垃圾滲濾液處理廠活性污泥微生物種群結(jié)構(gòu)和功能分析

張雪 喬雪姣 蘇佳 張立羽 余珂

北京大學(xué)深圳研究生院環(huán)境與能源學(xué)院, 深圳 518055; ? 通信作者, E-mail: yuke.sz@pku.edu.cn

垃圾滲濾液(landfill leachate)是在垃圾填埋過程中因雨水徑流和厭氧降解等綜合因素產(chǎn)生的高濃度有機廢水[1], 其氨氮含量高, 有機污染物種類繁多, 不僅含有簡單的烷烴、烯烴、酚類和酯類, 而且含有復(fù)雜的鹵代烴、酰胺類、多環(huán)芳烴和雜環(huán)芳烴等化合物[2]。未經(jīng)處理或處理不當(dāng)?shù)睦鴿B濾液,一旦進(jìn)入河流、農(nóng)田和地下水等自然生態(tài)系統(tǒng), 將嚴(yán)重污染生態(tài)環(huán)境, 對水生生物造成慢性和積累性的毒性, 對人類健康造成潛在威脅[3–5]。

目前, 垃圾滲濾液的處理方法分為物理方法、化學(xué)方法和生物方法。其中, 基于活性污泥的生物處理法具有運行成本低、處理效果好和無二次污染等優(yōu)點, 廣泛應(yīng)用于垃圾滲濾液處理中。活性污泥中含有豐富的微生物菌群, 可以利用垃圾滲濾液中的污染物作為生長基質(zhì), 誘導(dǎo)酶進(jìn)行同化, 以便維持生物量, 從而實現(xiàn)污染物的轉(zhuǎn)化分解, 達(dá)到凈化污水的目的[6]。因此, 深入了解活性污泥中微生物的種群結(jié)構(gòu)和功能基因, 對調(diào)控污泥微生物組成和提高污水處理效率有重要意義。

近年來, 高通量測序技術(shù)迅速發(fā)展, 為分析污泥微生物群落組成和動態(tài)變化、鑒定功能微生物菌群和功能基因以及研究微生物之間的相互作用關(guān)系提供了有力的手段[7]。高通量測序技術(shù)已應(yīng)用于不同廢水處理系統(tǒng)微生物的研究中, 如 Zhang 等[8]利用宏基因組測序技術(shù)研究 4 個污水處理廠的微生物群落結(jié)構(gòu), 發(fā)現(xiàn)處理生活污水的活性污泥微生物菌群比工業(yè)污水具有更高的多樣性; Fang 等[9]探究農(nóng)藥廢水處理廠活性污泥的優(yōu)勢菌屬, 發(fā)現(xiàn)區(qū)別于工業(yè)廢水和市政污水活性污泥的細(xì)菌屬; Joshi 等[10]對焦化廢水生物處理系統(tǒng)進(jìn)行研究, 結(jié)果表明Burkholderiales,Actinomycetales,Rhizobiales,Pseudomonadales和Hydrogenophiliales是重要的功能微生物類群, 芳香雙加氧酶、硝化酶和硫氰酸水解酶基因是含氮和含硫污染物生物轉(zhuǎn)化的重要功能基因。不同處理廠的原水特性使其活性污泥呈現(xiàn)獨特的細(xì)菌群落組成, 從而表現(xiàn)出不同的功能。

目前, 將活性污泥微生物應(yīng)用于垃圾滲濾液處理體系的研究還比較少。本研究提取垃圾滲濾液處理廠活性污泥的 DNA, 采用 16S rRNA 基因和宏基因組高通量測序手段, 分析污泥中微生物的菌群結(jié)構(gòu), 解析氮代謝和有機污染物代謝相關(guān)的功能基因,探究垃圾滲濾液和其他類型廢水處理系統(tǒng)微生物功能基因的差異, 旨在系統(tǒng)地探討垃圾滲濾液活性污泥的菌群多樣性和功能特征, 為構(gòu)建高效污水生物處理體系奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

