皮膚腐蝕和皮膚刺激替代試驗(yàn)的發(fā)展及其在化學(xué)品危險(xiǎn)性分類(lèi)的應(yīng)用

潘敘恩,盧章順,楊 光,鐘 岸,黃志鵬,何志榮

(廣東省科學(xué)院測(cè)試分析研究所(中國(guó)廣州分析測(cè)試中心),廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省分析測(cè)試技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室,廣州 510070)

近現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)高速發(fā)展,目前全球已公布的物質(zhì)已超過(guò)了1.5 億種[1],化學(xué)品的廣泛應(yīng)用一方面改善了人們的生活,同時(shí)也提高了人們接觸化學(xué)品帶來(lái)的安全風(fēng)險(xiǎn)。 皮膚腐蝕性和刺激性是化學(xué)品基于聯(lián)合國(guó)GHS 分類(lèi)的一種重要的潛在危險(xiǎn)特性,準(zhǔn)確評(píng)估和分類(lèi)化學(xué)品對(duì)皮膚的腐蝕和刺激潛力,對(duì)加強(qiáng)化學(xué)品安全管理,預(yù)防和減少化學(xué)品事故,具有非常重要的意義。

長(zhǎng)期以來(lái),研究人員主要利用動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)該課題進(jìn)行研究,Draize 等[2]建立了利用白化兔評(píng)估化妝品對(duì)皮膚刺激潛力的方法,該方法逐步發(fā)展并在化學(xué)品皮膚腐蝕性和刺激性評(píng)估中得到廣泛的應(yīng)用,后來(lái)被經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)采用為試驗(yàn)準(zhǔn)則404(TG404),成為GHS 皮膚腐蝕性和刺激性的分類(lèi)依據(jù)。

隨著人類(lèi)認(rèn)知水平的提高和現(xiàn)代倫理學(xué)的發(fā)展,動(dòng)物福利問(wèn)題得到了越來(lái)越多的重視,作為傳統(tǒng)的動(dòng)物試驗(yàn),Draize 試驗(yàn)備受質(zhì)疑和爭(zhēng)議。 1959年,動(dòng)物學(xué)家Russell 和微生物學(xué)家Burch 共同發(fā)表了《人道實(shí)驗(yàn)技術(shù)原則》(The Principles of Humane Experimental Technique),系統(tǒng)性地提出了“3R”(Replacement, Reduction and Reduction)的概念和準(zhǔn)則,促使動(dòng)物試驗(yàn)的開(kāi)展更符合人道主義精神[3]?！?R”的提出為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代技術(shù)的研究確立了理論基礎(chǔ),替代試驗(yàn)的研究和應(yīng)用逐漸成為化學(xué)品皮膚腐蝕/刺激潛力評(píng)估和分類(lèi)的主要發(fā)展方向。

