平面光極基本原理及其在土壤微觀異質(zhì)性研究中的應用①

冉洪芋，葉 馨，朱曉艷，王 鋼，朱 堃

平面光極基本原理及其在土壤微觀異質(zhì)性研究中的應用①

冉洪芋，葉 馨，朱曉艷，王 鋼，朱 堃*

(中國農(nóng)業(yè)大學土地科學與技術(shù)學院，北京 100193)

傳統(tǒng)的土壤理化特性研究往往依賴于異位取樣測定方法，樣品采集過程通常會破壞土壤的原有結(jié)構(gòu)，忽略了土壤的微觀異質(zhì)性，無法真實地反映土壤實時環(huán)境的高度異質(zhì)性特點。近年來，具有微米級高分辨率的平面光極技術(shù)(planar optode)因兼具低擾動和實時原位監(jiān)測等特性，在土壤生物地球化學過程相關(guān)研究中獲得越來越多的關(guān)注和應用。平面光極基于發(fā)光傳感原理，將特異性發(fā)光指示劑包埋在基質(zhì)中制成傳感膜，利用數(shù)字成像技術(shù)記錄其二維特征發(fā)射光譜，通過指示劑發(fā)光信號的改變來實時反映溶質(zhì)的動力學特征。該技術(shù)具有實時、原位檢測、高分辨率、靈敏度高且儀器設(shè)備相對簡單的特點，實現(xiàn)了對土壤O2、pH、CO2、NH4+等相關(guān)理化參數(shù)的實時動態(tài)監(jiān)測。本文綜合國內(nèi)外最新研究，詳細闡述了平面光極的系統(tǒng)組成、成像定量方法與特點及其局限，重點總結(jié)了平面光極在土壤微觀異質(zhì)性研究中的主要應用，最后對平面光極的發(fā)展方向及其在土壤學、農(nóng)業(yè)環(huán)境等領(lǐng)域的應用提出展望，旨在為土壤學前沿研究和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支撐。

高分辨率；實時原位監(jiān)測；二維成像

土壤是元素生物地球化學循環(huán)過程的關(guān)鍵載體，具有高度的時空異質(zhì)性[1-2]。傳統(tǒng)的土壤研究手段往往依賴于破壞性采樣和異位提取分析法，通常只考慮待測物在整個土體的平均濃度，無法反映待測參數(shù)的時空異質(zhì)特征，從而忽略了土壤異質(zhì)性的潛在影響。為解決土壤理化參數(shù)原位觀測的難題，研究者開發(fā)了各種尖端的微米級傳感微電極[3]，為更好地理解土壤生物地球化學過程提供了寶貴的技術(shù)支撐。此外，人們又研發(fā)出具有比微電極更優(yōu)越的長期穩(wěn)定性且不消耗分析物的微型光纖電極(microoptode)[4]。然而，這些類型的微型傳感器一般只能完成單點或單線觀測，而無法對多點位的復雜動態(tài)變化過程進行即時監(jiān)測，且在其實際應用過程中也可能會對土壤的微環(huán)境體系產(chǎn)生一定程度的破壞或干擾。隨后，基于凝膠的薄膜擴散平衡法(diffusive equilibration in thin films，DET)[5]和薄膜擴散梯度法(diffusive gradient in thin films，DGT)[6]相繼被提出。DGT和DET技術(shù)能夠基于部分測定結(jié)果和最優(yōu)假設(shè)條件下的模型較為真實地模擬原位條件下待測物在環(huán)境介質(zhì)中的生物可利用性[7]，但是基于理想假設(shè)而做出的預測并不能完全反映土壤溶質(zhì)運移與反應動力學的真實信息。另外，原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)、X射線熒光光譜分析儀(X-ray fluorescence)等儀器也可提供待測分析物高分辨率的空間分布信息，不過其儀器相對昂貴且操作繁瑣。因此，針對土壤的高度異質(zhì)性與熱點區(qū)域變化，需要一種結(jié)果可靠、價格相對低廉、能夠?qū)崿F(xiàn)實時原位監(jiān)測并且具有較高分辨率的測量技術(shù)來獲取土壤中關(guān)鍵分析物的信息。

20 世紀 90 年代，Glud等[8]開發(fā)出平面光學電極(planar optrode)二維成像技術(shù)，實現(xiàn)了在亞毫米尺度上監(jiān)測海底淤泥和水體中O2的二維空間動態(tài)分布。隨后該技術(shù)逐漸發(fā)展為平面光極技術(shù)(planar optode，PO)，且針對各種目標分析物(pH、CO2、NH4+等)的平面光極也逐漸被開發(fā)出來，為揭示生物地球化學過程的微觀機理提供了新的技術(shù)手段。平面光極早期主要應用于海洋、湖泊等水體，而隨著前沿科學技術(shù)的跨學科發(fā)展，以及考慮到土壤熱點區(qū)域和熱點時刻在生物地球化學反應過程中的重要性，該技術(shù)逐漸被應用于土壤的微觀異質(zhì)性研究中，且取得了顯著性成果[9-10]。

本文系統(tǒng)概述了平面光極的成像原理、測量方法以及特點和局限性，總結(jié)了平面光極在土壤學和農(nóng)業(yè)環(huán)境研究領(lǐng)域中的多方面應用，討論了平面光極進一步的發(fā)展方向和潛在應用，旨在為今后土壤相關(guān)理化參數(shù)的微觀特性研究提供技術(shù)參考。

