拮抗銅綠假單胞菌的乳酸菌篩選及機(jī)制研究

李建周 肖堯婷 李紅霄 陳曉華,,4 李安平

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.衡陽師范學(xué)院南岳學(xué)院，湖南 衡陽 421002；3.衡陽師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南 衡陽 421008；4.衡陽師范學(xué)院南岳山區(qū)生物資源保護(hù)與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽 421008)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)又稱綠膿桿菌，是典型的條件致病菌[1]，同時(shí)也是重要的食源性致病菌，其產(chǎn)生的毒力因子可引起食物中毒和飲用水的污染，導(dǎo)致患者產(chǎn)生頭暈、嘔吐和腹瀉等癥狀[2-3]。由于PA具有內(nèi)源性、獲得性和適應(yīng)性多重耐藥機(jī)制，常導(dǎo)致多重耐藥性PA菌株的出現(xiàn)和抗生素治療的失敗[4]。2017年世界衛(wèi)生組織將耐碳青霉烯的PA列為迫切需要開發(fā)新抗菌藥物治療的細(xì)菌之一。因此，開發(fā)新的抗菌藥物和尋找天然具有抗菌作用的替代物是臨床PA治療的理想選擇。

乳酸菌(Lacticacidbacteria，LAB)是一類對人體有益的重要微生物，被公認(rèn)為是安全的食品級微生物。LAB在自然界中廣泛存在，土壤、食品以及人體、畜禽腸道內(nèi)均含有LAB。LAB代謝過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸抗菌肽，可抑制病原微生物生長繁殖、調(diào)節(jié)腸道微生物菌群平衡，從而對宿主的營養(yǎng)狀態(tài)、生理功能、應(yīng)激反應(yīng)等產(chǎn)生作用。目前臨床中許多益生LAB已被用來預(yù)防或治療各種胃腸疾病，包括感染性腹瀉、新生兒腸炎、慢性結(jié)腸炎、腸易激綜合癥和炎癥性腸病[5]。

微生物通過群體感應(yīng)系統(tǒng)(QS)協(xié)調(diào)群體行為，其中存在多種QS系統(tǒng)，革蘭氏G+和革蘭氏G-中都存在的自誘導(dǎo)物AI-2，是不同種屬細(xì)菌間通訊交流的通用信號分子。AI-2是一種呋喃酮類化合物，為對稱的雙五圓環(huán)結(jié)構(gòu)的呋喃酮酰硼酸二酯，是甲硫氨酸循環(huán)通路——甲基循環(huán)的一個(gè)副產(chǎn)品。目前已知70多個(gè)種屬的細(xì)菌基因組中含有l(wèi)uxS的同源序列，并且AI-2的生物合成途徑基本相似。微生物菌群中AI-2信號分子的表達(dá)受AI-2/LuxS QS系統(tǒng)調(diào)控，且參與QS的luxS基因可調(diào)控LAB的生理活性[6]，LAB的抑菌機(jī)制與AI-2/LuxS的表達(dá)系統(tǒng)有關(guān)[7-8]。QS系統(tǒng)可以調(diào)控LAB的多項(xiàng)重要生理功能，如調(diào)控菌體生物膜的形成[9]、胞外酶的合成[10]、抗菌肽的合成[11]、腸道定殖能力[12]等。Park等[13]發(fā)現(xiàn)從泡菜中篩選出的清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)NR28 對大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)ATCC43894的AI-2具有淬滅作用，能達(dá)到降低致病性的目的。陳小春等[14]研究發(fā)現(xiàn)太平洋桿菌可通過抑制PA的QS系統(tǒng)降低PA毒力因子的表達(dá)。Rana等[15]利用LAB(乳酸乳球菌、發(fā)酵乳桿菌和鼠李糖乳桿菌)上清液抑制PAO1信號分子AHL的表達(dá)，從而抑制彈性蛋白酶活性，降低PA生物膜的形成。Chappell等[16]通過構(gòu)建乳桿菌工程菌，表達(dá)降解PA生物膜的酶，抑制PA生物膜的形成。綜上，LAB有抑制PA的作用，但LAB抑制PA的作用機(jī)制尚未明晰。

研究擬篩選抑制PA的LAB，通過測定LAB群體感應(yīng)信號分子AI-2的表達(dá)，LAB抑制PA生物膜形成、綠膿菌素(PYO)表達(dá)及LAB無菌上清液與PA共培養(yǎng)時(shí)AI-2信號分子的表達(dá)探討LAB拮抗PA的機(jī)制。旨在為乳桿菌拮抗PA的機(jī)制研究提供新的思路，也為乳桿菌益生特性的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