1 替代試驗(yàn)的發(fā)展背景

為貫徹3R 原則,各國(guó)政府和國(guó)際組織進(jìn)行了大量的工作:一方面,先后將3R 原則引入了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)的法律法規(guī)以改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的待遇,如中國(guó)《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》、歐盟《關(guān)于保護(hù)用于科研目的的動(dòng)物的指令》、美國(guó)《美國(guó)政府關(guān)于在試驗(yàn)、研究和訓(xùn)練中使用和照顧脊椎動(dòng)物的原則》、英國(guó)《動(dòng)物(科學(xué)程序)法案》等[4]。 另一方面,為減少科研活動(dòng)對(duì)動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)的依賴(lài),資助了大批的研究機(jī)構(gòu)、組織和研究項(xiàng)目以支持替代方法的研究,并成立了替代方法驗(yàn)證中心組織系統(tǒng)性的方法驗(yàn)證,如歐盟成立的歐洲替代方法驗(yàn)證中心(ECVAM;后更名為替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)歐盟聯(lián)合參考實(shí)驗(yàn)室EURL ECVAM)和美國(guó)的替代方法驗(yàn)證跨部門(mén)協(xié)調(diào)委員會(huì)(ICCVAM)等。 隨著歐盟和美國(guó)、加拿大、日本等國(guó)簽署了替代方法國(guó)際合作協(xié)議( International Cooperation on Alternative Test Methods,ICATM),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代技術(shù)進(jìn)入了快速發(fā)展的階段。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代技術(shù)的進(jìn)步,使立法禁止動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)得以成為可能。 在歐盟,有許多法規(guī)要求使用替代方法來(lái)代替體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行毒理學(xué)測(cè)試。 歐盟《化妝品法規(guī)》[5]禁止了2004 年以來(lái)的化妝品成品和2009 年以來(lái)的化妝品成分進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn),并自2013 年起禁止銷(xiāo)售含有經(jīng)動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)成分的化妝品產(chǎn)品。 此外,歐盟《關(guān)于化學(xué)品注冊(cè)、評(píng)估、許可和限制的法規(guī)》(REACH 法規(guī))[6-7]要求OECD 成員國(guó)對(duì)化學(xué)品的皮膚腐蝕和刺激性評(píng)估需利用替代方法進(jìn)行體外試驗(yàn),除非該受試化學(xué)品不在替代方法適用的范圍內(nèi)或替代方法無(wú)法對(duì)受試化學(xué)品作出準(zhǔn)確的分類(lèi)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。 歐盟《物質(zhì)和混合物的分類(lèi)、標(biāo)簽和包裝法規(guī)》(EU CLP)[8-9]與REACH 法規(guī)相輔相成,在歐盟范圍內(nèi)執(zhí)行聯(lián)合國(guó)GHS 制度關(guān)于化學(xué)品分類(lèi)和標(biāo)簽的規(guī)定,該法規(guī)在皮膚腐蝕和刺激性分層評(píng)估中使用了證據(jù)權(quán)重(weight-of-evidence,WoE)方法,并鼓勵(lì)利用來(lái)自替代方法的數(shù)據(jù)。 最后,歐盟《關(guān)于保護(hù)用于科研目的的動(dòng)物的指令》[10]規(guī)定“在不妨礙禁止某些試驗(yàn)方法的成員國(guó)法律的前提下,如利用其它試驗(yàn)方法或策略可以得到所需的結(jié)果時(shí),成員國(guó)不得利用活體動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)”。 歐盟的立法對(duì)全球各國(guó)的法規(guī)也產(chǎn)生了巨大的影響,以色列、挪威、印度、新西蘭、澳大利亞、瑞士等國(guó)也先后立法禁止了化妝品產(chǎn)品進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn),全球目前已有超過(guò)30 個(gè)國(guó)家和地區(qū)實(shí)施了關(guān)于動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)的相關(guān)禁令。

2 分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)替代試驗(yàn)的認(rèn)可

聯(lián)合國(guó)GHS 的分類(lèi)制度是目前世界范圍內(nèi)最具普適性的化學(xué)品分類(lèi)制度,對(duì)皮膚腐蝕性和刺激性化學(xué)品進(jìn)行了明確的定義和分類(lèi)(見(jiàn)表1)[11],源于OECD 統(tǒng)一分類(lèi)和標(biāo)簽工作組(OECD Task Force on Harmonization of Classification and Labelling,Task Force on HCL)對(duì)健康危害的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。

表1 聯(lián)合國(guó)GHS 分類(lèi)制度關(guān)于皮膚腐蝕性/刺激性的定義和分類(lèi)Table 1 Categories and definition of skin corrosion/irritation of UN GHS