1 平面光極基本原理與系統(tǒng)組成

平面光極技術(shù)是基于發(fā)光傳感原理，將發(fā)光指示劑包埋在基質(zhì)中制成傳感膜，利用成像器件記錄其激發(fā)的二維特征發(fā)射光譜，再依據(jù)像素標定的傳遞函數(shù)來量化待測分析物濃度。平面光極由發(fā)光傳感系統(tǒng)和信號收集系統(tǒng)兩部分組成(圖1)。發(fā)光傳感系統(tǒng)包含光學平面?zhèn)鞲衅骱图ぐl(fā)光源。其中，激發(fā)光源主要為發(fā)光指示劑提供激發(fā)能量，通常是大功率的LED(發(fā)光二極管)[11]或鹵素氙燈[8-12]。信號收集系統(tǒng)由CCD(電荷耦合裝置)或CMOS(互補金屬氧化物半導體)[13]與電腦終端連接組成，利用圖像分析軟件(如Image J)進行后期數(shù)據(jù)處理來獲取待測物質(zhì)的二維分布信息。

傳感膜是平面光極的關(guān)鍵組成部分，它決定了光學平面?zhèn)鞲衅鞯撵`敏度、選擇性、動態(tài)范圍、響應時間以及穩(wěn)定性等特性。傳感膜的制作方法與傳統(tǒng)鍍膜工藝類似：首先將發(fā)光指示劑、包埋劑、參比染料和一些光散射輔助粒子等按照一定的比例溶解于有機溶劑中，形成混合均勻的母液，然后利用刀涂[16]、旋涂[14]或噴涂[17]等鍍膜方式將母液均勻地涂布在支撐基材表面，待溶劑揮發(fā)后形成厚度約小于10 μm的傳感膜。其中，發(fā)光指示劑是傳感膜的關(guān)鍵成分，也是擴展平面光極技術(shù)應用的研究核心(表 1)。由于土壤中的溶質(zhì)大多無色或者本身不發(fā)熒光，所以不能用光學方法直接測定，而發(fā)光指示劑就是根據(jù)其發(fā)光特性和對待測分析物的特異敏感性，將土壤中的待測溶質(zhì)濃度轉(zhuǎn)換為可測量的光信號。一般來說，增大發(fā)光指示劑的濃度，可以增強光信號，但當濃度過高時會導致所發(fā)熒光的自淬滅[18]。因此，可以通過向基體溶液中添加納米級的TiO2、鉆石或黃金等光散射粒子來增加亮度，從而增強發(fā)光指示劑的能量吸收[19-20]。需注意的是，TiO2也可以起到光催化劑的作用，所以在一定程度上會降低光學平面?zhèn)鞲衅鞯姆€(wěn)定性[17]。另外一種常用的方法是向基體溶液中添加天線染料(如香豆素[16, 21])，香豆素可以有效地吸收激發(fā)光并將能量傳遞給發(fā)光指示劑從而增強發(fā)射光信號，目前這種方法已經(jīng)應用到了O2、pH等平面光極傳感器中。在實際應用過程中，傳感膜的穩(wěn)定性較高，其中的各個化學成分均不會擴散或泄露到土壤環(huán)境中[9]。

表 1 平面光極常用發(fā)光指示劑

此外，基于熒光的測量可能受到土壤中具有熒光效應物質(zhì)的干擾，特別是在根際土壤研究中，根系本身對激發(fā)光源的光學響應是否會干擾待測分析物的測定，還有待進一步的實驗確認。因此，為了排除或者減少此類影響，通常在傳感膜的表面涂覆一層光學隔離層，這種隔離層通常以硅/水凝膠嵌入炭黑、TiO2或ZnO2等納米顆粒組成[16, 37]。如果待測分析物為氣體分子(如：O2、CO2和H2S等)[32, 36]，則可以在傳感膜的表面覆蓋一層透氣不透離子的薄膜，以消除各種非揮發(fā)性的無機、有機離子或分子的干擾。需注意的是，光學隔離層會增加傳感膜厚度進而減緩平面光極的響應速度。比如，具有硅膠隔離層的O2光極達到T90的響應時間(90% 全信號的時間)比沒有隔離層的大 10 倍左右[37]。因此，光學隔離層的添加可能會降低平面光極的實際時空分辨率，一定程度上會限制其在具有快速動態(tài)變化的微環(huán)境體系中的應用。

2 成像定量方法

2.1 發(fā)光強度定量

發(fā)光強度定量就是直接通過測量發(fā)射熒光的強度來定量每一個像素點的濃度分布信息[16]。該方法的優(yōu)點是簡單易于實現(xiàn)，但缺點是容易受背景環(huán)境、發(fā)光指示劑分布不均等因素的影響，導致測量精度及穩(wěn)定性不高。雖然可以通過在傳感膜上涂覆一層光學隔離層，并在使用前后對光學傳感器進行點對點的像素校準來減小這些測量誤差，但這會增加光極的響應時間以及測定程序的繁瑣性，限制了該方法在實際中的應用。

2.2 發(fā)光壽命定量

發(fā)光壽命是指電子從基態(tài)激發(fā)到返回基態(tài)的平均時間。熒光壽命較短(接近10–8s)，而磷光發(fā)光壽命相對較長(10–6s至數(shù)小時不等)?；诎l(fā)光壽命的測量方法包括熒光壽命頻域測定法(frequency domain，F(xiàn)D)[38]和磷光壽命測定法(rapid lifetime determination，RLD)[39]。頻域測定法是利用混合物中各熒光體熒光壽命的差異來進行熒光光譜的分辨，并利用激發(fā)光和熒光之間的相角和去調(diào)制因素來計算熒光壽命。而磷光壽命測定法是通過將磷光壽命衰減曲線(強度與時間)劃分為至少兩個相同寬度區(qū)域，然后用區(qū)域之間強度下降值來計算發(fā)光壽命。相比于發(fā)光強度的定量方法，基于發(fā)光壽命的定量克服了來自光學隔離層、不穩(wěn)定的校準曲線以及非均質(zhì)傳感膜和激發(fā)光源等因素的限制。但由于缺少具有適宜發(fā)光壽命的熒光指示劑，目前基于發(fā)光壽命的定量僅用于O2、NH4+、溫度等目標分析物。此外，基于發(fā)光壽命的定量通常需要搭配具有快速電子快門的CCD設(shè)備來捕捉發(fā)光壽命信號，價格相對昂貴，也限制了該方法的大范圍推廣使用。