12株LAB(其中6株來源于泡菜，2株來源于腐乳，2株來源于雞糞便，1株來源于發(fā)酵米，1株來源于酸奶)、銅綠假單胞菌(PAO1)、哈維氏弧菌(VibrioharveyiBB170, BB152)大腸桿菌(EscherichiacoliDH5α)：實(shí)驗(yàn)室保存菌株；

LAB培養(yǎng)用MRS培養(yǎng)基、AO1用LB培養(yǎng)基、BB170和BB152用海生培養(yǎng)基、DH5α用LB培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 菌株的培養(yǎng)及上清液制備

LAB按體積分?jǐn)?shù)2%接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃活化3代，繼續(xù)培養(yǎng)18 h；PAO1按體積分?jǐn)?shù)1%接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃活化3代，繼續(xù)培養(yǎng)18 h；BB170、BB152按體積分?jǐn)?shù)2%接種于AB培養(yǎng)基中，30 ℃活化3代，繼續(xù)培養(yǎng)12 h；DH5α按體積分?jǐn)?shù)1%接種于LB培養(yǎng)基中，30 ℃活化3代，繼續(xù)培養(yǎng)18 h。以上菌株獲得培養(yǎng)液后，6 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm過濾器過濾，獲得試驗(yàn)菌株的無菌上清液，于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 共培養(yǎng)物上清液的制備

將LAB上清液、MRS培養(yǎng)基上清液、DH5α上清液以及LB培養(yǎng)基上清液分別按V上清液∶VPA菌液=1∶1分別接入濃度為106CFU/mL的PA菌液中，培養(yǎng)24 h，6 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm濾菌器過濾，得到無菌共培養(yǎng)上清液，于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 LAB抑菌能力測定

參照Chappell等[16]的方法并稍作修改。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂滅菌后倒入平板中，凝固后放入4個(gè)無菌牛津杯，倒入濃度約為106CFU/mL的PA菌液，待凝固后，用鑷子夾出。取200 μL LAB上清液加入到牛津杯孔中，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。每個(gè)樣品做3個(gè)平行，重復(fù)3次。以MRS培養(yǎng)基(pH 4.0)作為空白對照。抑菌圈直徑>15 mm判定為高度敏感；抑菌圈直徑為11～15 mm 判定為中度敏感；抑菌圈直徑為5～10 mm 判定為低度敏感；抑菌圈直徑為4 mm 判定為不敏感[17]。

1.5 信號分子AI-2的檢測

參照蔡針華等[18]的方法稍作修改。將BB170按體積分?jǐn)?shù)2%接種于海生培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)12 h，至菌體OD600 nm為0.8～1.2，用新鮮的AB培養(yǎng)基以1∶100稀釋BB170培養(yǎng)液，充分震蕩混勻后備用。將LAB上清液、BB152無菌上清液、DH5α無菌上清液和BB170培養(yǎng)稀釋液分別作為待測樣品、陽性對照、陰性對照和介質(zhì)對照，各4個(gè)平行。按體積比1∶100與稀釋后的BB 170培養(yǎng)液混合培養(yǎng)3.5 h，測定化學(xué)發(fā)光值。用相對熒光強(qiáng)度表示信號分子AI-2的強(qiáng)度，分別按式(1)和式(2)進(jìn)行計(jì)算。

(1)

(2)

式中：

NAI-2——陰性對照組相對熒光強(qiáng)度；

FI,1——陰性對照組熒光強(qiáng)度；

FI,2——陽性對照組熒光強(qiáng)度；

TAI-2——待測組相對熒光強(qiáng)度；

FI,3——待測樣品熒光強(qiáng)度；

FI,4——介質(zhì)對照組熒光強(qiáng)度。

1.6 綠膿菌素(PYO)的測定

參照Lou等[19]的方法稍作修改。將共培養(yǎng)物上清液于-80 ℃超低溫冰箱中預(yù)凍2 h后凍干濃縮。加入3 mL三氯甲烷，待完全溶解后加入1 mol/L的鹽酸1 mL，充分振蕩后靜置。待分層后取鹽酸層測定其OD520 nm，此OD520 nm即表示PYO含量。

1.7 生物膜的測定

參照張立冬等[20]的方法并稍作修改。PA按體積分?jǐn)?shù)1%接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h后，用LB培養(yǎng)基按1∶100稀釋，充分震蕩備用。將LAB上清液按體積比1∶100與稀釋后的PA培養(yǎng)液混勻，移取200 μL至96孔酶標(biāo)板中，37 ℃培養(yǎng)18 h，倒掉菌液，用PBS沖洗4次，烘干。吸取200 μL結(jié)晶紫染液染色10 min，倒出染色劑再用PBS沖洗4次，烘干。加入200 μL脫色劑，測定OD600 nm。以O(shè)D600 nm表示生物膜的生成量，以MRS與PA共培養(yǎng)的OD600 nm為陽性對照，并按式(3)計(jì)算細(xì)胞膜抑制率。