在較早版本的GHS 中,針對(duì)化學(xué)品的皮膚腐蝕和皮膚刺激的定義和分類(lèi)仍基于OECD TG 404 的動(dòng)物試驗(yàn)。 得益于各國(guó)政府和科研工作者的努力,越來(lái)越多的體外方法被提出和驗(yàn)證成為OECD 的試驗(yàn)準(zhǔn)則,用于替代 TG 404 的動(dòng)物試驗(yàn)。 目前經(jīng)OECD 認(rèn)可的替代試驗(yàn)方法涵蓋了離體組織或器官、三維重組人類(lèi)細(xì)胞組織和人造生物皮膚等模型(見(jiàn)表2),已能基本滿(mǎn)足聯(lián)合國(guó)GHS 的分類(lèi)和評(píng)估需要。 在2019 年修訂的第八版GHS 中,這些替代試驗(yàn)方法得到了進(jìn)一步的認(rèn)可被正式列為分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),用于皮膚腐蝕(類(lèi)別1)、皮膚刺激(類(lèi)別2)的識(shí)別。

表2 OECD 關(guān)于皮膚腐蝕性和刺激性替代試驗(yàn)方法的驗(yàn)證和認(rèn)可情況Table 2 Validation and acceptance of OECD on the alternative testing methods of skin corrosion and irritation

3 皮膚腐蝕和刺激的試驗(yàn)和評(píng)估綜合方法

在GHS 第八修訂版中,除了對(duì)體外試驗(yàn)方法的進(jìn)一步認(rèn)可外,還引入了新的分類(lèi)和評(píng)估策略——皮膚腐蝕和刺激IATA。 該策略源于OECD 指南GD 203,其建立的目的是為了適應(yīng)替代方法發(fā)展的新形勢(shì),滿(mǎn)足3R 原則和保障分類(lèi)評(píng)估準(zhǔn)確性的要求,取代原來(lái) OECD TG404 補(bǔ)充文件中的測(cè)試和評(píng)估策略。

皮膚腐蝕和刺激IATA 主要分為3 個(gè)部分:(1)現(xiàn)有的信息、理化性質(zhì)和非實(shí)驗(yàn)方法;(2)證據(jù)權(quán)重評(píng)估;(3)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。 根據(jù)數(shù)據(jù)和信息的來(lái)源及功能,該評(píng)估策略的信息源被分為8 個(gè)模塊,這些模塊可分別應(yīng)用于策略中的一個(gè)或多個(gè)部分(見(jiàn)表 3)[12]。 OECD GD203 指出,該評(píng)估策略的目標(biāo)是在確保人身安全的前提下盡可能減少對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用,提出在分類(lèi)和評(píng)估的過(guò)程中,應(yīng)最大程度運(yùn)用現(xiàn)有的數(shù)據(jù)合理安排證據(jù)權(quán)重評(píng)估,只有在無(wú)法獲得準(zhǔn)確結(jié)果時(shí)再利用試驗(yàn)進(jìn)行分類(lèi)。

表3 皮膚腐蝕性和刺激性IATA 的組成Table 3 Composition of the IATA for skin corrosion and irritation

4 替代試驗(yàn)在皮膚腐蝕和刺激IATA 中的應(yīng)用

替代試驗(yàn)在皮膚腐蝕和刺激IATA 中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面:首先,作為IATA 第一部分現(xiàn)有皮膚腐蝕和刺激屬數(shù)據(jù)的重要組成部分,基于文獻(xiàn)和資料所得的替代試驗(yàn)數(shù)據(jù)可獨(dú)立用于WoE 評(píng)估或結(jié)合人類(lèi)數(shù)據(jù)和動(dòng)物試驗(yàn)數(shù)據(jù)等其他模塊的信息用于綜合WoE 評(píng)估。 其次,皮膚腐蝕和刺激替代試驗(yàn)也是該分類(lèi)評(píng)估策略第三部分補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)的重要組成部分,研究人員可對(duì)WoE 評(píng)估無(wú)法獲得確證結(jié)果的化學(xué)品執(zhí)行自上而下或自下而上的試驗(yàn)策略,利用體外試驗(yàn)方法(必要時(shí)結(jié)合動(dòng)物試驗(yàn))進(jìn)行最終的分類(lèi)和評(píng)估。