活性污泥樣品采自深圳市羅湖區(qū)下坪垃圾填埋場 A/O 生化處理系統(tǒng)中的回流污泥, 采集時間為2019 年 12 月中旬。采樣當(dāng)月該廠生化進(jìn)水 COD 濃度為 4650 mg/L, NH4+-N 濃度為 1366 mg/L; 生化出水 COD 濃度為 1200 mg/L, NH4+-N 濃度為 11 mg/L。

新鮮的活性污泥樣品采集后立即置于冰桶中,運至實驗室并于當(dāng)天處理。樣品在 10000 rpm 條件下離心 15 分鐘, 去掉上清液, 保留活性污泥用于DNA 提取。

1.2 DNA 提取和高通量測序

采用 PowerSoilTM 試劑盒(MoBio Laboratories Inc., Carlsbad, 美國)提取活性污泥細(xì)菌基因組DNA, 使用 Nano Drop 2000 分光光度計(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)檢測提取 DNA的質(zhì)量和濃度, 使用通用引物 515F(3'-GTGYCAG CMGCCGCGGTAA-5')和 806R(5'-GGACTACNVGG GTWTCTAAT-3')擴增細(xì)菌 16S rRNA 基因的 V4區(qū)。PCR 產(chǎn)物用 TaKaRa MiNiBEST DNA 片段純化試劑盒 Ver.4.0 (TaKaRa, 日本)純化, 然后用凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢查。將基因組 DNA 和 16S rRNA 基因送至諾禾致源(天津)公司, 在 Illumina Hiseq 2500平臺上對宏基因組 DNA 和 16S rRNA V4 區(qū)進(jìn)行高通量測序, 分別獲得 34.2G 的宏基因組數(shù)據(jù)和 240M的 16S rRNA 基因數(shù)據(jù)。

1.3 16S rRNA 基因數(shù)據(jù)分析

使用 FastQC (v0.11.8)[11]和 Trimmomatic[12]軟件查看原始測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量并進(jìn)行過濾, 去除低質(zhì)量的序列。使用 QIIME2[13]軟件分析過濾后的 16S rRNA 基因序列。設(shè)置 97%的相似性閾值, 對序列進(jìn)行聚類, 形成可操作分類單元(operational taxonomic units, OTU), 使用 SILVA 非冗余數(shù)據(jù)庫[14]對OTU 進(jìn)行分類學(xué)注釋。

1.4 宏基因組數(shù)據(jù)分析

1.4.1 DNA 組裝與分箱(Binning)

使用 FastQC 和 Trimmomatic 軟件對宏基因組原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量優(yōu)化后, 采用 metaSPAdes (v3.13.1)[15]組裝軟件對宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝, kmer 值設(shè)置為 21, 33, 55, 77, 99 和 127。

宏基因組分箱(Binning)是將宏基因組測序得到的混合了不同生物的序列或序列組裝得到的重疊群(contigs)按物種分開歸類。本研究首先使用 Bowtie2(v2.2.6)[16]軟件, 將質(zhì)控后的原始數(shù)據(jù)映射(mapping)到組裝得到的 contigs 上, 計算每個 contig 的覆蓋率(Coverage), 使用 MaxBin2 (v2.2.7)[17]、MetaBAT(v2.12.1)[18]以及 CONCOCT (v0.4.2)[19]這 3 種不同的Binning 工具提取基因組, 并對基因組去冗余和質(zhì)量優(yōu)化。

1.4.2 基因組質(zhì)量評估和物種注釋

使用 CheckM (v1.1.2)軟件[20]評估基因組的大小、contig 數(shù)量、N50 值、GC 含量、完整度和污染度。計算基因組的質(zhì)量得分(完整度 ? 5 × 污染度)[21],挑選質(zhì)量得分高于 50 的基因組進(jìn)行后續(xù)分析。使用 GTDB-tk (v1.0.2)軟件[22], 對基因組進(jìn)行分類注釋。

1.4.3 基因功能注釋

使用 Prodigal 軟件[23], 對組裝文件和基因組文件進(jìn)行開放性閱讀框(open reading frames, ORFs)預(yù)測, 將 ORFs 提交至京都基因百科全書 KEGG (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html), 使用 BLAST程序[24], 將 ORFs 與 KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對, 構(gòu)建基因組的代謝通路圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 垃圾滲濾液處理廠活性污泥種群結(jié)構(gòu)