2.3 強度比率定量

比率測量法通常包括熒光波長比率定量和RGB(red、green、blue)顏色比率定量。熒光波長比率定量法就是利用記錄在兩個不同的激發(fā)波長[32-33]、兩個不同的發(fā)射波長[40]，以及雙激發(fā)/雙發(fā)射下[34]的兩幅發(fā)射圖像之間的強度比值來確定待測分析物的濃度。為了提高分析的準確性，便于分離熒光信號，通常加入不與待測分析物反應且具有較長發(fā)射波長的參比染料。外界干擾引起的光強變化會同時對熒光和參考光都產(chǎn)生影響，因此同步測量熒光染料和參考染料的發(fā)光強度可以極大地減少此類干擾的影響。采用波長比率定量法就可以有效地減少外界雜光的干擾，解決發(fā)光指示劑分布不均等問題。

RGB顏色比率法[16, 41]是利用數(shù)碼相機的內(nèi)置彩色濾光片，在激發(fā)光源下同時記錄發(fā)射光的 3種不同顏色(紅、綠、藍)，利用單個圖像所記錄的 3 種不同顏色通道之間的強度比值來定量分析物的濃度。同時在圖像處理中采用多幀圖像平均的方法，提高了圖像像素的信噪比。目前，這種方法主要用于O2、pH[16]測定。此外，RGB顏色比率法中的色調(diào)參數(shù)(色調(diào)、飽和度等)的應用使傳感器的精度較波長比率定量法提高了3 倍[42]。近年來，強度比率定量成像由于其低成本且不需要復雜的控制電路系統(tǒng)而越來越受歡迎，具有較高的實用性。

3 平面光極的主要特點及其局限性

3.1 空間分辨率

與傳統(tǒng)的微型傳感器測量相比，平面光極技術(shù)的高空間分辨率(<100 μm)和較大觀測視野(>400 cm2)是其主要的兩大優(yōu)點。其中最大空間分辨率主要由成像設(shè)備本身像素大小以及實際的觀測視野決定，如在理想狀態(tài)下，高級CCD相機原始(RAW)文件格式的像素尺寸可以達到5.7 μm×5.7 μm[16, 43]；數(shù)碼單反相機原始文件格式的像素尺寸為11.4 μm×11.4 μm[16]。然而，由于光學信號可能會在傳感膜層、支撐基材或容器壁的邊界發(fā)生漏光效應等光學畸變，所得實際光學分辨率通常會低于理論計算所得分辨率[14]。對此，F(xiàn)ischer和Wenzh?fer[14]利用數(shù)學模型計算發(fā)現(xiàn)O2光極的空間分辨率極限是其傳感膜厚度的5 倍。除此之外，涂有光學隔離層的光極將進一步降低空間分辨率。但在大多數(shù)平面光極的實際應用中，大約100 μm× 100 μm的空間分辨率基本滿足其對最小動態(tài)分辨率的要求。

3.2 時間分辨率

平面光極具有較高的時間分辨率，能夠持續(xù)實時地獲取待測物的動態(tài)分布。基于發(fā)光壽命定量的光極系統(tǒng)通常采用具有高靈敏度、低噪聲的CCD相機來捕捉短暫的磷光信號，其常用曝光時間在5 ～ 20 μs之間[39, 44]。由于短曝光時間的磷光信號強度較低，通常采用整合多個曝光時間幀來提高單張圖像的信號強度。根據(jù)集成時間的不同，單個圖像的總采集時間一般約為1 ～ 2 s[45]。然而，這種方式所得圖像的信噪比普遍偏低，所以在實際應用中更多利用多幅圖像(3 ～ 16)的像素平均來提高信噪比，使得復合圖像的最終采集時間為10 ～ 40 s[46]。此外，還可以應用像素合并技術(shù)(binning)來提高信噪比和幀率。像素合并技術(shù)[39, 46]是指將CCD圖像傳感器相鄰兩個或多個像元所感應的電荷加在一起，以一個新像元的模式讀出。像素合并可通過減少圖像采集所需的時間來提高聚焦精度和靈敏度。理論上，一個2×2 像素的電荷合并可以將靈敏度提高4 倍，但可實現(xiàn)的最大空間分辨率會縮小2 倍。而基于發(fā)光強度定量的光極系統(tǒng)需要較長的曝光時間，通常為0.1 ～ 1 s，但也有報道稱可以高達30 s[47]。另外，時間分辨率還會受到平面光極傳感膜響應時間的影響，其值取決于傳感膜中待測分析物與環(huán)境介質(zhì)達到熱力學平衡所需的時間。因此，對于有較快響應時間要求的平面光極，需要盡量減小傳感層的厚度，同時也要求發(fā)光指示劑的發(fā)光強度能夠保證足量的信號輸出[18]。大多數(shù)O2光極傳感膜厚度約為10 ～ 40 μm，達到90% 信號強度所需時間是5 ～ 10 s[48]，pH和CO2光極響應通常比O2光極慢，一般為10 ～ 150 s[24, 35]，而NH4+傳感器的響應時間更長，需要3 ～ 4 min[34-35]。盡管如此，對于在土壤中的大多數(shù)實際應用，傳感器響應時間并不是一個限制因素，所得時間分辨率仍然遠遠高于傳統(tǒng)的破環(huán)性取樣方法。

