款冬花炮制后咖啡?？鼘幩犷惢衔锖孔兓芯?/h1>
2021-11-18 08:41:10吳琪珍
亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥 2021年10期
吳琪珍
(贛南衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，江西 贛州 341000)
款冬花是菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾，歸肺經(jīng)，主治潤肺下氣，止咳化痰，用于新久咳嗽，喘咳痰多，勞嗽咳血[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》稱款冬花為“治嗽之最”，尤其是款冬具有甘溫清補(bǔ)的功效，因此為臨床常用止咳藥物[2]?？疃ㄖ泻休祁?、酚酸類、黃酮類、生物堿類、多糖類、甾醇類等成分，其中倍半萜類成分款冬酮為《中華人民共和國藥典》的含量指標(biāo)性成分，目前對(duì)款冬花的成分分析研究主要集中于款冬酮和吡咯里西啶生物堿[3-4]，但對(duì)其他類型成分的含量研究較少。
款冬花中含有大量的咖啡酰奎寧酸類化合物，包括綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B與異綠原酸C等，研究[5]表明，這些化合物可顯著抑制小鼠咳嗽頻率，提高小鼠酚紅分泌水平及抗炎效果，具有良好的止咳化痰活性。款冬花的現(xiàn)代炮制方法為蜜炙，蜜炙后可提高藥物療效，增強(qiáng)潤肺止咳效果[6]?，F(xiàn)代藥理研究[7]表明，款冬花生品與蜜炙品的水提物均有一定止咳作用。HPLC指紋圖譜分析研究[8]表明，綠原酸、異綠原酸A等10個(gè)化合物是款冬花生品與蜜炙品差異的主要標(biāo)志物，基于NMR代謝組學(xué)技術(shù)的研究[9]發(fā)現(xiàn)，款冬花經(jīng)過蜜炙后，綠原酸、咖啡酸等有機(jī)酸的量有所降低。此外，款冬花古代也有甘草水浸的方法?？疃ń?jīng)甘草汁制后，總生物堿含量顯著減少，可降低毒性[10]。
本研究通過高效液相色譜法，對(duì)款冬花中4種咖啡?？鼘幩犷惢衔?綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B與異綠原酸C)進(jìn)行分析，明確款冬花炮制后咖啡?？鼘幩犷惢衔锖孔兓⒈容^不同炮制方法對(duì)其的影響，以期為該類化合物的止咳活性研究提供參考。
1 儀器與材料
1.1 儀器
1260型高效液相色譜儀(美國Angilent公司)；CPA225D 型 1 /10 萬分析天平(德國 Sartorius公司)；KQ-500E 臺(tái)式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
1.2 材料
對(duì)照品綠原酸(批號(hào)：J0120AS)、異綠原酸A(批號(hào)：D1018AS)、異綠原酸B(批號(hào)：J0202AS)、異綠原酸C(批號(hào)：M1123AS)均來自美倫生物技術(shù)有限公司，甲醇為色譜純(德國MERCK公司)，乙醇為分析純(西隴科學(xué))。
款冬花中藥材購自安徽亳州藥材市場，經(jīng)贛南衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院吳琪珍鑒定為菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾。
2 方法與結(jié)果
2.1 款冬花炮制及浸膏制備
2.1.1 款冬花炮制 蜜款冬花：取凈款冬花50 g，加入煉蜜12.5 g，潤透，文火炒至不粘手，表面棕黃色，炒后蜜炙款冬花成品為50.1 g。
甘草制款冬花：取3 g甘草飲片，加水煎煮2次，合并煎液得30 mL，再加入凈款冬花50 g，浸潤24 h，烘箱60 ℃干燥，干燥后甘草制款冬花的成品為49.8 g。
2.1.2 款冬花浸膏制備 取款冬花生品20 g，加入6倍量體積70%乙醇，于60 ℃回流提取2 h，過濾后藥材繼續(xù)用5倍量體積70%乙醇回流提取1 h，重復(fù)2次，合并提取液，回收乙醇，水浴干燥，得到款冬花浸膏(KD-生品)。按同樣方法，制得蜜款冬花浸膏(KD-蜜炙)與甘草汁制款冬花浸膏(KD-甘草)。
2.2 色譜條件
色譜柱Welch Ultimate XB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相：0.1%甲酸(A)-甲醇(B)，流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量10 μL，梯度洗脫(0～8 min，85%～75% A；8～20 min，75%～70% A；20～21 min，70%～61% A；21～30 min，61%～60% A；30～35 min，60%～52% A；35～41 min，52% A；41～45 min，52%～40% A)，檢測波長326 nm。