活性污泥對污水的處理性能與微生物的種群結(jié)構(gòu)密不可分。對垃圾滲濾液處理廠活性污泥中的微生物進(jìn)行 16S rRNA 基因測序, 經(jīng)質(zhì)量控制后得到440000 條有效序列。經(jīng) QIIME2 處理后得到 1258條差異 OTU, 與 SILVA 數(shù)據(jù)庫比對后得到活性污泥微生物的分類學(xué)注釋結(jié)果。

在垃圾滲濾液處理系統(tǒng)活性污泥中共檢測到 32 個門(圖 1), 其中 Calditrichaeota 是最豐富的門,占樣品的 58.77%; 其次是 Proteobacteria (變形菌門)和 Bacteroidetes (擬桿菌門), 分別占樣品的 16.80%和 6.19%。這 3 個門的微生物豐度占樣品的 80%以上, 其他豐度超過 1%的門還有 Choroflexi (綠彎菌門, 4.29%), Planctomycetes (浮霉菌門, 3.76%), Patescibacteria (髕骨菌門) (1.96%), Acidobacteria (酸桿菌門, 1.52%), Verrucomicrobia (疣微菌門, 1.05%)。

圖1 微生物門水平種群結(jié)構(gòu)Fig. 1 Microbial community composition at phylum levels

在活性污泥中共檢測到 334 個屬(圖 2), 作為Calditrichaeota 門中唯一一個屬,Calorithrix在污泥中占 58.77%, 說明相對于其他屬,Calorithrix屬更容易在高 BOD、高 COD 和高 NH4+-N 的垃圾滲濾液處理體系中生存并富集。作為典型的氨氧化細(xì)菌,亞硝化單胞菌屬Nitrosomonas占體系的 1.30%, 是體系中豐度第二的屬, 其余屬水平的物種豐度均未超過 1%。在體系中還存在大量未分類到屬的物種,說明垃圾滲濾液處理廠活性污泥中可能存在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中未收錄的新屬。

圖2 微生物屬水平種群結(jié)構(gòu)Fig. 2 Microbial community composition at genus levels

Proteobacteria, Bacteroidetes 和 Choroflexi 是污水處理系統(tǒng)中常見的微生物(表 1), 在不同類型的污水處理廠和活性污泥工藝中都被報道為優(yōu)勢菌門[8–9], 在本研究的樣品中也具有較高的豐度, 說明垃圾滲濾液與其他污水處理系統(tǒng)活性污泥的種群結(jié)構(gòu)具有一定的相似性。Proteobacteria 在污水處理系統(tǒng)中最為常見, 豐度可達(dá) 78.86%, 多項研究證明 Proteobacteria 可降解多種有機污染物, 并可減輕污染物引起的生物毒性[25–28]。Bacteroidetes 參與聚合物和復(fù)雜有機物質(zhì)的降解, 可以將包含多糖和蛋白質(zhì)的死細(xì)胞分解為簡單的有機分子(例如乙醇和乳酸),這些簡單的分子可以被其他物種代謝[29–30]。Chloroflexi 可以合成胞外多糖, 對污泥團(tuán)聚體的形成起著重要作用, 并可通過絲狀網(wǎng)絡(luò)增強生物膜的結(jié)構(gòu)[31–33]。也有研究表明 Acidobacteria, Firmicutes 和Actinobacteria 在營養(yǎng)去除過程中起著重要作用, 是廢水處理系統(tǒng)中廣泛存在的門[8,34]。

表1 不同污水處理體系活性污泥的優(yōu)勢菌門Table 1 Dominant phylum of activated sludge in different wastewater treatment systems