3.3 干擾信號

環(huán)境溫度是影響平面光極信號的重要因子。有研究發(fā)現(xiàn)溫度對幾乎所有的光極信號都存在干擾[49]。例如，Borisov和Klimant[50]發(fā)現(xiàn)，對于以PtTFPP為發(fā)光指示劑、聚苯乙烯為基體的O2平面光極，如果不進行溫度校正，在85% 高溶解氧含量條件下的測量誤差高達1.7%/℃，而在12% 的低氧含量條件下，測量誤差相對較低，只有0.22%/℃。Rysgaard等[51]也報道了類似的結(jié)果，在相同條件下，以Ru-dpp為發(fā)光指示劑、聚苯乙烯為基體的O2平面光極也分別產(chǎn)生2.6%/℃和2.0%/℃的誤差，且Ru-dpp的發(fā)光壽命也有0.3%/℃的下降。因此，在實際應用中必須保持溫度恒定或者對其進行補償校正。對于pH平面光極，當pH在5.5 ～ 8.0 范圍內(nèi)且與校準溫度相差小于5 ℃ 時，溫度變化帶來的干擾并不顯著；隨著溫度的升高，pH發(fā)光指示劑HPTS的發(fā)光強度降低，但其發(fā)光強度在5 ～ 40 ℃ 區(qū)間對溫度不敏感[52]。類似地，Rudolph等[30]發(fā)現(xiàn)pH發(fā)光染色劑H110 在19 ～ 25 ℃ 范圍內(nèi)也不需要進行溫度補償。但是基于發(fā)光指示劑HPTS的CO2傳感器其發(fā)光強度隨溫度的升高而顯著降低[33]。通常由溫度變化引起的系統(tǒng)誤差可以通過獨立的溫度測量[53-54]或添加對溫度變化有明顯響應的參比染料[55]來校正。

除溫度外，背景環(huán)境中的溶質(zhì)對光極測量的影響也不可忽視。pH光極基體的離子滲透特性使其對外界離子強度的變化非常敏感[56]。Zhu等[33, 52]發(fā)現(xiàn)，以HPTS為發(fā)光指示劑的pH光極，外界離子強度與指示劑表觀解離常數(shù)pka呈非線性相關(guān)關(guān)系，且當離子強度超過50 mmol/L后將不再對表觀解離常數(shù)pka產(chǎn)生影響。同樣，隨著離子強度的增加，基于DHFA的pH光極的表觀解離常數(shù)pka也會增加[57]，但外界離子強度變化對DHFAE和DHPDS光極的影響相對較小[28]。目前，已有研究證明常見溶質(zhì)(如NH4+、Fe2+、Mn2+和HS–)不會對包埋于PVA、乙基纖維素或醋酸纖維素基體中pH指示劑的熒光信號產(chǎn)生顯著影響[27, 52, 58]。同時由于包埋基體的離子不可滲透性，外界環(huán)境中的溶質(zhì)不會對O2光極信號產(chǎn)生顯著的干擾。盡管有報道稱氣態(tài)SO2、Cl2可能是O2光極的干擾源[59]，但在大多數(shù)的土壤實際應用中，氣態(tài)SO2、Cl2的含量極低，除了溫度之外的干擾都可以忽略不計。與O2光極類似，CO2光極的信號受外界的干擾較少，主要是因為傳感膜表面的光學隔離層可以隔離大部分溶質(zhì)離子的干擾[60]。然而，也有報道稱氣態(tài)H2S和NH3可以擴散進入光學隔離層[32]，且當H2S濃度低于20 mmol/L時，其影響可忽略不計，但當其濃度大于100 mmol/L時，信號干擾較為嚴重。通常土壤環(huán)境中的NH3濃度對CO2光極信號的影響并不顯著[33]。到目前為止所開發(fā)的NH4+平面光極對6.0 ～ 7.8 范圍內(nèi)的pH變化不敏感[35, 61]，但是與pH平面光極類似，外界離子強度會對NH4+光極信號產(chǎn)生影響。一般在實驗室設(shè)定條件下，環(huán)境介質(zhì)中的離子強度在測定過程中不會發(fā)生很大變化，可在與應用環(huán)境相似的介質(zhì)離子強度條件下進行傳感膜標定，從而避免由離子強度引起的誤差。且在野外現(xiàn)場條件下，也可通過重復標定來消除外界離子強度所產(chǎn)生的信號偏差。

3.4 局限性

當評估平面光極技術(shù)的可靠性及準確性時，必須重視其可能的邊界效應[62]。在大多數(shù)應用中，O2含量的動態(tài)分布是通過與光極傳感器直接接觸的物質(zhì)及其結(jié)構(gòu)來進行研究的，比如在研究生物膜的O2動力學時，生物膜直接生長在光極傳感器上，有利于解析O2在非均相生物膜上的真實二維分布[12]。然而，在O2擴散呈徑向或球形分布時，光極傳感器本身的存在會對O2的三維分布產(chǎn)生畸變作用[63]。如果畸變有明確的幾何形狀，可以利用簡單的擴散模型作為溶質(zhì)運移和消耗率的函數(shù)進行量化，從而糾正傳感器的邊界影響[64]。但在大多數(shù)情況下，尤其是在復雜的土壤環(huán)境中，很難依靠簡單的模型來實現(xiàn)信號校正。此外，由于光纖面板(fiber-optic face plates, FOFP)具有傳光效率高、傳像清晰真實以及在光學上具有零厚度等特點，有報道稱可以將傳感膜直接涂覆在光纖面板上使原始圖像從FOFP的一側(cè)以無畸變的方式轉(zhuǎn)移到另一側(cè)[14, 21]，然而商用FOFP的尺寸通常較小(50 ～ 70 mm)，限制了其在大尺寸區(qū)域的應用[14]。

