點(diǎn)1 824個(gè)。

2.4 黃芪活性成分靶點(diǎn)與STC靶點(diǎn)的交集

通過(guò)繪制韋恩圖進(jìn)行交集分析，得到藥物靶點(diǎn)中與STC相關(guān)的靶點(diǎn)共113個(gè)，包括MMP2、SLC6A2、HSPB1、PLAU、NOS2等，表明黃芪可多靶點(diǎn)治療STC，見(jiàn)圖2。

圖2 黃芪靶點(diǎn)與STC相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

2.5 蛋白相互作用 (PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

PPI網(wǎng)絡(luò)中有112個(gè)節(jié)點(diǎn)(其中有1個(gè)靶點(diǎn)未與其他靶點(diǎn)發(fā)生相互作用)，2 069條連線，見(jiàn)圖3。對(duì)排序均在前20的度值及介數(shù)的靶點(diǎn)進(jìn)行交集，共篩選出17個(gè)度值與介數(shù)的靶點(diǎn)，提示這些靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用，可能是黃芪治療STC的關(guān)鍵靶點(diǎn)，見(jiàn)表3。

圖3 靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表3 關(guān)鍵靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)

2.6 GO富集功能分析與KEGG 通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集功能分析，共獲得287條GO條目(P<0.01)，其中生物過(guò)程(BP)條目218條，分子功能(CC)條目22條，細(xì)胞成分(MF)條目47條。用R軟件繪制BP，CC及MF富集前10位的條形圖見(jiàn)圖4、圖5、圖6。其中BP涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、對(duì)藥物的反應(yīng)(Response to drug)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控(Negative regulation of apoptotic process)與轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)，DNA模板(Positive regulation of transcription，DNA-templated)、缺乏配體的外源性凋亡信號(hào)通路(Extrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligand)等過(guò)程。CC涉及細(xì)胞外液(Extracellular space)、膜筏(Membrane raft)、胞外片段(Extracellular region)、細(xì)胞質(zhì)(Cytosol)、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)(Perinuclear region of cytoplasm)等部分。MF涉及酶結(jié)合(Enzyme binding)、蛋白結(jié)合(Protein binding)、相同蛋白質(zhì)結(jié)合(Identical protein binding)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(Transcription factor binding)與蛋白激酶結(jié)合(Protein kinase binding)、蛋白質(zhì)異源二聚體活性(Protein heterodimerization activity)等過(guò)程。KEGG分析共獲得117條信號(hào)通路，有84條通路的P<0.01，按基因富集數(shù)進(jìn)行排序，繪制前15條通路的氣泡圖見(jiàn)圖7。其靶點(diǎn)在乙型肝炎、甲型流感、HTLV-I感染、恰加斯病(美國(guó)錐蟲病)等疾病與癌癥信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等上富集較多。

圖4 GO-BP分析結(jié)果條形圖

圖5 GO-CC分析結(jié)果條形圖

圖6 GO-MF分析結(jié)果條形圖

圖7 KEGG富集分析的前15條通路圖

3 討論

慢傳輸型便秘(STC)因其病理生理機(jī)制復(fù)雜，目前其治療尚未取得滿意的療效。中醫(yī)根據(jù)其發(fā)病的病因病機(jī)進(jìn)行多層次、多角度的辨證施治，治療效果較好[15-16]。中醫(yī)認(rèn)為STC以本虛標(biāo)實(shí)為主，多以氣虛型為主要證候，臨床治療以虛者補(bǔ)之為主要治則。相關(guān)文獻(xiàn)[17]表明，以黃芪為主的方劑可有效改善氣虛型功能性便秘，但其有效成分及作用機(jī)制尚不明確。本研究使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出16種有效活性成分，包括丁子香萜、華良姜素、常春藤皂苷元、異鼠李素、3，9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇、槲皮素、山柰酚、刺芒柄花素等，其中槲皮素是關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)最多且Dgree值最高的活性成分。槲皮素是天然存在的黃酮類物質(zhì)，槲皮素通過(guò)增加擬桿菌及減少變形桿菌，調(diào)節(jié)腸道菌群失衡狀態(tài)，從而恢復(fù)宿主微生物的平衡[18]。陳櫻萌等[19]通過(guò)研究小鼠體內(nèi)外槲皮素對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明，槲皮素可調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)狀態(tài)，可一定程度緩解消化系統(tǒng)臨床癥狀。張晉蔚[20]研究表明，槲皮素可降低結(jié)腸黏膜水通道蛋白表達(dá)，減少對(duì)腸道內(nèi)容物水分吸收，從而起到緩解慢性傳輸性便秘癥狀的作用。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AKT1、TP53、IL6、VEGFA、CASP3、MAPK8等17個(gè)靶標(biāo)可能是黃芪治療STC的關(guān)鍵靶點(diǎn)。AKT是一種蛋白激酶，它是P13K信號(hào)傳導(dǎo)通路下游一個(gè)重要的激酶，分為AKT1、AKT2、AKT3三個(gè)亞型。AKT參與P13K/AKT/mTOR細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，通過(guò)促進(jìn)ICC增殖、抑制ICC凋亡從而發(fā)揮治療STC的作用[21]?？蒂讳h[22]研究表明，可通過(guò)降低便秘患者炎癥因子水平，包括 IL-6 等，改善便秘狀態(tài)。MAPK可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及凋亡[23]。MAPK通過(guò)調(diào)節(jié)水通道蛋白(AQPs)在細(xì)胞中的表達(dá)從而起到促進(jìn)調(diào)節(jié)水分運(yùn)輸?shù)淖饔肹24]。TP53、VEGFA、CASP3共同調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，富集的信號(hào)通路多樣，包括癌癥信號(hào)通路、PI3K/AKT 信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路。

GO分析結(jié)果表明，黃芪可能在RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、對(duì)藥物的反應(yīng)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)、DNA模板、缺乏配體的外源性凋亡信號(hào)通路等過(guò)程中發(fā)揮治療STC的功效。KEGG結(jié)果提示，黃芪治療STC的主要通路為癌癥信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路。PI3K激活后產(chǎn)生PIP3與AKT結(jié)合，Akt磷酸化后可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，抑制細(xì)胞凋亡；P-Akt表達(dá)明顯降低可使結(jié)腸組織NO含量增多，可抑制平滑肌收縮，減少胃腸道蠕動(dòng)[25]。研究表明，水通道蛋白 (AQPs)通過(guò)調(diào)整結(jié)腸內(nèi)生物膜的透水性從而維持結(jié)腸內(nèi)水代謝平衡，而 MAPK信號(hào)通路中 ERK、JNK、p38 MAPK的激活與水通道蛋白的表達(dá)有一定的相關(guān)性，與STC的發(fā)生緊密相關(guān)[26]。盡管癌癥信號(hào)通路及TNF信號(hào)通路在STC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，但目前對(duì)其研究較少，有關(guān)作用機(jī)制尚不清楚，今后可從相關(guān)通路著手進(jìn)行研究。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芪治療STC的分子機(jī)制，結(jié)果顯示，黃芪中槲皮素等16個(gè)活性成分通過(guò)AKT1、TP53、IL6等113個(gè)作用靶點(diǎn)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等84條信號(hào)通路發(fā)揮治療STC的作用，體現(xiàn)了黃芪多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)調(diào)發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、減輕炎癥反應(yīng)等藥理作用治療STC的特點(diǎn)。而黃芪是否通過(guò)這些核心靶點(diǎn)與通路發(fā)揮治療STC的功效，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。