然而, 作為本研究樣品中最優(yōu)勢的門, Calditrichaeota 門卻未在污水處理系統(tǒng)的相關(guān)研究中報道過。Calditrichaeota 是一個新發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌門, 分為Caldithrix屬和Calorithrix屬, 其中Caldithrix屬首次在從愛琴海淺水熱液沉積物獲得的 16S rRNA 克隆文庫中發(fā)現(xiàn)[35], 從大西洋中脊深海熱液噴口樣品中首次分離出來[36],Calorithrix屬則是在 2016 年從俄羅斯Kunashir 島的海底熱液噴口中首次發(fā)現(xiàn)并分離[37]。Marshall 等[38]分析海洋沉積物的 16S rRNA基因數(shù)據(jù)集, 結(jié)果表明 Calditrichaeota 以高豐度分布于全球海底, 占細(xì)菌群落的 6.7%。目前發(fā)現(xiàn)的Calditrichaeota 微生物均為化能異養(yǎng)菌, 具有降解蛋白質(zhì)基質(zhì)的能力, 能夠利用丙酮酸、淀粉、纖維二糖和木糖聚糖等多種能量底物[35–39]。垃圾滲濾液是一種高濃度的有機廢水, 富含可生物降解的揮發(fā)性脂肪酸(VFA)以及難降解的腐殖質(zhì)(腐殖酸、富里酸), COD 和 BOD 濃度可達(dá)數(shù)千至幾萬[40–41], 大量的有機污染物可能是 Calditrichaeota 豐度高的原因。

目前報道的 Calditrichaeota 均來自海洋沉積物,本研究首次發(fā)現(xiàn)污水處理系統(tǒng)中 Calditrichaeota 門微生物的存在, 并且具有較高的豐度, 擴大了對Calditrichaeota 門的認(rèn)知, 表明 Calditrichaeota 具有更大的生理生態(tài)位。

2.2 垃圾滲濾液處理系統(tǒng)活性污泥功能注釋

2.2.1 總體水平功能注釋

對垃圾滲濾液處理廠活性污泥中的微生物進(jìn)行宏基因組測序, 組裝后獲得 739205 條 contigs, 通過 ORF 預(yù)測得到 1012950 條 ORFs, 與 KEGG 數(shù)據(jù)庫比對, 進(jìn)行功能注釋, 如圖 3 所示。結(jié)果表明,垃圾滲濾液處理系統(tǒng)活性污泥微生物在碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、能量代謝(Energy metabolism)和輔酶和維生素代謝(Cofactor and vitamin biosynthesis)中的基因豐度最高, 分別占注釋基因的 17.36%,12.77%, 8.14%和 4.88%, 這些基因與細(xì)胞新陳代謝相關(guān), 是微生物賴以生存和生長的基礎(chǔ), 因而豐度最高?；钚晕勰嘀羞€發(fā)現(xiàn)與外源有機化合物降解(Xenobiotics of other secondary metabolites)相關(guān)的基因, 說明活性污泥在降解有機污染物方面具有一定的潛力。與遺傳信息處理相關(guān)的基因在體系中也具有較高的豐度, 如復(fù)制和修復(fù)(Replication and repair)基因占注釋基因的 5.01%, 翻譯(translation)相關(guān)基因占 2.74%, 折疊、分類和降解(Folding,sorting and degradation)基因占2.25%。此外, 體系中還發(fā)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal transduction)、膜傳輸(Membrane transport)等環(huán)境信息處理相關(guān)的基因,分別占注釋基因的 4.64%和 3.24%, 說明活性污泥微生物之間存在著物質(zhì)交流和信息傳遞, 具有一定的相互作用關(guān)系。

圖3 基于KEGG 數(shù)據(jù)庫的功能基因注釋Fig. 3 Function of genes in the activated sludge, annotated by KEGG database

2.2.2 氮循環(huán)相關(guān)基因功能注釋

1) 氮循環(huán)相關(guān)基因豐度。

脫氮是活性污泥的重要功能之一, 參與氮代謝的功能基因在廢水處理中起著至關(guān)重要的作用, 因此, 研究氮代謝基因豐度, 構(gòu)建氮代謝通路是活性污泥微生物研究的一個重要內(nèi)容。本研究表明, 垃圾滲濾液處理系統(tǒng)活性污泥中存在著 5 種氮代謝途徑: 硝化作用、反硝化作用、同化硝酸鹽還原、異化硝酸鹽還原和氮固定。作為一種直接以氨為電子供體的新型脫氮工藝, 厭氧氨氧化相關(guān)基因在體系中沒有發(fā)現(xiàn)(圖 4)。