如上所述，發(fā)光強度測量容易受到背景環(huán)境、發(fā)光指示劑分布不均等因素的影響，導致測量精度及穩(wěn)定性下降。而基于磷光壽命的定量方法，盡管具有較好的準確性和穩(wěn)定性，但通常需要配置復雜的觸發(fā)控制電路，使得平面光極測量系統(tǒng)變得復雜。另外，平面光極的測量穩(wěn)定性主要取決于包埋在基體中的發(fā)光指示劑的穩(wěn)定性。在連續(xù)使用過程中，由于發(fā)光指示劑易發(fā)生光漂白以及泄露現(xiàn)象[29, 65]，需要定期進行標定以保證測量結(jié)果的準確性，這增加了測量的繁瑣性。除此之外，為了減少外界光源干擾，平面光極系統(tǒng)的運行通常需要一個獨立的暗室，這意味著大多數(shù)的平面光極應用主要集中于實驗室。但平面光極同時具備廣泛適用性，通過針對性的調(diào)整，也可以應用于現(xiàn)場進行長期監(jiān)測[66](圖 2)。

4 平面光極在土壤微觀異質(zhì)性研究中的應用

4.1 土壤O2

土壤O2含量不僅影響作物根系的呼吸作用和土壤微生物活性等，而且對溫室氣體排放也起著至關(guān)重要的作用。得益于平面光極的高時空分辨率，研究者應用O2光極實現(xiàn)了對根土界面、土水界面等土壤微域內(nèi)O2動態(tài)變化過程的原位觀測。同時，O2光極也是目前應用最廣、發(fā)展最完善的一類平面光極。

4.1.1 植物根系 采用具有高時空分辨率的O2光極來監(jiān)測具有高度異質(zhì)性的根際氧動態(tài)，比如根系徑向泌氧(radial oxygen loss，ROL)，對于了解植物根系泌氧機理及其根際氧化還原特征具有重要作用。Larsen等[67]利用O2光極觀察了水稻幼苗根際的O2動態(tài)變化(圖3A)。研究表明，根際不同區(qū)域O2含量表現(xiàn)出較高的時空異質(zhì)性，在根尖和幼嫩根系周圍有較強的泌氧區(qū)，同時根系徑向泌氧會受到環(huán)境O2水平以及輻照度的調(diào)節(jié)，即光合作用對植物根系徑向泌氧有直接影響。此外，在根系周圍 1 mm寬的區(qū)域還觀察到根表金屬膜，其分布與觀察到的根際氧化帶及寬度相對應，這種根表金屬膜的形成是植物吸收養(yǎng)分的關(guān)鍵[68]。在另一項研究中，Marzocchi等[69]結(jié)合O2光極與15N同位素示蹤技術(shù)，比較分析了苦草根系徑向泌氧在不同光照強度、O2水平下的空間異質(zhì)性及其對根際N、P循環(huán)的影響。研究發(fā)現(xiàn)根系徑向泌氧主要通過調(diào)節(jié)根際硝化、反硝化微生物的活性以及根系吸收作用，從而影響根際NH4+和PO3– 4 含量。這種O2水平的時空異質(zhì)性確保了根際同時發(fā)生好氧和厭氧過程，減少了潛在的養(yǎng)分限制，同時最大限度地提高了植物在不同環(huán)境脅迫下的適應性。Williams等[70]又聯(lián)合平面光極和薄膜擴散梯度技術(shù)，首次發(fā)現(xiàn)水稻根尖區(qū)域的O2含量更高，pH更低，一定程度上促進了As、Pb和Fe(Ⅱ)等金屬離子的溶解擴散。此外，為了深入了解生物地球化學過程，O2光極常與其他光極傳感器聯(lián)合運用，如pH、CO2等。Blossfeld等[71]介紹了一種可同時用于根際pH和O2動態(tài)分析的復合平面光極技術(shù)，研究了在不同pH(3.9 ～ 5.9)的還原性缺氧土壤中，3 種燈心草屬植物根際泌氧對有機酸含量和分布的影響。研究發(fā)現(xiàn)伸長區(qū)的根際氧濃度日變化顯著，且從 8 周以上的長期監(jiān)測結(jié)果顯示，龍須草植物根系泌氧引起的根際氧化酸化的作用明顯，小花燈心草則使根際堿化，而片髓燈心草對根際pH無顯著影響。Schreiber等[72]也結(jié)合pH和O2光極對中國三峽庫區(qū)的兩種耐澇蕨類植物進行了評估，發(fā)現(xiàn)光合作用產(chǎn)生的O2可以通過根系通氣組織擴散到根際進而氧化根際還原性有毒物質(zhì)，避免其誘發(fā)生理脅迫。Lenzewski等[73]利用平面光極對半邊蓮根際的O2和CO2含量的動態(tài)變化進行了觀測，進一步驗證了地上部葉片光合作用產(chǎn)生的O2可以通過體內(nèi)通氣組織運輸?shù)礁浚@部分O2可增強根際微生物活性，從而增加CO2在根周圍的積累，并且在光照條件下，根際好氧微生物氧化分解產(chǎn)生的CO2能夠被根系再次吸收，以此來增加無機碳供給、維持植物光合作用。