在應(yīng)用這些替代試驗(yàn)方法之前必須明確,目前已經(jīng)得到認(rèn)可的方法都存在著一定的局限性,至今仍然沒(méi)有任何一種單一的體外試驗(yàn)方法可以覆蓋全部分類(lèi)范圍。 充分理解每種方法的原理、適用范圍和局限性,對(duì)于研究人員選擇合適的方法非常重要,是有效執(zhí)行皮膚腐蝕和刺激IATA 評(píng)估策略的關(guān)鍵。

5 OECD 認(rèn)可的皮膚腐蝕/刺激替代試驗(yàn)方法及其適用性

5.1 經(jīng)皮電阻試驗(yàn)方法

TG430[13]體外皮膚腐蝕經(jīng)皮電阻(transcutaneous electrical resistance,TER)試驗(yàn)方法利用了離體的大鼠表皮組織對(duì)化學(xué)品的皮膚腐蝕性進(jìn)行評(píng)估。 受試皮膚片取自安樂(lè)處死的28~30 d齡的大鼠。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,受試皮膚片安裝在測(cè)試系統(tǒng)中,把整個(gè)測(cè)試系統(tǒng)分隔為內(nèi)外兩層。 受試物涂覆在受試皮膚片的表皮面,保持24 h。 通過(guò)測(cè)定受試皮膚片的經(jīng)皮電阻,確定角質(zhì)層的缺失程度和皮膚屏障功能的完整程度來(lái)識(shí)別受試物的腐蝕性。根據(jù)大量化學(xué)品的大鼠TER 測(cè)試結(jié)果,選取了5 kΩ 作為皮膚腐蝕性的判定閾值。 通常,無(wú)論對(duì)皮膚是否具有刺激性,對(duì)活體動(dòng)物皮膚無(wú)腐蝕性的物質(zhì),其TER 值都不會(huì)低于該判定閾值。 該方法還增加了染色試驗(yàn),進(jìn)一步對(duì)TER 測(cè)試陽(yáng)性(包括TER接近5 kΩ 的結(jié)果)但無(wú)明顯損傷的皮膚片進(jìn)行確認(rèn)。

與其他已得到OECD 認(rèn)可的替代試驗(yàn)相比,TG430 利用的離體皮膚模型包含了提供主要屏障功能的角質(zhì)層和表皮細(xì)胞層,以及皮脂腺、汗腺和毛囊等所有附屬器官,具有完整的皮膚組織結(jié)構(gòu),可更近似地模擬化學(xué)品在體內(nèi)發(fā)生的經(jīng)皮滲透和吸收。 但是,該方法只能劃分皮膚腐蝕(類(lèi)別1)和非腐蝕性的樣品,適用于大量化學(xué)品腐蝕危險(xiǎn)性的篩查,并不能進(jìn)一步劃分皮膚腐蝕性子類(lèi)別,也不能識(shí)別非腐蝕性的樣品是否具有刺激性。

5.2 重建人類(lèi)表皮模型試驗(yàn)方法

目前已驗(yàn)證的利用體外重建人類(lèi)表皮模型(reconstructed human epidermis test method,RhE)的皮膚腐蝕和刺激性試驗(yàn)方法有 TG431[14]和TG439[15],其原理是假設(shè)腐蝕/刺激性化學(xué)物質(zhì)能夠通過(guò)擴(kuò)散或侵蝕作用滲透穿過(guò)角質(zhì)層,對(duì)下層的細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。 該模型是利用組織工程學(xué)技術(shù)構(gòu)建的多層、高度分化的三維表皮模型,包含了基底層、棘細(xì)胞層、顆粒層、角質(zhì)層和脂質(zhì)等與正常皮膚相似的結(jié)構(gòu)。 由于TG431 和 TG439 的 RhE 模型沒(méi)有形成血管,因此選擇了以細(xì)胞活性作為測(cè)定終點(diǎn)對(duì)細(xì)胞和組織的損傷進(jìn)行評(píng)估。