(3)

式中：

BFI——細(xì)胞膜抑制率，%；

A1——各種LAB與PA共培養(yǎng)時(shí)所測的OD600 nm；

A2——MRS與PA共培養(yǎng)時(shí)所測的OD600 nm。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20單因素方差分析進(jìn)行差異性分析(P<0.05)，并使用GraphPad Primer 8.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAB抑菌能力

由表1和圖1可知，LGchen、S-5-6和L1 3株LAB的抑菌圈直徑分別為22.27，20.20，20.13 mm，顯著高于其他9種LAB的，N34的抑菌圈直徑最小，為12.33 mm，說明LAB對PA的抑菌效果具有菌株特異性。試驗(yàn)中MRS-pH 4.0作為參照也有一定的抑菌效果，說明酸對PA生長有一定的抑制效果，但篩選的LAB的抑制效果強(qiáng)于MRS抑制效果，推測LAB的抗菌作用除受酸影響外，還可能與LAB的其他代謝物質(zhì)有關(guān)，如過氧化氫、乙酸、乳酸及其他有機(jī)酸和細(xì)菌素等物質(zhì)均有抑菌作用。劉君等[21]從魚、蝦腸道分離得到的戊糖片球菌對美人魚發(fā)光桿菌、大腸桿菌、溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌等有不同程度的抑制作用。朱英蓮等[22]從發(fā)酵食品中分離出的6株LAB，其中3株有較好的抑制假單胞菌效果，產(chǎn)生的LAB素具有很好的耐熱性，在酸性條件下表現(xiàn)出良好的抑菌效果。LAB上清液對PA的生長也有明顯的抑制效果，說明LAB的代謝物具有抗菌作用，其具體抗菌物質(zhì)需進(jìn)一步研究。

圖1 LAB抑制PA生長

為研究LAB抑制PA感染的機(jī)制，選取4株抑菌高度敏感(LGchen、ZX5、L1和S-5-6)和2株抑菌中度敏感(N34和L23)的LAB進(jìn)一步研究。經(jīng)16S rRNA鑒定，N34和L23為植物乳桿菌，S-5-6和ZX5L為唾液乳桿菌，LGchen和L1分別為格氏乳桿菌和戊糖片球菌。

2.2 LAB信號分子AI-2的表達(dá)

LAB群體感應(yīng)信號分子AI-2具有保守性，利用指示菌BB170識別LAB產(chǎn)生的AI-2信號分子，LAB可誘導(dǎo)BB170熒光酶基因的表達(dá)，從而產(chǎn)生發(fā)光反應(yīng)。依據(jù)文獻(xiàn)[23]報(bào)道，LAB的AI-2表達(dá)最高值出現(xiàn)在穩(wěn)定期初期或?qū)?shù)期末期，故采用培養(yǎng)18 h的LAB上清液進(jìn)行測定。由圖2可知，S-5-6、LGchen和ZX5產(chǎn)生信號分子AI-2的能力較強(qiáng)，而L23表達(dá)AI-2的能力較弱。結(jié)合表1 分析，推測LAB信號分子AI-2的表達(dá)可能與LAB的抑菌能力相關(guān)。AI-2作為LAB種間交流信號分子，受其QS系統(tǒng)的調(diào)控，影響LAB的多項(xiàng)重要生理功能。邵長林[24]發(fā)現(xiàn)糞腸球菌 V583在培養(yǎng)過程中孵育過量的信號分子 AI-2會降低其翻譯、代謝、能量產(chǎn)生等15個(gè)相關(guān)蛋白的表達(dá)量，并促進(jìn)生物膜的形成。楊杰[25]在培養(yǎng)植物乳桿菌 KLDS1.0391 時(shí)添加外源信號分子AI-2，發(fā)現(xiàn)菌體細(xì)菌素產(chǎn)量增加，并且不同添加量對細(xì)菌素的促進(jìn)作用不同。宋剛等[26]研究發(fā)現(xiàn)，菌體釋放的自誘導(dǎo)分子AI-2或者共培養(yǎng)環(huán)境中的某些特定菌株，能夠激發(fā)LAB的群體感應(yīng)系統(tǒng)，而LAB細(xì)菌素的產(chǎn)生受群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控，其合成量會提高，進(jìn)而使得LAB對PA的抑菌能力提高。由此推測，LAB的AI-2表達(dá)能力會促進(jìn)其抗菌能力，LAB的AI-2表達(dá)量高可能會增強(qiáng)其抑制PA的生長能力。

表1 LAB上清液對PA的抑菌效果?