4.1.2 土水界面 O2平面光極的應用可以實現(xiàn)土壤與地下水位界面中O2含量和分布的實時監(jiān)測。Rickelt等[54]提出一種將O2傳感器和熱電偶組合的新型O2光極，并對濕地土壤層的不同深度進行了O2動態(tài)和溫度的原位測量，研究發(fā)現(xiàn)土壤剖面的缺氧界面低于地下水位。在另一項研究中，Askaer等[43]采用O2光極探討了土壤異質(zhì)性對泥炭土中O2分布的影響并得出相似的結(jié)果。Elberling等[74]研究了土壤水位顯著變化后，近地表O2的表觀擴散率對土壤CO2和CH4排放的影響(圖 3B)。結(jié)果表明在排水條件下，O2的消耗量超過CO2的產(chǎn)量且當有氧區(qū)的范圍大于40 cm時，CH4排放可忽略不計；在淹水條件下，除了簡單的氣體擴散，O2還可以在水相中通過植物通氣組織進行傳輸。

4.1.3 土壤添加物 土壤外源添加物會進一步提高土壤有機質(zhì)和養(yǎng)分的空間異質(zhì)性，并通過影響微生物生物量及其活性進而改變土壤O2的有效性和空間分布[75]。利用O2光極實時監(jiān)測添加外源有機物后土壤O2的時空動態(tài)變化，對于揭示土壤氧化代謝異質(zhì)性、農(nóng)田溫室氣體減排以及土壤重金屬修復等方面具有重要意義。Zhu等[17]探討了不同的糞肥處理方法對土壤中O2分布及其對N2O和CO2等溫室氣體排放速率的影響，發(fā)現(xiàn)土壤中O2含量與N2O排放呈顯著負相關(guān)關(guān)系。隨后，Christel等[76]結(jié)合O2光極和薄膜擴散梯度技術(shù)，研究了糞肥和由固體糞肥制成的生物質(zhì)炭在土壤中的異質(zhì)分布對土壤O2含量的影響，發(fā)現(xiàn)施用固體糞肥和生物質(zhì)炭均會不同程度導致土壤O2含量下降，且在第一周內(nèi)平均下降幅度最大。Van Nguyen等[77]將水力停留時間(hydraulic retention time)分別為 15 d(PO15)和 30 d(PO30)的沼渣施入到土壤表面后，發(fā)現(xiàn)土壤的缺氧區(qū)域在土層深度1.5 ～ 2.0 cm處發(fā)生了顯著變化(圖 3C)。易降解有機碳含量越高，土壤O2消耗越快(PO15 處理)；而在試驗后期，PO15 和PO30 處理的土壤O2含量都有所增加，這可能是環(huán)境O2的擴散輸入以及土壤O2消耗(微生物呼吸和硝化作用)減弱共同作用的結(jié)果。Kravchenko等[78]利用O2光極監(jiān)測了秸稈還田后土壤O2含量變化，揭示了微尺度下秸稈還田后N2O排放機制與土壤孔隙分布以及秸稈降解引發(fā)的厭氧微域之間的關(guān)系。Rubol等[79]比較分析了不同利用類型的土壤在添加葡萄糖后土壤O2的二維分布，發(fā)現(xiàn)外源葡萄糖的添加會在短時間(5 ～ 15 min)內(nèi)提高局部微生物代謝活性，形成缺氧熱點區(qū)域，隨后土壤氧化還原態(tài)的空間異質(zhì)性會隨著O2濃度的下降而逐漸減小，且土壤的這種局部異質(zhì)性與O2濃度之間的拋物線形關(guān)系在不同利用類型的土壤中具有普遍性。除了添加外源有機物外，Elberling等[80]還觀察到蚯蚓分泌的黏液會在土壤中形成一個較大的缺氧微區(qū)(約0.1 cm2大小)，這可能會對土壤中的一些厭氧過程(如反硝化作用等)產(chǎn)生影響。此外，Hoefer等[81]聯(lián)合薄膜擴散梯度和O2光極研究單質(zhì)硫(S0)的施用對重金屬活化遷移和植物吸收的影響，發(fā)現(xiàn)硫的氧化會導致根部土壤酸化以及相關(guān)的金屬元素Mn、Zn和Cd的活化遷移。