TG431 用于化學(xué)品的皮膚腐蝕性的評(píng)估,方法是將受試物局部作用在三維RhE 模型上,在特定作用時(shí)間后,利用3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍(lán)(MTT)還原法測(cè)量受試RhE 組織的細(xì)胞活性,然后通過(guò)與閾值的比較來(lái)識(shí)別和分類(lèi)受試物腐蝕性。

TG439 用于評(píng)估化學(xué)品的皮膚刺激性,該方法進(jìn)一步利用了RhE 模型的特點(diǎn),在試驗(yàn)過(guò)程中并不是在與受試物作用后立即測(cè)量RhE 組織的細(xì)胞活性,而是對(duì)經(jīng)過(guò)沖洗的RhE 組織在新培養(yǎng)基中進(jìn)行足夠長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)之后才進(jìn)行細(xì)胞活性的測(cè)量。這樣既可以使RhE 組織從較弱的細(xì)胞毒性作用中恢復(fù),也有足夠的時(shí)間表達(dá)明確的細(xì)胞毒性作用。

與其他已獲得OECD 認(rèn)可的替代方法相比,TG431 和 TG439 具有很多優(yōu)勢(shì)。 首先,RhE 模型是由人源性的表皮角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)所得,與被模擬的人體皮膚組織不存在物種差異。 其次,RhE 組織可以通過(guò)培養(yǎng)恢復(fù)細(xì)胞活性,TG439 是目前唯一受OECD 認(rèn)可的評(píng)估皮膚刺激性(類(lèi)別2)的替代方法。 最后,RhE 試驗(yàn)方法有很多可選用的商業(yè)化模型,TG431 和 TG439 分別于 2019 年和 2020 年進(jìn)行了最新的修訂,目前最新版本的試驗(yàn)準(zhǔn)則中已得到驗(yàn)證和認(rèn)可的商業(yè)化模型已分別增至5 個(gè)和6 個(gè)(TG431: EpiSkinTM、 EpiDermTMSCT、 SkinEthicTMRHE、epiCS?、LabCyte EPI-MODEL24 SCT;TG439:EpiSkinTM( SM )、 EpiDermTMSIT ( EPI-200 )、SkinEthicTMRHE、 LabCyte EPI-MODEL24 SIT、epiCS?、Skin+?)。

需要注意的是有些化學(xué)品會(huì)在試驗(yàn)過(guò)程中顯色或能與MTT 作用產(chǎn)生非特異的顏色反應(yīng),干擾細(xì)胞活力的測(cè)定結(jié)果,雖然通過(guò)設(shè)置非特異性顯色(NSCliving)和非特異性MTT 反應(yīng)(NSMTT)對(duì)照組可對(duì)這些干擾進(jìn)行排除,但是針對(duì)陰性對(duì)照NSCliving≥50%和/或NSMTT≥50%的結(jié)果應(yīng)十分謹(jǐn)慎。 此外,TG431 和TG439 的分類(lèi)能力仍存在著局限性,TG431 可用于識(shí)別化學(xué)品皮膚腐蝕性(類(lèi)別1 及子類(lèi)別1A 和1B/1C)和非腐蝕性,但無(wú)法進(jìn)一步分辨子類(lèi)別1B 和1C;TG439 可以區(qū)分皮膚腐蝕/刺激(類(lèi)別1/2)和皮膚輕度刺激/非刺激(類(lèi)別3/不劃類(lèi)),但不能進(jìn)一步對(duì)類(lèi)別1 和類(lèi)別2 進(jìn)行識(shí)別,也無(wú)法分辨類(lèi)別3 和不劃類(lèi),這些都是在利用這些試驗(yàn)方法或其數(shù)據(jù)時(shí)必須注意的。

