基于HPLC指紋圖譜和主成分分析方法評價不同產(chǎn)地延胡索的質(zhì)量

楊敏娟，楊小龍，黃銀平，孫冬梅，魏 梅

(廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244)

延胡索為罌粟科紫堇屬植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖，功能與主治為活血、行氣、止痛[1]。延胡索適應能力強，生長周期短，分布廣泛。主產(chǎn)于浙江東陽和磐安、陜西漢中、安徽蕪湖、江蘇南通、重慶等地[2]。延胡索的化學成分主要有異喹啉型生物堿，以及有機酸、淀粉、皂醇類、粘液質(zhì)、樹脂、皂苷類和無機元素。據(jù)文獻報道，從延胡索中分離鑒定出40多個化合物，分別為原阿片堿類、原小檗堿類、異喹啉苯并菲啶類、阿樸菲類、異喹啉芐咪唑類、雙芐基異哇琳類等，其中，原小檗堿類最多[3]。

指紋圖譜在現(xiàn)代分析技術的基礎上，可以標示中藥材特征性的圖譜[5]。它具有整體性，能夠全面體現(xiàn)中藥材的化學成分，已成為中藥材控制質(zhì)量、鑒別真?zhèn)蔚闹匾椒╗4]。主成分分析法是應用現(xiàn)代分析軟件SPSS的統(tǒng)計方法[5]，依據(jù)貢獻率大小篩選具有代表性的成分因子。近年來主成分分析法結(jié)合指紋圖譜[6-9]，成為一種獨具特色的多指標評價技術。本研究在對延胡索產(chǎn)地進行實地調(diào)研的基礎上，共收集了30批延胡索藥材，分別產(chǎn)自陜西、浙江、安徽以及江蘇。采用高效液相色譜法建立延胡索藥材指紋圖譜，結(jié)合質(zhì)譜技術和主成分分析法，探討延胡索藥材產(chǎn)地的形成原因，為延胡索今后的開發(fā)利用、科學評價以及質(zhì)量控制提供了基礎實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

延胡索購自各產(chǎn)地，經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)量中心鑒定為CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖，詳細信息見表1。原阿片堿(含量：99.7%，批號：110853-201404)、鹽酸巴馬汀(含量：87.4%，批號：110732-201510)、鹽酸小檗堿(含量86.8%，批號：110713-201613)、延胡索乙素(含量：99.8%，批號：110726-201516)均購自中國食品藥品檢定研究院；鹽酸藥根堿(批號：wkq-00629，含量均>98%)、去氫紫堇堿(批號：wkq16090204，含量均>98%)、紫堇堿(批號：wkq17060802，含量均>98%)均購自四川省維克奇生物科技有限公司；色譜級磷酸、三乙胺、乙腈、甲醇(德國默克股份有限公司)；水為超純水，其他為分析純；高效液相色譜儀(沃特斯公司)，Agilent 1260分析型高效液相色譜儀(安捷倫公司)；Agilent 6210 LC/MSD TOF質(zhì)譜儀(安捷倫公司)，ME204E分析天平(梅特勒-托利多公司)，數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

表1 不同產(chǎn)地延胡索藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 指紋圖譜色譜條件 色譜柱為phenomenex Luna C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；進樣量為10μL；柱溫為30 ℃；檢測波長為280 nm；流速為0.8 mL/min；以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸為流動相B，按0～15 min，10%→17%A；15～65 min，17%→30%A；65～85 min，30%→55%A；85～105 min，55%→80%A；105～115 min，80%→85%A；115～116 min，85%→10%A；116～130 min，10%A進行梯度洗脫。

2.1.2 指認色譜條件 色譜柱為Waters XBridge C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈為流動相A，0.01%氯化銨溶液為流動相B，按0～10 min，10%→17%A；10～25 min，25%A；25～35 min，25%→26%A；35～60 min，26%→95%A進行梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為280 nm。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為ESI (正離子模式)；干燥器溫度為325 ℃；干燥氣流速為10 L/min；毛細管電壓為4.0 kV；掃描質(zhì)核比范圍為100～1 500；自動參比離子為121.050 9和922.009 8。