圖4 活性污泥氮循環(huán)途徑及基因豐度Fig. 4 Nitrogen transformation pathways and gene abundance in the activated sludge

通過計算基因豐度, 我們發(fā)現(xiàn)反硝化相關(guān)基因在體系中豐度最高, 占 5 個氮循環(huán)途徑基因總和的78.84%, 其中硝酸鹽還原酶narG豐度為 55296 hits,遠(yuǎn)高于其他反硝化基因, 說明部分反硝化作用在硝態(tài)氮還原為亞硝態(tài)氮的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[42]; 亞硝酸鹽還原酶nirK和nirS的豐度分別為 4254 hits 和5676 hits, 一氧化氮還原酶norB的豐度為 4829 hits,一氧化二氮還原酶的功能基因nosZ豐度也較高, 共有 21559 條 reads 被注釋為該基因。前人研究表明,絕大多數(shù)反硝化菌為兼性菌, 代謝途徑豐富多樣,對 pH 不是特別敏感, 只要環(huán)境條件適宜, 反硝化過程就能順利進(jìn)行, 這可能是反硝化基因在活性污泥中豐度較高的原因[43]。另一方面, 反硝化作用是將水體中的氮轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮, 從而從水體中去除的過程, 是脫氮過程的關(guān)鍵途徑, 體系中豐富的反硝化功能基因表明垃圾滲濾液活性污泥良好的脫氮性能。

硝化作用相關(guān)功能基因在體系中豐度不高, 如催化銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為羥胺的氨單加氧酶功能基因amo豐度為 844 hits, 而催化羥胺轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽的羥胺氧化還原酶功能基因hao豐度為 1385 hits。Yu 等[44]利用宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組的方法研究市政污水處理廠活性污泥的氮循環(huán)基因, 結(jié)果表明, 盡管活性污泥中硝化功能基因豐度不高, 但這些基因表現(xiàn)出較強的表達(dá)活性, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于反硝化等其他氮循環(huán)功能基因。

除硝化作用和反硝化作用外, 體系中還發(fā)現(xiàn)同化硝酸鹽還原和異化硝酸鹽還原途徑, 即氨化作用。同化硝酸鹽還原是硝酸鹽被還原成亞硝酸鹽和氨,氨被同化成氨基酸, 合成細(xì)胞生長所需要的物質(zhì),這個過程由nasA(3743 hits)和nirA(745 hits)催化完成。異化硝酸鹽還原是在在無氧或微氧條件下, 微生物進(jìn)行的硝酸鹽呼吸, 即以 NO3?或 NO2?代替O2作為電子受體進(jìn)行呼吸代謝, 這一過程由nirB(3220 hits)或nrfA(15331 hits)催化。體系中存在大量的氨化基因, 僅次于反硝化相關(guān)基因, 與前人的研究結(jié)果[45–46]一致。

2) 氮循環(huán)基因分布。

經(jīng)基因組 Binning 后共獲得 158 個基因組, 利用CheckM 對基因組的完整度和污染度進(jìn)行評估, 共有62 個高質(zhì)量基因組(完整度 ? 5 × 污染度 > 50%)用于后續(xù)分析, 基因組的詳細(xì)信息請訪問 http://xbna.pku.edu.cn (以下簡稱xbna)查看附錄 1。

將 Binning 抽取的基因組進(jìn)行物種注釋, 并與 KEGG 數(shù)據(jù)庫比對, 探究體系中氮循環(huán)基因在物種上的分布。結(jié)果表明, 氨單加氧酶amo基因僅存在于 Proteobacteria 門下的Nitrosomonas, 說明Nitrosomonas是活性污泥中起主要作用的氨氧化細(xì)菌(AOB)。Wang 等[42]和彭永臻等[46]的研究表明,Nitrosomonas菌屬是一種在活性污泥處理工藝及各類反應(yīng)器中最常見的 AOB, 能夠?qū)⑦M(jìn)水中氨氮氧化為亞硝態(tài)氮。例如, Wang 等[42]采用同步部分硝化–厭氧氨氧化–反硝化生物反應(yīng)器處理垃圾滲濾液, 證明Nitrosomonas是其主要的 AOB 菌屬, 與厭氧氨氧化菌共同主導(dǎo)總氮的去除。