5.3 膜屏障試驗(yàn)方法

在OECD 認(rèn)可的對(duì)皮膚腐蝕性和刺激性的替代試驗(yàn)方法中,TG435[16]膜屏障(membrane barrier)試驗(yàn)方法是唯一一種完全基于人造的非生物皮膚模型(artificial non-viable skin model)的方法。 其測(cè)試系統(tǒng)由人造的高分子生物膜和化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)(chemical detection system, CDS)組成,原理是基于人造高分子生物膜與活體皮膚具有相似的腐蝕作用機(jī)制的假設(shè),受試物局部作用于高分子生物膜表面,經(jīng)過(guò)特定的作用時(shí)間,通過(guò)CDS(如pH 指示劑顏色改變、指示劑溶液其他特性改變等)檢測(cè)高分子生物膜的屏障功能是否受到破壞,受試物是否穿透了高分子生物膜,以此對(duì)受試物的腐蝕性進(jìn)行識(shí)別和分類(lèi)。

目前,TG435 的商業(yè)化模型只有Corrositex ?一種,可用于識(shí)別化學(xué)品皮膚腐蝕性(類(lèi)別1)和非腐蝕性,基于Corrositex?的子分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)可利用受試物對(duì)生物膜的穿透時(shí)間進(jìn)一步劃分腐蝕性子類(lèi)別1A、1B 和1C。 Corrositex?操作簡(jiǎn)單,在評(píng)估酸、堿以及酸衍生物的皮膚腐蝕性時(shí)非常有效[17],但基于該CDS 的特點(diǎn),不適用于評(píng)估pH 值4.5~8.5 及其他無(wú)法令CDS 指示劑發(fā)生顏色變化的化學(xué)品[18]。 雖然該方法無(wú)法分辨非腐蝕化學(xué)品的皮膚刺激性(類(lèi)別2/3)和非腐蝕性(不劃類(lèi)),但是在執(zhí)行一些運(yùn)輸相關(guān)法規(guī)要求的測(cè)試時(shí)特別適用,如美國(guó)交通運(yùn)輸部的危險(xiǎn)物質(zhì)法規(guī)[19]就明確規(guī)定了針對(duì)TG430 或TG431 劃為腐蝕性的危險(xiǎn)品,必須利用 TG435 或TG404 對(duì)結(jié)果進(jìn)一步確定。

6 其他的皮膚腐蝕/刺激替代試驗(yàn)方法

作為皮膚腐蝕和刺激IATA 模塊5a,這些暫未受OECD 認(rèn)可的皮膚腐蝕和刺激性評(píng)估的體外模型和替代方法有許多,除了一些商業(yè)化的RhE 模型(KeraSkinTM、EpiKutis ?、EST1000 ?、StrataTest ?、Vitrolife-SkinTM、Phenion ?等)[20-23]、開(kāi)源的 RhE 模型(OS-Rep[24-25]) 和其他類(lèi)似的 RhE 模型(如HaCaT 表皮模型[26-27]、LHE 人類(lèi)表皮模型[28]、基于手術(shù)獲得的人類(lèi)皮膚的模型[29]、人類(lèi)全厚皮膚模型[30]等),還包括了一些正在研究開(kāi)發(fā)的新模型和新方法。

Groux 等[31]研究了RhE 模型響應(yīng)皮膚刺激物而引起的基因表達(dá)變化,并根據(jù)基因表達(dá)水平開(kāi)發(fā)了一種方法用于劃分刺激性(類(lèi)別2)、輕度刺激性(類(lèi)別3)和非刺激性(不劃類(lèi))。 Spiekstra 等[32]研究表明在RhE 模型中利用IL-1α,IL-1RA,IL-8 等生物標(biāo)志物和MTT 不僅能識(shí)別受試物的腐蝕性和刺激性,還可以確定化學(xué)物質(zhì)對(duì)皮膚的刺激能力。 除此以外還有許多應(yīng)用了蛋白質(zhì)組學(xué)和毒物基因組學(xué)技術(shù),并非以細(xì)胞活力為測(cè)定終點(diǎn)的試驗(yàn)方法[33-36]。