2.3 溶液的制備

2.3.1 參照物溶液的制備 精密稱取原阿片堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素和紫堇堿對照品適量，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別約為100μg/mL的混合溶液，過0.22μm微孔濾膜，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本品粉末(過三號篩)約0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 指紋圖譜的方法學考察

2.4.1 重復性試驗 取S1樣品，按“2.3.2”項下方法平行制備6份，按“2.1”項下的色譜條件分別檢測，結(jié)果顯示，各峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2.0%，該方法重復性良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取重復性試驗供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件，分別在0，2，4，8，12，16，20，24 h進樣檢測，結(jié)果顯示，各峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3.0%，該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 精密度試驗 取重復性試驗供試品溶液，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件分析連續(xù)進樣6次，結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3.0%，該方法精密度良好。

2.5 色譜峰的指認

取上述供試品溶液，按“2.2”項下條件進行測定。通過色譜峰的保留時間、光譜數(shù)據(jù)以及與對照品進行比對，延胡索藥材指紋圖譜中7個色譜峰得到了明確的指認。根據(jù)保留時間先后，它們分別為原阿片堿、鹽酸藥根堿、延胡索乙素、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿和紫堇堿，如圖1所示，各色譜峰的峰號、保留時間、名稱、CAS號、分子式和結(jié)構(gòu)式見表2。

表2 延胡索藥材指紋圖譜色譜峰的指認

圖1 延胡索藥材指紋圖譜色譜峰指認色譜

2.6 延胡索藥材指紋圖譜的建立

取30批延胡索藥材，按“2.2.3”項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下的色譜條件進樣分析，結(jié)果見表3；將結(jié)果導入國家藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)”，以S1樣品為參照譜，時間窗寬度設為0.10s，計算各產(chǎn)地延胡索與對照指紋圖譜的相似度，結(jié)果見圖2、圖3和表4。結(jié)果表明，30批延胡索藥材中有16個共有峰，各色譜峰相對保留時間RSD值均小于2.0%，相對峰面積RSD值范圍為28.0%～117.2%；30批延胡索藥材相似度范圍為0.835～0.999，四個產(chǎn)地的延胡索質(zhì)量有一定差異。

圖3 不同產(chǎn)地延胡索藥材指紋圖譜疊加

表3 延胡索藥材指紋圖譜共有峰的相對保留時間和相對峰面積結(jié)果

表4 不同產(chǎn)地延胡索藥材指紋圖譜的相似度評價結(jié)果

2.7 主成分分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對不同產(chǎn)地延胡索藥材指紋圖譜的共有峰峰面積進行主成分分析，計算初始因子載荷矩陣及累積貢獻率。

不同產(chǎn)地延胡索藥材指紋圖譜的主成分分析結(jié)果見表5，初始因子載荷矩陣見表6。以特征值>1為界限，提取到4個主成分，其累計方差貢獻率為84.72%。由表7可知，第1主成分的特征根為7.448，累計貢獻率為46.55%，成分4、5、7、8、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿及16在第1主成分上有較高載荷，說明第1主成分主要反映了以上8個成分的信息；第2主成分特征根為2.663，累計貢獻率為16.64%，主要反映了2、原阿片堿、鹽酸藥根堿、7、12及15成分的信息。以主成分為變量得到載荷圖和得分圖，見圖5。由載荷圖可知，距離原點較遠的是主成分1和2中權(quán)重值大的成分，其在決定產(chǎn)地差異上具有重大作用。由得分圖可知，整體上各產(chǎn)地延胡索藥材分布比較集中，S22樣品比較離群。

注：峰3：原阿片堿；峰6：鹽酸藥根堿；峰9：鹽酸巴馬??；峰10：鹽酸小檗堿；峰11：去氫紫堇堿；峰13：延胡索乙素；峰14：紫堇堿。

表5 主成分分析結(jié)果

表6 初始因子載荷矩陣

圖4 不同產(chǎn)地延胡索的載荷圖(上)和得分圖(下)