在 17 個門的基因組中發(fā)現(xiàn)全部或部分反硝化相關(guān)基因(圖 5)。narG基因分布最廣泛, 主要分布在 Calditrichaeota (33333 hits)、Choroflexi (11566 hits)和 Proteobacteria (3560 hits)門。其中, Calditrichaeota 門 (屬水平為Calorithrix)豐度最高, 占總narG的60.28%。napA基因主要分布在 Proteobacteria (1037 hits)、Planctomycetes (844 hits)和 Verrucomi-crobia(266 hits)門。亞硝酸鹽還原酶nirK基因主要來源于Choroflexi (2835 hits)、Bacteroidetes (272 hits)和 Deinococcus-Thermus (240 hits), 而nirS基因主要來源于 Choroflexi (3041 hits)和 Proteobacteria(1063 hits)。一氧化氮還原酶基因norB在 Proteo-bacteria 中豐度最高(1227 hits), Zixibacteria (463 hits)和 Verrucomicrobia (379 hits)次之, 而norC基因整體豐度不高。氧化亞氮還原酶nosZ基因在多個門中均有分布, 其中 Calditrichaeota 豐度最高(17063 hits), 占總nosZ基因的 79.14%, 說明 Calditrichae-ota 對活性污泥中氧化亞氮的還原貢獻(xiàn)較大。

圖5 硝化作用和反硝化作用的功能微生物Fig. 5 Functional microorganisms in nitrification and denitrification processes

2.2.3 有機污染物降解相關(guān)基因功能注釋

1) 有機污染物降解基因的豐度及多樣性。

研究表明, 活性污泥不僅可以去除污水中的有機營養(yǎng)物(有機碳、氮和磷等), 對難降解有機污染物的去除也發(fā)揮重要的作用[47]。因此, 研究活性污泥中難降解有機污染物的降解基因和功能微生物,對解析污染物降解機理, 優(yōu)化活性污泥體系有重要意義。

將組裝 contigs 與 KEEG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對, 共注釋到 87 個功能基因(xbna 附錄 2), 參與有機污染物的降解。根據(jù)有機污染物的結(jié)構(gòu), 將降解基因分為六大類, 分別為單環(huán)芳烴、多環(huán)芳烴、雜環(huán)芳烴、烷烴、脫鹵酶和其他類別, 約有 53.99%的降解基因參與單環(huán)芳烴化合物的代謝, 進(jìn)一步將單環(huán)芳烴降解基因分為芳香羧酸、芳香醇、芳香烴、芳香醛、芳香酮、氯化芳香化合物和苯胺類(圖 6)。在垃圾滲濾液活性污泥中, 芳香羧酸類降解基因的種類最多, 豐度最高 (35899 hits), 包括苯甲酸雙加氧酶(808 hits)、對羥基苯甲酸單加氧酶(324 hits)、鄰苯二甲酸 4,5-雙加氧酶(304 hits)、4,5-二羥基鄰苯二甲酸脫羧酶(131 hits)和 4-羥基苯乙酸 3-單加氧酶(242 hits)。芳香醇類降解基因的豐度也較高, 包括苯酚單加氧酶(221 hits)、芳醇脫氫酶(242 hits)和4-甲酚脫氫酶(538 hits)。芳香烴類主要為甲苯單加氧酶系統(tǒng)蛋白, 在體系中豐度較低。芳香醛類主要為苯乙醛脫氫酶(200 hits), 芳香酮類主要包括 4-羥基苯乙酮單加氧酶(120 hits)和2,4'-二羥基苯乙酮雙加氧酶(30 hits), 苯胺類主要為二甲基苯胺單加氧酶(51 hits)。