2.3 溶液制備
2.3.1 對(duì)照品溶液制備 取綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B與異綠原酸C對(duì)照品適量，精密稱定，置同一容量瓶中，加入50%甲醇制成濃度依次為94.0、84.8、88.8、93.2 μg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。其他質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品由50%甲醇稀釋對(duì)照品儲(chǔ)備液得到。
2.3.2 供試品溶液制備 取“2.1”項(xiàng)下樣品KD-生品15 mg置10 mL容量瓶中，精密稱定，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。
2.4 方法學(xué)考察
2.4.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，4個(gè)成分理論塔板數(shù)均大于5 000，各色譜峰分離良好，分離度大于1.5。對(duì)照品溶液與供試品溶液色譜見圖1。
注：1.綠原酸；2.異綠原酸B；3.異綠原酸A；4.異綠原酸C。
2.4.2 檢測限與定量限 在色譜條件下，通過稀釋不同濃度的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液得到各個(gè)化合物的檢測限與定量限。見表1。
2.4.3 線性和范圍考察 取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，逐步稀釋2倍，得到系列對(duì)照品溶液。精密吸取10 μL進(jìn)樣并測定峰面積，以峰面積(Y)對(duì)分析物濃度(X)作線性回歸曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。見表1。
表1 款冬花中4種分析物的線性曲線、線性范圍及定量限和檢測限
2.4.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一份混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。4種化合物的RSD值范圍均在0.17%～1.75%，表明精密度良好。
2.4.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取KD-生品浸膏6份，按“2.3.2”制備成供試品溶液，測定峰面積，計(jì)算 4種咖啡?？鼘幩犷惓煞值暮?，其含量RSD范圍均在 0.47%～0.70%，表明方法重復(fù)性良好。
2.4.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液10 μL，依次于0 h、4 h、6 h、8 h、12 h、16 h、24 h進(jìn)樣，測定峰面積。4種化合物的RSD值范圍均在0.11%～0.40%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.4.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品15 mg，平行6份，分別精密加入一定量的混合對(duì)照品溶液(約1∶1)，按照“2.3.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，依法進(jìn)樣，計(jì)算回收率。見表2。
表2 加樣回收測定結(jié)果 (n=6)
2.5 樣品含量測定
分別精密稱取款冬花生品、蜜炙品及甘草汁制品浸膏，按“2.3.2”項(xiàng)制成供試品溶液，進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算含量。見表3、圖2。
表3 款冬花炮制后4種化合物的含量 (μg/mg)
圖2 款冬花炮制后咖啡?？鼘幩犷惢衔锟偤?/p>
3 討論
咖啡?？鼘幩犷惢衔镏饕獧z測方法有高效液相色譜法、超高效液相色譜及液質(zhì)聯(lián)用色譜等[11]，其中HPLC簡便易得，可準(zhǔn)確對(duì)款冬花中咖啡?？鼘幩犷惢衔镞M(jìn)行定量鑒別。綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B及異綠原酸C為款冬花主要成分，其中三個(gè)異綠原酸成分為同分異構(gòu)體，在加熱過程中會(huì)相互異構(gòu)化[12]，這為含量檢測帶來了一定難度。為保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確性及樣品穩(wěn)定性，本次檢測方法選擇了先將款冬花提取物干燥，得到浸膏再進(jìn)行檢測。