2.8 不同產(chǎn)地延胡索藥材的綜合評價

用4個主成分對不同產(chǎn)地的延胡索藥材進行綜合評價，計算綜合得分，結(jié)果如表7所示。由表7可知，排名前10的樣品中，有陜西、浙江、安徽、江蘇產(chǎn)地的樣品各7批、1批、2批、0批；分別占其總樣品數(shù)的46.7%、11.1%、66.7%及0；排名前20的樣品中，陜西、浙江、安徽、江蘇產(chǎn)地的樣品各12、3、3、2批，分別占其總樣品數(shù)的80%、33.3%、100%及66.7%。

表7 不同產(chǎn)地延胡索藥材綜合得分結(jié)果 (n=30)

3 討論

不同產(chǎn)地的延胡索藥材指紋圖譜有16個共有峰，應用質(zhì)譜共指認了7個色譜峰，它們分別為原阿片堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素和紫堇堿。根據(jù)準分子離子峰信息，并結(jié)合文獻，在總離子流圖中，保留時間為19.454 min的色譜峰在一級質(zhì)譜圖中給出m/z356.187 8，為準分子離子峰[M+H]+(C21H25NO4)，推測其可能為四氫巴馬汀[11-13]；保留時間為12.077 min的色譜峰在一級質(zhì)譜圖中給出m/z342.172 7，為準分子離子峰[M+H]+(C20H23NO4)，推測其可能為四氫非洲防己胺[10-14]。

延胡索自然分布在浙江、安徽、江蘇、湖北、河南一帶。500年前開始在江蘇茅山栽培，后向南遷移至杭州，最后又向南遷移至浙江中部的東陽、磐安一帶，后續(xù)形成有名的“浙八味”之一[15]。現(xiàn)代所用的元胡絕大部分來自栽培品，并以浙江東陽一帶所產(chǎn)為道地，我國不少地區(qū)引種栽培都獲得了成功，如陜西、四川等地。陜西引種的延胡索主要分布在陜南漢中一帶，以漢中市城固縣董家營村的延胡索栽培為漢中市延胡索引種成功的典范。從相似度、得分圖及綜合得分結(jié)果來看，三者相互印證，相似度較低的S22樣品，得分圖中較離群，綜合得分較低，排名靠后。從相似度、得分圖可以看出，15批產(chǎn)自陜西的延胡索藥材整體與浙江產(chǎn)地的延胡索較接近，這也間接說明陜西漢中市延胡索引種的成功。當然，影響中藥材的質(zhì)量是多方面的，比如氣候、環(huán)境、生長年限以及藥農(nóng)的栽培等因素，所以建立具有專屬性和特征性的評價體系是非常有必要的。

本研究通過全波3D掃描優(yōu)選延胡索藥材指紋圖譜最佳吸收波長，考察了不同流動相系統(tǒng)(乙腈-0.1%磷酸(三乙胺調(diào)pH值至6.0)、乙腈-0.1%磷酸(0.22%三乙胺)、乙腈-1%醋酸-醋酸銨緩沖液(pH6.0))、不同柱溫(25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃)、不同流速(0.7 mL/min、0.8 mL/min、0.9 mL/min、1.0 mL/min)，最終以“柱溫為30 ℃；檢測波長為280 nm；流速為0.8 mL/min；以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸為流動相B”色譜條件時，指紋圖譜色譜峰的分離度、對稱因子以及峰的個數(shù)較優(yōu)；考察了不同提取溶劑(水、稀乙醇、70%乙醇、甲醇、濃氨試液-甲醇(1∶20))、提取方式(超聲、回流)、提取時間(20 min、30 min、40 min)，最終以“稀乙醇為提取溶劑，超聲處理為提取方式，提取30 min”色譜峰的個數(shù)較多，對稱因子較好。