不同來源沼液對(duì)土壤微生物群落碳代謝的影響*

李鈺飛,許俊香,劉本生,孫欽平,李吉進(jìn),劉建斌,郎乾乾,孫仁華,靳紅燕

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所 北京 100097;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)生態(tài)與資源保護(hù)總站 北京 100125;3.中國城市建設(shè)研究院有限公司西北分院 北京 100120)

20世紀(jì)80年代以來,我國規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)得到了快速發(fā)展,同時(shí)伴隨著畜禽糞便的大量產(chǎn)生,極大增加了面源污染風(fēng)險(xiǎn)[1]。沼氣工程通過厭氧發(fā)酵工藝處置養(yǎng)殖廢棄物,使得環(huán)境污染得到了有效改善[2]。與此同時(shí),產(chǎn)生的副產(chǎn)物沼液含有豐富的養(yǎng)分和微量元素,還可作為土壤改良劑或有機(jī)肥料應(yīng)用于種植業(yè)[3]。大量研究證實(shí),合理施用沼液有利于改善土壤理化性狀[4-6],提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)[7-8],防控作物土傳病害[3,9-10]。

雞糞、豬糞和牛糞是沼氣工程常用的發(fā)酵原料,不同種類的畜禽糞便特性存在明顯差異。例如雞糞各種養(yǎng)分含量均較高,含有大量易分解有機(jī)物[11],養(yǎng)分釋放快,其主要作用是提高或維持作物產(chǎn)量;牛糞相對(duì)來說養(yǎng)分較低,但碳氮比高,有研究表明長(zhǎng)期施用牛糞可以改善土壤物理性狀[12-13];Hafez[14]發(fā)現(xiàn)牛糞比雞糞更有利于降低土壤容重。不同種類畜禽糞便經(jīng)沼氣發(fā)酵后碳氮比均會(huì)降低[15],但依然在一定程度上保持著差別[16]。例如趙鳳蓮等[17]的盆栽試驗(yàn)證實(shí)雞糞沼肥要比牛糞沼肥增產(chǎn)明顯,而后者的養(yǎng)分釋放較為緩慢。由此可見,不同來源的沼液進(jìn)入土壤后對(duì)地下生態(tài)過程產(chǎn)生的影響也勢(shì)必存在差異。

土壤生物是地下生態(tài)過程的執(zhí)行者[18],其中土壤微生物是土壤生物類群的重要組成部分。作為食物網(wǎng)中的分解者[19],其占據(jù)食物網(wǎng)80%以上的生物量[20],參與土壤有機(jī)質(zhì)的分解與合成、養(yǎng)分的固定與釋放以及污染物的降解等過程,并且與土壤團(tuán)聚體的形成密切相關(guān)[21]。土壤擾動(dòng)會(huì)導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)、代謝特征和功能多樣性的變化,反過來這些也可作為土壤質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[22]。針對(duì)土壤微生物群落對(duì)沼液施用的響應(yīng),已有不少學(xué)者從不同角度開展了研究,例如沼液肥與其他肥料的對(duì)比[15,23],不同的沼液用量[2,24],沼液與其他材料配施[25-26],但尚少見不同發(fā)酵原料產(chǎn)生的沼液對(duì)土壤微生物群落影響的報(bào)導(dǎo)。

基于以上的研究背景,本研究將通過室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn),對(duì)比雞糞、牛糞和豬糞3 種常見來源的沼液加入土壤后的土壤微生物碳代謝特征,并結(jié)合土壤理化指標(biāo)和微生物生物量碳氮指標(biāo)闡明不同來源沼液引發(fā)短期的土壤微生物群落變化的差異,為沼液的資源化利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤及樣品采集

本研究為室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn),在北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所溫室內(nèi)進(jìn)行。試供土壤采集自北京市大興區(qū)北京青圃有機(jī)農(nóng)業(yè)專業(yè)合作社溫室,