4.2 土壤pH

采用pH光極技術(shù)可以在土壤以及根–土界面實時監(jiān)測pH的動態(tài)變化，且不會對土壤本身的微環(huán)境體系產(chǎn)生干擾。

4.2.1 植物根系 平面光極的應用首次實現(xiàn)了植物根際pH二維分布的定量可視化分析，表明植物根系可以驅(qū)動根際土壤pH變化，同時pH隨距離根表面的遠近、沿根軸位置的變化而變化[30,82]。Blossfeld等[83]的研究結(jié)果表明，黑麥草和黑麥草幼根使根際pH分別提高了1.7 和1.5 個pH單位，而玉米則使根際酸化了 0.7 個pH單位，這種pH變化對根際痕量金屬的溶解以及植物對重金屬元素的吸收有顯著影響。Hoefer等[84]結(jié)合平面光極與薄膜擴散梯度技術(shù)，發(fā)現(xiàn)沙柳根際土壤pH的下降會導致Al3+、Co2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+、Pb2+等金屬離子的溶解性升高(圖 4A)。Rudolph-Mohr等[85]還發(fā)現(xiàn)玉米幼苗根際pH的動態(tài)變化主要取決于根系年齡和土壤含水量。還有一些研究強調(diào)了根際pH和O2濃度、有機酸之間的動態(tài)關(guān)系。例如，Schreiber等[72]結(jié)合平面pH、O2光極探究了兩種耐澇植物在淹水過程以及淹水后其根際酸化的晝夜節(jié)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于大量低分子有機酸的積累導致根尖根際pH降低達 0.8 個單位，但對兩種耐澇植物根系的生理生長沒有影響。此外，F(xiàn)aget等[86]結(jié)合pH光極和綠色熒光蛋白標記(GFP)技術(shù)，對兩種間作植物的根進行識別、鑒定并觀察其根際的pH變化。研究發(fā)現(xiàn)菜豆和玉米間作時，其根際的酸化或堿化效應小于非根際土壤，且與二者獨立生長時的根際酸化過程存在明顯差異，這有助于理解不同物種根系之間以及與土壤之間的相互作用關(guān)系。

4.2.2 土壤添加物 農(nóng)田土壤中的各種添加物(秸稈、化肥、生物質(zhì)炭等)在很大程度上會影響土壤的酸堿平衡及其異質(zhì)性。大量研究證明生物質(zhì)炭可以提高酸性土壤pH，增強土壤抗酸化能力[87]。然而在生物質(zhì)炭顆粒尺度上，有關(guān)生物質(zhì)炭–土壤界面的pH分布以及這種空間分布如何隨時間變化的研究還比較缺乏。Buss等[88]就利用pH光極實時監(jiān)測了生物質(zhì)炭顆粒–土壤界面的pH分布。他們將污泥生物質(zhì)炭和麥稈生物質(zhì)炭分別施用于酸性砂土，并在21 h后觀察到土壤–生物質(zhì)炭界面的pH分布從生物質(zhì)炭顆粒邊緣延伸至其粒徑的1 倍～ 1.3 倍距離處。

4.3 土壤CO2

目前，測量土壤CO2的傳統(tǒng)分析技術(shù)所得時空分辨率通常較低，無法直接獲取根際等土壤微域的實際CO2濃度及其異質(zhì)分布。平面光極可以連續(xù)獲得土壤CO2的二維分布信息，彌補了現(xiàn)有監(jiān)測手段的不足。Blossfeld等[19]在淹水土壤中的芥菜根附近檢測到高濃度的CO2，研究發(fā)現(xiàn)這與根呼吸以及局部微生物活性的增強緊密相關(guān)(圖 4B)。在另一項研究中，Koop-Jakobsen等[89]在連續(xù)光照、黑暗循環(huán)處理下對大米草根際CO2動態(tài)進行了持續(xù)觀測，發(fā)現(xiàn)大米草根際能夠?qū)喔?12.6 mm范圍的土壤CO2產(chǎn)生影響，其CO2含量是非根際土壤的3 倍且不受光照變化的影響。

4.4 土壤NH4+

NH4+光極的開發(fā)極大地促進了根區(qū)氮素周轉(zhuǎn)的研究。Str?mberg等[90]對番茄植株的根際NH4+進行了定量研究，發(fā)現(xiàn)番茄的整個根系結(jié)構(gòu)對NH4+都有較強的吸收，尤其是根尖區(qū)域?qū)H4+的獲取起著重要作用，且橫向細根的吸收效率是主根的兩倍左右。Str?mberg和Hulth[91-92]還利用NH4+光極記錄了施肥后土壤NH4+的分布與擴散。此外，施肥技術(shù)的選用不僅會影響土壤NH4+的空間分布，也會影響氮素的凈礦化，從而影響土壤有效氮轉(zhuǎn)化的動態(tài)變化規(guī)律。Delin和Str?mberg[34]利用NH4+光極比較了雞糞和牛糞的施用對農(nóng)田土壤的氮素礦化過程和NH4+空間分布的影響(圖 4C)。結(jié)果表明，施肥后肥料中的大部分NH4+被快速吸附到黏粒中，因此黏粒含量較低的砂土NH4+含量顯著高于黏土，同時深施有機肥有助于提高土壤NH4+含量。

4.5 其他

除O2、pH、CO2等常用光極外，開發(fā)其他參數(shù)的二維監(jiān)測是平面光極技術(shù)發(fā)展的主要方向之一。Pedersen 等[13]開發(fā)了一種NO– 3光極，對NO– 3的有效響應范圍可達 1 ～ 50 mmol，這為實時監(jiān)測植物根系或異養(yǎng)細菌在多孔介質(zhì)中對NO– 3的吸收提供了研究手段。此外，平面光極技術(shù)與其他技術(shù)的聯(lián)合擴展了其在土壤微觀異質(zhì)性研究中的應用，也有利于進一步解析關(guān)鍵生物地球化學過程的空間異質(zhì)性和動態(tài)變化。如前所述，目前已開發(fā)出O2-DGT、pH-DGT等[93]平面光極-DGT聯(lián)用技術(shù)。Williams等[70]結(jié)合DGT、激光剝蝕(laser ablation)和平面光極3 項技術(shù)，首次發(fā)現(xiàn)水稻根尖附近存在重金屬釋放通道，為研究元素地球化學循環(huán)提出了新思路。又如，結(jié)合O2光極和微流控技術(shù)，可同時獲取微流控系統(tǒng)內(nèi)的O2梯度分布和內(nèi)部物理結(jié)構(gòu)的動態(tài)信息[94]。再如，平面光極與酶譜技術(shù)的聯(lián)合，促進了土壤酶學和土壤生物過程的研究。Ma等[95]結(jié)合土壤酶譜法和pH光極探討了磷的有效性對羽扇豆排根形成前后的根際磷酸酶活性、pH以及根際擴展范圍的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在形成排根之前，根系吸收磷素的主要策略是增加磷酸酶活性，酸化根際土壤并擴大主根周圍的根際范圍；而在排根形成之后，根系會調(diào)整吸收磷素的關(guān)鍵機制，主要是增加排根周圍磷酸酶活性熱點區(qū)域的面積，并擴大根際有效范圍。