圖6 有機污染物降解基因種類及豐度Fig. 6 Abundances of various organic pollutant degrading genes

與單環(huán)芳烴類降解基因相比, 多環(huán)芳烴和雜環(huán)芳烴降解基因種類較少, 豐度較低。多環(huán)芳烴中發(fā)現(xiàn)與萘降解相關(guān)的萘 1,2-加氧酶鐵氧還原蛋白還原酶(55 hits), 沒有發(fā)現(xiàn)與蒽、菲等復(fù)雜的多環(huán)芳烴代謝相關(guān)的基因, 與雜環(huán)芳烴污染物降解相關(guān)的有咔唑 1,9a-雙加氧酶(6 hits)、5-(羥甲基)糠醛/糠醛氧化酶(169 hits)、2-吡喃酮-4,6-二羧酸乳糖酶(121 hits)和羥基喹啉 1,2-加氧酶(65 hits), 說明垃圾滲濾液活性污泥對結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多環(huán)芳烴和雜環(huán)芳烴降解的潛力較低。除芳香族化合物外, 體系中還發(fā)現(xiàn)與烷烴降解相關(guān)的烷烴 1-單加氧酶(591 hits), 未發(fā)現(xiàn)與烯烴降解相關(guān)的基因。與有機鹵化合物降解相關(guān)的 2-鹵酸脫鹵酶(6381 hits)和鹵乙酸脫鹵酶(776 hits)在體系中豐度較高, 說明活性污泥對垃圾滲濾液有機鹵化合物的降解具有較大的潛力。

為了解不同類型污水處理廠活性污泥降解基因的差異, 將本研究的數(shù)據(jù)集(Leachate)與其他 3 個宏基因組數(shù)據(jù)集(分別來自印度的市政污水處理廠(AERA)[48]、丹麥的增強生物除磷處理廠(EBPR)[49]和中國的制革廠廢料處理廠(Tannery)[50])進(jìn)行比較。由圖 7 可知, 垃圾滲濾液處理廠的活性污泥具有的降解基因種類最多, 制革廠和污水處理廠次之,EBRP 處理廠最少, 說明污染物降解基因的豐富度與廢水的成分有很大的關(guān)系, 微生物發(fā)揮的功能與污水處理系統(tǒng)中存在的可降解底物息息相關(guān)。Masoner 等[51]研究美國 19 個垃圾填埋場的垃圾滲濾液,檢測到 129 種難降解有機污染物, 如萘和菲等多環(huán)芳香族化合物、氯化芳香族化合物、磷酸酯、鄰苯二甲酸酯、酚類化合物以及苯胺類化合物等。其中, 苯酚、雙酚 A 和 4-羥基甲苯等的檢出頻率高于 50%, 檢出濃度高達(dá) mg/L 級別, 比普通污水處理廠的檢出濃度高幾個數(shù)量級, 因此, 相對于普通的廢水, 其降解基因具有更高的多樣性。

圖7 4 種污水處理廠有機污染物降解基因種類多樣性Fig. 7 Diversity of organic pollutant degradation genes in four wastewater treatment plants

4 種廢水處理廠活性污泥中共有的有機污染物降解酶包括 4-羥基苯乙酸 3-單加氧酶、水楊酸羥化酶、原兒茶酸 3,4-雙加氧酶 β 亞基、原兒茶酸 4,5-雙加氧酶 β 鏈、均龍膽酸 1,2-雙加氧酶、龍膽酸1,2-雙加氧酶、苯乙醛脫氫酶和烷烴 1-單加氧酶等(xbna 附錄 3), 說明這些酶作用的化合物在污水處理系統(tǒng)中普遍存在。例如, 水楊酸、原兒茶酸和龍膽酸是芳香化合物生物降解的中間產(chǎn)物[52]在污水處理系統(tǒng)中廣泛存在, 因此在不同的污水處理體系中都發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的降解酶。