土壤基礎(chǔ)理化性狀為:有機(jī)質(zhì)19.7 g·kg?1,全氮1.2 g·kg?1,速效磷72.7 mg·kg?1,有效鉀194.9 mg·kg?1,pH 8.20,電導(dǎo)率107.7 μS·cm?1。選取1 m2作為采樣樣方,用鐵鏟挖取表層0～20 cm 土壤帶回實(shí)驗(yàn)室,并于1 周內(nèi)完成試驗(yàn)布置。沼液來源于大興區(qū)不同的沼氣站,其中雞糞沼液采集自留民營(yíng)沼氣站,牛糞沼液源自于趙莊子鎮(zhèn)沼氣站,豬糞沼液取自北蒲州沼氣站。3 種沼液均為厭氧發(fā)酵罐當(dāng)天的流出液,取回后于4 ℃冰箱保存,理化性質(zhì)見表1。

表1 不同來源沼液的化學(xué)性狀Table 1 Chemical properties of different biogas slurry

1.2 試驗(yàn)布置

試驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)處理:雞糞源沼液(FS)、豬糞源沼液(PS)、牛糞源沼液(CS)和對(duì)照(CK),每個(gè)處理3次重復(fù),隨機(jī)區(qū)組排列。沼液添加量依據(jù)等氮原則(0.17 g·kg?1鮮土),不同處理稀釋成等體積的沼液加入土壤,對(duì)照處理以等量的蒸餾水代替。試驗(yàn)所用盆為寬8 cm、高10 cm 的方形盆,每盆加入過2 mm篩的土壤450 g,然后加稀釋后沼液100 mL,避光培養(yǎng)。培養(yǎng)期間,每隔3 d 按等重法補(bǔ)充水分。所有樣本于60 d 后取樣,一部分土樣置于4 ℃冰箱冷藏用于測(cè)定微生物量碳氮和微生物碳代謝,剩余部分風(fēng)干處理用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)。

1.3 土壤化學(xué)性質(zhì)分析

土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮以1 mol·L?1NaCl 浸提后用流動(dòng)分析儀測(cè)定,有機(jī)質(zhì)含量測(cè)定方法為重鉻酸鉀氧化法,全氮含量采用凱式蒸餾法測(cè)定,有效磷含量采用NaHCO3提取鉬銻抗比色法測(cè)定,速效鉀含量測(cè)定方法為乙酸銨浸提-火焰光度法,pH 采用pH 計(jì)測(cè)定(水土比2.5∶1),電導(dǎo)率用電導(dǎo)儀測(cè)定(水土比5∶1)[27]。

1.4 土壤微生物分析

土壤微生物量碳氮采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法測(cè)定,轉(zhuǎn)換系數(shù)為0.45[28]。微生物群落評(píng)價(jià)采用基于微生物碳代謝功能的BIOLOG 微平板培養(yǎng)法測(cè)定。參考林先貴[29]的方法,取鮮土10 g 加入三角瓶中,于渦旋震蕩儀上震蕩2 min。吸取1 mL 液體于小試管中,震蕩30 s,吸取小試管中土壤懸濁液3 mL 轉(zhuǎn)移至離心管中,震蕩20 s,再轉(zhuǎn)移至V 型槽中,用八道移液槍向BIOLOG 板每孔加入150 μL 液體,置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。前2日每隔12 h 用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度,從第3日起每隔24 h 測(cè)定吸光度(590 nm),總計(jì)培養(yǎng)7 d。采用平均吸光度(AWCD)、Shannon 豐富度指數(shù)(H′)、Simpson 優(yōu)勢(shì)度指數(shù)(1/D)和McIntosh 均一度指數(shù)(U)來評(píng)價(jià)微生物群落。