本研究結(jié)果表明，款冬花經(jīng)過炮制后，蜜炙品與甘草制品的4種咖啡酰奎寧酸類化合物含量均低于款冬花生品。從浸膏中4種成分總含量看，KD-生品(7.78%)、KD-蜜炙(4.03%)、KD-甘草(1.68%)，經(jīng)過炮制后，款冬花其他成分浸提量增加，而咖啡酰奎寧酸類化合物濃度降低。從藥材總含量看，款冬花蜜炙品總含量為生品的76%，甘草制品為生品的28.7%。因此，經(jīng)炮制后，款冬花蜜炙品與甘草制品的含量均有下降。尤其是甘草汁浸款冬花對(duì)該類成分的影響極大，這或許影響了款冬花的止咳活性。臨床也極少見到將款冬花經(jīng)甘草炮制用于止咳的應(yīng)用。
隨著現(xiàn)代生產(chǎn)工藝的發(fā)展，款冬花傳統(tǒng)的炮制方法也得以改良。例如，劉效栓等[13]通過正交實(shí)驗(yàn)法改良了款冬花蜜炙的用蜜含量和炒炙溫度；宋藝君等[14-15]優(yōu)化了蜜款冬花微波炮制工藝，以及甘草制款冬花的微波炮制工藝。本研究可進(jìn)一步為款冬花的炮制工藝改良提供借鑒，今后還應(yīng)結(jié)合款冬花的止咳藥效藥理研究，深入探索款冬花炮制原理及工藝優(yōu)化。
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本研究通過高效液相色譜法，對(duì)款冬花中4種咖啡?？鼘幩犷惢衔?綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B與異綠原酸C)進(jìn)行分析，明確款冬花炮制后咖啡?？鼘幩犷惢衔锖孔兓⒈容^不同炮制方法對(duì)其的影響，以期為該類化合物的止咳活性研究提供參考。
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對(duì)照品綠原酸(批號(hào)：J0120AS)、異綠原酸A(批號(hào)：D1018AS)、異綠原酸B(批號(hào)：J0202AS)、異綠原酸C(批號(hào)：M1123AS)均來自美倫生物技術(shù)有限公司，甲醇為色譜純(德國MERCK公司)，乙醇為分析純(西隴科學(xué))。
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2.1.1 款冬花炮制 蜜款冬花：取凈款冬花50 g，加入煉蜜12.5 g，潤透，文火炒至不粘手，表面棕黃色，炒后蜜炙款冬花成品為50.1 g。
甘草制款冬花：取3 g甘草飲片，加水煎煮2次，合并煎液得30 mL，再加入凈款冬花50 g，浸潤24 h，烘箱60 ℃干燥，干燥后甘草制款冬花的成品為49.8 g。
2.1.2 款冬花浸膏制備 取款冬花生品20 g，加入6倍量體積70%乙醇，于60 ℃回流提取2 h，過濾后藥材繼續(xù)用5倍量體積70%乙醇回流提取1 h，重復(fù)2次，合并提取液，回收乙醇，水浴干燥，得到款冬花浸膏(KD-生品)。按同樣方法，制得蜜款冬花浸膏(KD-蜜炙)與甘草汁制款冬花浸膏(KD-甘草)。
2.2 色譜條件
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2.3 溶液制備
2.3.1 對(duì)照品溶液制備 取綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B與異綠原酸C對(duì)照品適量，精密稱定，置同一容量瓶中，加入50%甲醇制成濃度依次為94.0、84.8、88.8、93.2 μg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。其他質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品由50%甲醇稀釋對(duì)照品儲(chǔ)備液得到。
2.3.2 供試品溶液制備 取“2.1”項(xiàng)下樣品KD-生品15 mg置10 mL容量瓶中，精密稱定，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。
2.4 方法學(xué)考察
2.4.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，4個(gè)成分理論塔板數(shù)均大于5 000，各色譜峰分離良好，分離度大于1.5。對(duì)照品溶液與供試品溶液色譜見圖1。
注：1.綠原酸；2.異綠原酸B；3.異綠原酸A；4.異綠原酸C。