另外,Khammo 等[37]和 Muller 等[38]研究組還分別利用從胚胎大鼠背根節(jié)神經(jīng)元提取的感覺(jué)神經(jīng)元和人類(lèi)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)構(gòu)建了受神經(jīng)支配的組織工程皮膚(TES)模型,可在體外試驗(yàn)中模擬在體內(nèi)由神經(jīng)性炎癥造成的刺激和疼痛[39]。

最后,還有更多基于生物打印、器官芯片等新技術(shù)應(yīng)用的新模型和新方法,如Wei 等[40]研究利用3D 生物打印技術(shù)構(gòu)建的可有效應(yīng)用于皮膚刺激研究的人類(lèi)全厚皮膚模型,以及Jusoh 等[41]研究以臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、人類(lèi)真皮成纖維細(xì)胞(HDF)、角質(zhì)形成細(xì)胞和微流控芯片構(gòu)建的具有血管生成能力的皮膚芯片,還有Tavares 等[42]研究基于微生理系統(tǒng)構(gòu)建的人類(lèi)皮膚-肝雙器官集成芯片。

7 結(jié)論與展望

3R 原則提出以來(lái),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利的問(wèn)題得到了更多的關(guān)注,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代技術(shù)在科技和法規(guī)的雙重驅(qū)動(dòng)下獲得了很大的發(fā)展,人們?cè)絹?lái)越重視利用體外模型和試驗(yàn)方法代替動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行化學(xué)品安全性的研究。 近年來(lái),在化學(xué)品皮膚腐蝕性和刺激性的研究方面,無(wú)論從替代試驗(yàn)方法的開(kāi)發(fā)還是分類(lèi)評(píng)估試驗(yàn)策略的創(chuàng)新都取得了很大的進(jìn)步。 越來(lái)越多的體外模型和試驗(yàn)方法通過(guò)了驗(yàn)證;基于組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用研究,更多的測(cè)定終點(diǎn)被提出;得益于3D 生物打印、干細(xì)胞和生物芯片等技術(shù)的發(fā)展,構(gòu)建更復(fù)雜的體外模型也成為了可能。 隨著科技的進(jìn)步,更多的體外試驗(yàn)方法和模型將被開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。

中國(guó)與其他主要發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)相比,在動(dòng)物試驗(yàn)替代方法的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證等方面的工作起步稍晚,在管理和發(fā)展上還存在著一定的差距。 目前在實(shí)驗(yàn)成本方面,替代試驗(yàn)與動(dòng)物試驗(yàn)相比仍不具備優(yōu)勢(shì)。 此外,在GHS 皮膚腐蝕性和刺激性分類(lèi)的應(yīng)用上,現(xiàn)有的替代試驗(yàn)方法在適用條件和分類(lèi)范圍等仍存在著局限。 皮膚腐蝕性和刺激性IATA 以3R原則為指導(dǎo),提出盡可能優(yōu)先利用現(xiàn)有的數(shù)據(jù)進(jìn)行證據(jù)權(quán)重評(píng)估,必要時(shí)再結(jié)合危險(xiǎn)性分類(lèi)需求合理地制定策略開(kāi)展試驗(yàn)。 該策略結(jié)合目前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀,充分優(yōu)化了皮膚腐蝕性和刺激性的分類(lèi)試驗(yàn)流程,最大程度地減少不必要的試驗(yàn)和避免了對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用,正確利用這一策略對(duì)今后有效開(kāi)展皮膚腐蝕性和刺激性分類(lèi)評(píng)估工作具有非常重要的意義。