式中:Ci為各孔的吸光值,R為對(duì)照孔的吸光值,當(dāng)Ci?R為負(fù)數(shù)時(shí)記為零[29]。

式中:pi為第i孔相對(duì)吸光度與整板平均相對(duì)吸光度總和的比率。

式中:ni是第i孔的相對(duì)吸光度(Ci?R),N是相對(duì)吸光度總和,Simpson 指數(shù)用1/D表示[30]。

式中:ni是第i孔的相對(duì)吸光度(Ci?R)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用單因素方差分析比較土壤化學(xué)指標(biāo)和微生物指標(biāo)在不同處理間的差異,多重比較方法為L(zhǎng)SD,設(shè)置顯著性水平為P<0.05。方差分析前先進(jìn)行齊次性檢驗(yàn),對(duì)于不滿足齊次性假設(shè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù),開平方或反正弦轉(zhuǎn)換;若仍不滿足要求,則采取非參數(shù)檢驗(yàn)方法(Kruskal-Wallis),并用Mann-Whitney 兩兩比較處理間的差異。所有統(tǒng)計(jì)分析在SPSS 16.0 中完成。

采用主成分分析(PCA)呈現(xiàn)處理間微生物群落的差異,分析前微生物碳代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)n(10 000x+1)轉(zhuǎn)換。分析在Canoco 5.0 中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源沼液對(duì)土壤理化性狀的影響

添加不同來源的沼液對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)含量無顯著影響,但對(duì)其他土壤養(yǎng)分總體表現(xiàn)出不同程度的促進(jìn)作用(表2)。與對(duì)照相比,沼液對(duì)土壤硝態(tài)氮含量的增加效果表現(xiàn)為豬糞沼液>雞糞沼液>牛糞沼液(P<0.05);對(duì)于土壤銨態(tài)氮含量,豬糞沼液處理顯著高于牛糞沼液處理(P<0.05),而各沼液與對(duì)照處理并無顯著差異;與此同時(shí),不同沼液均顯著提高了土壤全氮含量(P<0.05)。各處理中有效磷含量最高的是雞糞沼液處理,有效鉀最高的是豬糞沼液處理,而這兩個(gè)指標(biāo)在對(duì)照土壤中均最低。此外,施用沼液后各處理的pH 和電導(dǎo)率值也均有不同程度升高。

表2 不同來源沼液對(duì)土壤理化性狀的影響Table 2 Effects of different biogas slurry on soil physical and chemical properties

2.2 不同來源沼液對(duì)微生物量碳氮的影響

經(jīng)過60 d 的培養(yǎng),牛糞沼液處理獲得了最高的微生物生物量碳,顯著高于豬糞沼液(P<0.05)(圖1),但與對(duì)照和雞糞沼液處理相比并無顯著差異,而添加豬糞沼液則顯著降低了微生物生物量碳(P<0.05),但其同雞糞沼液的結(jié)果相比并無顯著差異。微生物生物量氮在不同處理間盡管存在差別,但并未達(dá)顯著差異水平。

2.3 不同來源沼液對(duì)土壤微生物碳源利用的影響

如圖2所示,各土壤樣品的孔平均顏色變化率隨著培養(yǎng)時(shí)間而逐漸升高,在48 h 之前不同處理間的差異尚不明顯,從72 h 開始變化規(guī)律逐漸明朗,主要表現(xiàn)在雞糞沼液可引發(fā)微生物最高的碳源利用強(qiáng)度,牛糞沼液與對(duì)照處理較為接近,而豬糞沼液有抑制微生物碳源利用的趨勢(shì)。

圖3 展示了土壤微生物對(duì)六大類碳源的利用情況。微生物對(duì)碳水化合物(Car)的利用在雞糞沼液處理中最高,顯著高于豬糞沼液(P<0.05),而處于二者之間的對(duì)照和牛糞沼液處理則均與其他處理無顯著差異。對(duì)于氨基酸(Ama),添加不同源沼液均有抑制微生物利用碳源的趨勢(shì),但僅在豬糞沼液處理中達(dá)顯著水平(P<0.05),而后者與雞糞和牛糞處理也無顯著差異。雞糞沼液相比其他處理顯著促進(jìn)了微生物對(duì)羧酸(Caa)的利用(P<0.05),這個(gè)指標(biāo)在牛糞、豬糞和對(duì)照處理間并無顯著差異。不同處理土壤微生物對(duì)胺類(Ami)的利用程度也可劃分為3 個(gè)層次,雞糞沼液起到了促進(jìn)作用,孔顏色變化率顯著高于處于第3 層次的對(duì)照和豬糞沼液(P<0.05),而后兩者并無顯著差異,處于中間層次的牛糞沼液處理與其他處理均無顯著差異。