2.4.2 檢測限與定量限 在色譜條件下，通過稀釋不同濃度的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液得到各個(gè)化合物的檢測限與定量限。見表1。
2.4.3 線性和范圍考察 取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，逐步稀釋2倍，得到系列對(duì)照品溶液。精密吸取10 μL進(jìn)樣并測定峰面積，以峰面積(Y)對(duì)分析物濃度(X)作線性回歸曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。見表1。
表1 款冬花中4種分析物的線性曲線、線性范圍及定量限和檢測限
2.4.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一份混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。4種化合物的RSD值范圍均在0.17%～1.75%，表明精密度良好。
2.4.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取KD-生品浸膏6份，按“2.3.2”制備成供試品溶液，測定峰面積，計(jì)算 4種咖啡?？鼘幩犷惓煞值暮?，其含量RSD范圍均在 0.47%～0.70%，表明方法重復(fù)性良好。
2.4.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液10 μL，依次于0 h、4 h、6 h、8 h、12 h、16 h、24 h進(jìn)樣，測定峰面積。4種化合物的RSD值范圍均在0.11%～0.40%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.4.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品15 mg，平行6份，分別精密加入一定量的混合對(duì)照品溶液(約1∶1)，按照“2.3.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，依法進(jìn)樣，計(jì)算回收率。見表2。
表2 加樣回收測定結(jié)果 (n=6)
2.5 樣品含量測定
分別精密稱取款冬花生品、蜜炙品及甘草汁制品浸膏，按“2.3.2”項(xiàng)制成供試品溶液，進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算含量。見表3、圖2。
表3 款冬花炮制后4種化合物的含量 (μg/mg)
圖2 款冬花炮制后咖啡?？鼘幩犷惢衔锟偤?/p>
3 討論
咖啡?？鼘幩犷惢衔镏饕獧z測方法有高效液相色譜法、超高效液相色譜及液質(zhì)聯(lián)用色譜等[11]，其中HPLC簡便易得，可準(zhǔn)確對(duì)款冬花中咖啡?？鼘幩犷惢衔镞M(jìn)行定量鑒別。綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B及異綠原酸C為款冬花主要成分，其中三個(gè)異綠原酸成分為同分異構(gòu)體，在加熱過程中會(huì)相互異構(gòu)化[12]，這為含量檢測帶來了一定難度。為保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確性及樣品穩(wěn)定性，本次檢測方法選擇了先將款冬花提取物干燥，得到浸膏再進(jìn)行檢測。
本研究結(jié)果表明，款冬花經(jīng)過炮制后，蜜炙品與甘草制品的4種咖啡酰奎寧酸類化合物含量均低于款冬花生品。從浸膏中4種成分總含量看，KD-生品(7.78%)、KD-蜜炙(4.03%)、KD-甘草(1.68%)，經(jīng)過炮制后，款冬花其他成分浸提量增加，而咖啡酰奎寧酸類化合物濃度降低。從藥材總含量看，款冬花蜜炙品總含量為生品的76%，甘草制品為生品的28.7%。因此，經(jīng)炮制后，款冬花蜜炙品與甘草制品的含量均有下降。尤其是甘草汁浸款冬花對(duì)該類成分的影響極大，這或許影響了款冬花的止咳活性。臨床也極少見到將款冬花經(jīng)甘草炮制用于止咳的應(yīng)用。
隨著現(xiàn)代生產(chǎn)工藝的發(fā)展，款冬花傳統(tǒng)的炮制方法也得以改良。例如，劉效栓等[13]通過正交實(shí)驗(yàn)法改良了款冬花蜜炙的用蜜含量和炒炙溫度；宋藝君等[14-15]優(yōu)化了蜜款冬花微波炮制工藝，以及甘草制款冬花的微波炮制工藝。本研究可進(jìn)一步為款冬花的炮制工藝改良提供借鑒，今后還應(yīng)結(jié)合款冬花的止咳藥效藥理研究，深入探索款冬花炮制原理及工藝優(yōu)化。
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