字母不同表示差異性顯著(P<0.05)

2.3 LAB上清液與PA共培養(yǎng)信號分子AI-2的表達(dá)

由圖3可知，共培養(yǎng)物上清液的相對熒光強(qiáng)度有顯著差異性(P<0.05)，其中LGchen和L1對共培養(yǎng)的AI-2表達(dá)有明顯的抑制作用，ZX5與S-5-6對共培養(yǎng)的AI-2表達(dá)影響不大，而N34和L23上調(diào)了共培養(yǎng)的AI-2表達(dá)。

字母不同表示差異性顯著(P<0.05)

2.4 LAB對PYO表達(dá)的影響

由圖4可知，6株LAB中LGchen、S-5-6和L23抑制綠膿菌素表達(dá)的效果顯著(P<0.05)，而菌株N34、L1上調(diào)了PA綠膿菌素的表達(dá)，ZX5對PA綠膿菌素的表達(dá)影響不大。PYO是PA一種重要的毒力因子，與PA的致病性和感染性都密切相關(guān)[27]。PYO是有活性的次級代謝物，可無阻礙穿透生物膜、打斷呼吸鏈、產(chǎn)生大量的氧自由基和過氧化氫等導(dǎo)致細(xì)胞死亡[28]。抑制PYO的表達(dá)，在一定程度上可以抑制PA的生長，從而降低PA的毒性，抑制其感染。唐云鵬等[29]研究表明，不同濃度PYO對PA生長具有一定的促進(jìn)作用。

字母不同表示差異性顯著(P<0.05)

2.5 LAB對PA生物膜形成的影響

PA生物膜的形成與其耐藥性產(chǎn)生有密切關(guān)系，生物膜可以阻止PA與抗菌藥物直接接觸，從而提高PA對抗菌藥物的耐藥性[30]。因此，去除病原菌的生物膜來抑制病原菌的生長與定植是一個(gè)非常好的防治病原菌感染的策略。由圖5可知，6株LAB均能抑制PA的生物膜形成，但抑制率存在差異，其中，LGchen和S-5-6對PA生物膜形成的抑制率較好，N34的抑制效果較差；而ZX5、L1和L23的抑制效果相差不大，說明LAB可以通過抑制PA生物膜形成達(dá)到抗菌的目的。Srikanjana等[31]研究表明，LAB具有拮抗李斯特菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的作用，是因?yàn)長AB將其他致病菌的細(xì)胞膜破壞，從而使致病細(xì)胞萎縮或裂開從而達(dá)到抗菌作用。

字母不同表示差異性顯著(P<0.05)。

2.6 LAB拮抗PA的相關(guān)性分析

由表2可知，LAB的抑菌能力與LAB抑制PA生物膜形成能力及LAB的AI-2表達(dá)量呈正相關(guān)，說明LAB抑制能力越強(qiáng)，其抑制PA生物膜形成的能力越強(qiáng)，同時(shí)，LAB 的AI-2表達(dá)影響LAB抑菌能力。LAB抑菌能力與共培養(yǎng)物上清液AI-2表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，說明LAB的抑菌能力越強(qiáng)，PA的AI-2表達(dá)能力越弱。LAB的AI-2表達(dá)與共培養(yǎng)物上清液AI-2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說明LAB表達(dá)AI-2能力越強(qiáng)，其抑制PA的AI-2表達(dá)能力越強(qiáng)。綜上，LAB的抑菌性與其AI-2的表達(dá)、抑制PA生物膜形成及抑制PA的AI-2表達(dá)有關(guān)，但與PYO的表達(dá)無顯著相關(guān)性。

表2 皮爾森相關(guān)性分析

3 結(jié)論

試驗(yàn)篩選的植物乳桿菌N34和L23，唾液乳桿菌S-5-6和ZX5，格氏乳桿菌LGchen和戊糖片球菌L1可以拮抗銅綠假單胞菌感染，其抗菌機(jī)制與乳酸菌抑制銅綠假單胞菌生長，抑制銅綠假單胞菌生物膜形成，乳酸菌自身AI-2表達(dá)量以及抑制銅綠假單胞菌的AI-2表達(dá)量有關(guān)。其中，格氏乳桿菌LGchen和唾液乳桿菌S-5-6的整體抗菌效果比較顯著，具有潛在商業(yè)應(yīng)用的價(jià)值，后續(xù)將從代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)一步研究拮抗機(jī)制。

莫婷婷、張鳳霞、陳政良、陳小珍等人參與該研究的試驗(yàn)數(shù)據(jù)測定，在此表示感謝！