微生物群落的豐富度(H')和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)(1/D)在不同處理間表現(xiàn)出一致的規(guī)律,即雞糞沼液處理的數(shù)值最高,顯著高于其他處理(P<0.05),其次為牛糞沼液處理,其數(shù)值顯著高于豬糞沼液處理(P<0.05),而處于它們中間的對(duì)照處理則與二者均無顯著差異(圖4)。均一度指數(shù)(U)最高的也是雞糞沼液處理,但其僅顯著高于豬糞處理(P<0.05),與對(duì)照和牛糞沼液處理均無顯著差異。

2.4 微生物碳代謝群落排序分析

不同沼液處理下微生物碳代謝群落的差異程度如圖5所示。PCA 分析1 軸解釋度為28.38%,2 軸的解釋度為21.96%?？傮w而言豬糞沼液處理同對(duì)照的差異最大,相比而言牛糞和雞糞沼液對(duì)微生物群落代謝的影響較小。

2.5 土壤化學(xué)性狀與微生物指標(biāo)的相關(guān)性分析

如表3所示,土壤理化性狀同微生物碳代謝的六大類碳源存在不同程度的相關(guān)性,其中相關(guān)性最強(qiáng)的為氨基酸,其同土壤硝態(tài)氮、全氮、速效鉀和電導(dǎo)率4 項(xiàng)均顯著(P<0.05)或極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。相比而言多樣性指標(biāo)同各理化性狀不存在顯著的相關(guān)性。土壤微生物量碳含量與硝態(tài)氮及速效鉀呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05),而微生物生物量氮含量同pH 和電導(dǎo)率呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。

表3 土壤微生物指標(biāo)與土壤化學(xué)性狀相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between soil microbial indices and soil chemical properties

3 討論

施用沼液可有效提升土壤養(yǎng)分[5-6]。然而在本試驗(yàn)中,3 個(gè)沼液處理的土壤有機(jī)質(zhì)含量與對(duì)照處理并無顯著差異。這主要與沼液的養(yǎng)分特性有關(guān)。盡管沼液中有機(jī)物質(zhì)豐富,但大多容易氧化分解而損失[24],且沼液中氮素以速效態(tài)為主[31-32],氮的投入促進(jìn)了非自養(yǎng)微生物對(duì)有機(jī)碳的消耗[33],從而抵消了沼液攜帶有機(jī)物在土壤中的累積,這個(gè)結(jié)果與黃繼川等[24]在水稻田中沼液施用后土壤有機(jī)質(zhì)的表現(xiàn)一致。除有機(jī)質(zhì)外,各沼液處理中的其他土壤養(yǎng)分均呈現(xiàn)出不同程度的升高。值得注意的是,豬糞沼液處理中硝態(tài)氮的增幅最大,其次為雞糞沼液處理,這個(gè)結(jié)果可以由沼液中銨態(tài)氮和總氮的比率來解釋。經(jīng)計(jì)算,豬糞、雞糞和牛糞沼液的銨態(tài)氮與總氮比分別為0.86、0.67 和0.24(表1),在等氮投入的條件下豬糞沼液攜帶的銨態(tài)氮最多,沼液進(jìn)入土壤后銨態(tài)氮迅速轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮[34],造成了豬糞沼液處理中土壤硝態(tài)氮含量最高的結(jié)果。