5 展望

傳統(tǒng)技術(shù)的破壞性采樣或者侵入性探測破壞了土壤微域的結(jié)構(gòu)，影響了測量結(jié)果的可靠性，且無法反映土壤熱點區(qū)域和熱點時刻的動態(tài)變化過程。平面光極技術(shù)的原位、實時、無損、高時空分辨率等特點，彌補了現(xiàn)有監(jiān)測手段的不足，可以準確獲取土壤關(guān)鍵理化參數(shù)的微尺度變化過程和分布特征，這對于理解土壤復雜的生物地球化學過程具有重要意義。在技術(shù)發(fā)展和實際應用層面，以下幾個方面將可能成為未來的重點發(fā)展方向。

1) 提高傳感膜的光穩(wěn)定性，改進制膜工藝，進一步提高傳感器的使用壽命。同時，開展其他發(fā)光指示劑的制取及性能測試工作，用于開發(fā)其他參數(shù)監(jiān)測的平面光極，如測量其他陰離子、金屬陽離子和酶的活性等，也是后續(xù)工作的重點內(nèi)容。

2) 平面光極熒光定量的特性參數(shù)有很多，除了激發(fā)與發(fā)射波長、熒光壽命之外，還有熒光量子產(chǎn)率、熒光偏振等。針對上述不同的熒光特征，可以開發(fā)同步掃描、導數(shù)光譜、三維光譜、時間分辨率和相分辨率等新技術(shù)，提高熒光分析的選擇特異性。

3) 目前研究人員陸續(xù)開發(fā)了一系列包括雙參數(shù)乃至于多參數(shù)同時分析的復合平面光極技術(shù)，例如：O2/CO2、O2/pH、O2/CO2/pH等，復合平面光極依據(jù)不同的熒光發(fā)射光譜進行區(qū)分，實現(xiàn)對不同化學組分的同步實時測量，這將是平面光極研究的一個重要方向。

4) 平面光極與其他多種技術(shù)手段聯(lián)用，分析關(guān)鍵元素尤其是重金屬、C、N、P的生物地球化學反應過程以及土壤酶活性等也是未來的研究熱點之一。以目前已開發(fā)出的PO-DGT技術(shù)為例，可以在此基礎(chǔ)上優(yōu)化DGT容量和平面光極響應時間之間的權(quán)衡，以及開發(fā)PO-DGT聯(lián)合技術(shù)對其他參數(shù)的研究，這對于PO-DGT技術(shù)的發(fā)展至關(guān)重要。

本文綜述了國內(nèi)外關(guān)于平面光極應用的創(chuàng)新研究，并展現(xiàn)了平面光極技術(shù)在復雜、異質(zhì)的土壤環(huán)境中獲取高分辨率數(shù)據(jù)的獨特潛力。平面光極的持續(xù)應用與發(fā)展可以為復雜動態(tài)生境的生物地球化學研究提供強有力的工具，在土壤學研究領(lǐng)域有著廣闊的發(fā)展空間，尤其是與其他分析技術(shù)相結(jié)合，有助于深入研究土壤關(guān)鍵元素的生物地球化學轉(zhuǎn)化機制以及實現(xiàn)精細的模型模擬。

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Principle of Planar Optode and Its Application in Investigating Microscale Soil Heterogeneity

RAN Hongyu, YEXin, ZHU Xiaoyan, WANG Gang, ZHU Kun*

(College of Land Sciences and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China)

The conventional study of soil physicochemical properties often relies on the ex-situ sampling and determination, failing to reflect the soil environment’s heterogeneity because of the destructive sampling processes.The process disturbs the original structure and ignores the heterogeneity of soil microsites.In recent years, planar optode with high spatiotemporal resolution has gained more attention in investigating soil biogeochemical processes.Based on the luminescence principle, the specific luminescent indicator that is sensitive to different solutes is embedded into the matrix to make a sensing membrane, then records its two-dimensional emission signals using digital imaging technology.Therefore, high resolution and sensitive dynamic characteristics of solutes can be continuously obtained by changing the indicator luminescence signal with relatively simple experimental configurations.So far, planar optode has been successfully deployed to monitor the dynamics of O2, pH, CO2, NH4+and other important physicochemical parameters in soil.This paper introduced the main compositions of planar optode system, listed the methods of quantitative analysis, reviewed the main capabilities and limitations and summarized the main applications of planar optode in the study of soil microscale heterogeneity.Further, opportunities of planar optode were discussed for future development and applications in soil science and agricultural environment.

High resolution; Continuouslymonitoring; Two-dimensional imaging

S151.9+5

A

10.13758/j.cnki.tr.2021.05.005

冉洪芋, 葉馨, 朱曉艷, 等.平面光極基本原理及其在土壤微觀異質(zhì)性研究中的應用.土壤, 2021, 53(5): 916–928.

國家重點研發(fā)計劃項目(2017YFD020080-02)資助。

通訊作者(kunzhu@cau.edu.cn)

冉洪芋(1997—)，女，重慶涪陵人，碩士研究生，主要從事生物質(zhì)炭–土壤互作研究。E-mail: hyran@cau.edu.cn