不同來源沼液不僅對(duì)土壤化學(xué)性狀產(chǎn)生了顯著的影響,也進(jìn)一步影響了土壤中的微生物。土壤微生物量碳氮是土壤養(yǎng)分庫中最活躍的組分,也是植物可利用營(yíng)養(yǎng)的重要來源[35],其對(duì)有機(jī)物料的投入反映敏感[36-37],常用來指示土壤肥力[38]。此前的報(bào)道證實(shí)沼液的投入有利于提高土壤微生物量碳[2,23,39-40]。然而在本研究中,僅牛糞的土壤微生物量碳略高于對(duì)照,且未達(dá)到顯著性水平。這可能與試驗(yàn)條件有關(guān),以上提及的研究均為田間試驗(yàn),周期較長(zhǎng),且有地上作物種植,本研究為室內(nèi)短期培養(yǎng)試驗(yàn),因此土壤中的生物化學(xué)過程可能同田間環(huán)境的存在較大差別[10,26]。此外,盡管氮素投入被認(rèn)為是刺激土壤微生物量碳的關(guān)鍵因素[4],但沼液中大量銨態(tài)氮在短期內(nèi)有可能起到抑制微生物生長(zhǎng)的作用。例如曹云等[41]研究發(fā)現(xiàn)盆栽體系中施用沼液后土壤中細(xì)菌數(shù)量并未增長(zhǎng),甚至有降低趨勢(shì)。在這個(gè)因素的作用下豬糞沼液造成了土壤微生物量碳的降低。相比之下,牛糞源沼液具有相對(duì)較高的碳氮比,使得更多的碳源進(jìn)入土壤被微生物利用,一定程度上緩沖了抑制作用。由此可見,不同來源沼液對(duì)微生物生物量的影響存在差異。

基于微生物代謝功能的BIOLOG 微平板技術(shù)是一種常見的表征微生物群落和多樣性的方法[42],廣泛應(yīng)用于土壤生態(tài)學(xué)研究[43]。該方法通過監(jiān)測(cè)不同種類微生物對(duì)單一碳源底物利用能力的差異,從而獲得土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性的信息[44],可作為預(yù)測(cè)土壤質(zhì)量變化的有力工具[45]。吸光度AWCD 值表征微生物利用碳源的整體能力[44,46]。在本研究中,與土壤微生物量碳表現(xiàn)相似的是,豬糞沼液處理的AWCD 值也受到了抑制,主要源于氨基酸(Ama)的降低。通過相關(guān)性分析的結(jié)果可知,Ama 的表現(xiàn)與豬糞沼液加入引發(fā)的土壤理化性狀變化密切相關(guān)。鄭學(xué)博等[25]也發(fā)現(xiàn)施用豬糞沼液可造成土壤微生物碳代謝強(qiáng)度輕微下降。相比之下,雞糞沼液施用引發(fā)了最高的微生物碳源利用,主要與碳水化合物、羧酸和胺類的升高有關(guān)。對(duì)碳源利用的差異更清晰地呈現(xiàn)在PCA 上,土壤微生物代謝功能的群落結(jié)構(gòu)以豬糞沼液處理產(chǎn)生的影響最為明顯。

土壤微生物多樣性與地下生態(tài)系統(tǒng)功能密切相關(guān)[47],高多樣性往往預(yù)示著更好的土壤質(zhì)量。生物多樣性的指標(biāo)繁多,本研究采用了常見的Shannon 豐富度、Simpson 優(yōu)勢(shì)度和McIntosh 均一度3 個(gè)指數(shù)[29]。Shannon 指數(shù)主要用于反映微生物群落的豐富程度;Simpson 指數(shù)與其相反,是對(duì)群落集中性的度量,并且側(cè)重于常見種類;McIntosh 指數(shù)則基于群落物種在多維空間上距離,是對(duì)均一性的度量。三者從不同側(cè)面評(píng)價(jià)土壤微生物群落的功能多樣性[30]。關(guān)于沼液對(duì)土壤微生物多樣性的影響,有的報(bào)道顯示施用沼液可顯著提高土壤微生物的多樣性[3,41,48],也有研究發(fā)現(xiàn)沒有顯著影響[2],甚至得出相反的結(jié)果[25]。上述不一致的結(jié)果,一方面與沼液的施用量有關(guān)[25],也可能與沼液的種類和自身的特性相關(guān)。本研究中3 個(gè)指數(shù)最高值均出現(xiàn)在雞糞沼液處理,反映出雞糞沼液有利于提高土壤微生物碳代謝的多樣性和均勻度,相比之下豬糞沼液表現(xiàn)出抑制的趨勢(shì)。然而,相關(guān)性分析顯示多樣性指標(biāo)與監(jiān)測(cè)的各類土壤理化性狀指標(biāo)均無顯著相關(guān)性。因此,尚不能判斷本試驗(yàn)中引發(fā)處理間微生物碳代謝多樣性差異的因素。沼液中成分復(fù)雜,除了含有可供植物根系和土壤生物利用的養(yǎng)分外,還含有可影響地下生態(tài)系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)的微量元素、有機(jī)酸小分子,以及重金屬元素等物質(zhì)[16],這些指標(biāo)在本研究的土壤分析中未涉及,但可能是影響微生物碳代謝的重要因子?？傮w上雞糞沼液和豬糞沼液對(duì)土壤微生物碳代謝的影響表現(xiàn)出相反的趨勢(shì),雞糞沼液為促進(jìn)作用,而豬糞沼液呈現(xiàn)出抑制效應(yīng)。

值得注意的是,盡管本試驗(yàn)采用的BIOLOG 微平板培養(yǎng)方法因方便快捷而受到廣泛應(yīng)用,但這種方法也存在著一定的局限性[49],例如其不能反映微生物休眠體,或者那些不能利用BIOLOG 碳源底物的群體的情況[29];被測(cè)試的底物不能準(zhǔn)確地代表土壤中出現(xiàn)的底物類型[49]。因此,這種方法只能粗略地反映土壤微生物群體底物利用的動(dòng)力學(xué)特征[49],而對(duì)微生物種類和多樣性特征的呈現(xiàn)則相當(dāng)有限。相比而言,分子生物學(xué)方法在這些方面更具有優(yōu)勢(shì),宜在后續(xù)的研究中采用。此外,本研究為室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn),探索的是沼液對(duì)土壤微生物的短期“激發(fā)”效應(yīng),但還不足以說明問題。沼液作為肥料資源,其農(nóng)學(xué)效應(yīng)、環(huán)境效應(yīng)以及土壤生物學(xué)效應(yīng),更需要得到田間數(shù)據(jù)的支撐。因此,未來宜轉(zhuǎn)入田間,并結(jié)合分子生物學(xué)方法開展研究,甚至可設(shè)置連續(xù)多年的試驗(yàn),以明確不同來源沼液肥料對(duì)土壤生物群落的長(zhǎng)期影響。

4 結(jié)論

1)在短期的室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)中,雞糞、牛糞和豬糞源沼液對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)含量無顯著影響,但相比對(duì)照,各沼液處理對(duì)土壤無機(jī)氮、全氮、有效磷、速效鉀、pH 和電導(dǎo)率均起到了不同程度的促進(jìn)效果。

2)土壤微生物生物量碳在牛糞沼液處理中最高,而豬糞沼液中微生物量碳則同對(duì)照相比顯著降低。

3)雞糞沼液引發(fā)了微生物最高的碳源利用強(qiáng)度,而豬糞沼液則表現(xiàn)出抑制的趨勢(shì)。相比其他處理,雞糞沼液顯著提高了土壤微生物的Shannon 豐富度和Simpson 優(yōu)勢(shì)度指數(shù)。主成分分析表明豬糞沼液處理的微生物碳代謝群落同對(duì)照的差異最大,相比而言牛糞和雞糞沼液對(duì)微生物代謝群落的影響較小。