垃圾滲濾液處理廠的活性污泥中存在大量特有的降解酶, 如雜環(huán)芳烴降解酶(咔唑 1,9a-雙加氧酶、5-(羥甲基)糠醛/糠醛氧化酶和 2,5-呋喃二甲酸脫羧酶)、芳香羧酸類降解酶(鄰苯二甲酸 4,5-雙加氧酶、4-羥基苯甲酸脫羧酶亞基 C、4-甲氧基苯甲酸單加氧酶和(S)-扁桃酸脫氫酶)、苯胺類降解酶(鄰氨基苯甲酸 1,2-雙加氧酶)、苯酮類降解酶(4-羥基苯乙酮單加氧酶)以及鹵代烷烴脫鹵酶等(xbna 附錄 3), 這些酶的作用化合物是生產(chǎn)醫(yī)藥、纖維、包裝材料、塑料和其他日用品的原材料[53], 經(jīng)廢棄物填埋后進(jìn)入垃圾滲濾液中, 長期富集后形成垃圾滲濾液活性污泥獨特的降解酶體系。

2) 有機污染物降解基因的分布。

通過對不同類群微生物的功能注釋, 確定不同門水平微生物降解有機污染物的功能差異(圖 8)。在 18 個細(xì)菌門中發(fā)現(xiàn)有機污染物降解基因, 而在古菌 Nanoarchaeota 中未注釋到降解基因, 說明細(xì)菌是垃圾滲濾液活性污泥中有機物降解的功能微生物。

圖8 不同門水平微生物有機污染物降解基因多樣性及豐度Fig. 8 Diversity and abundances of organic pollutant degrading genes in microorganisms at different phylum levels

18 個細(xì)菌門中, 有機污染物降解基因在種類和豐度上存在很大的差別, Proteobacteria 是體系中有機污染物降解的優(yōu)勢菌門, 降解基因種類最多, 豐度最高, 在總的有機物降解基因中占 12.82%, 在Proteobacteria 中還發(fā)現(xiàn)獨特的降解基因(如苯/甲苯/氯苯雙加氧酶、苯甲醛脫氫酶和苯乙醛脫氫酶),說明 Proteobacteria 在垃圾滲濾液難降解有機污染物的去除方面可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

Bacteroidetes, Planctomycetes, Calditrichaeota和 Choroflexi 門也是體系中有機物降解的重要功能微生物。Bacteroidetes 注釋到芳香羧酸類、芳香醇類、苯胺、烷烴、有機鹵化合物降解的功能基因,其中, 二甲基苯胺單加氧酶僅在 Bacteroidetes 微生物中發(fā)現(xiàn)。Planctomycetes 在降解氯化芳香化合物、多環(huán)芳烴和雜環(huán)芳烴類化合物方面具有優(yōu)勢,如 5-(羥甲基)糠醛和四氯苯醌, 說明 Planctomycetes對復(fù)雜的芳香化合物的降解具有很大潛力。Calditrichaeota 和 Choroflexi 中芳香羧酸類降解基因最高,這兩個門中存在大量的龍膽酸 1,2-雙加氧酶、均龍膽酸 1,2-雙加氧酶和兒茶酚 2,3-雙加氧酶, 這些酶催化芳香族化合物苯環(huán)的開環(huán)反應(yīng), 污染物經(jīng)開環(huán)后進(jìn)一步代謝進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA circle), 降解產(chǎn)物被微生物用于合成自身的生物量, 同時產(chǎn)生 CO2和 H2O, 因此 Calditrichaeota 和 Choroflexi 對芳香化合物的徹底氧化分解具有重要意義。

3 結(jié)論

本研究利用 16S rRNA 基因和宏基因組測序技術(shù), 探究垃圾滲濾液處理系統(tǒng)活性污泥的種群結(jié)構(gòu)和功能特征, 共鑒定出 32 個門, 334 個屬。Calditrichaeota 門和Calorithrix屬分別為優(yōu)勢菌門和屬,這是關(guān)于污水處理系統(tǒng)中 Calditrichaeota 門和Calorithrix屬的首次報道?；钚晕勰嘀写嬖谙趸⒎聪趸?、同化硝酸鹽還原、異化硝酸鹽還原和氮固定 5 條氮循環(huán)途徑, 反硝化相關(guān)基因是豐度最高的脫氮功能基因, 主要分布于 Calditrichaeota, Proteobacteria 和 Choroflexi 門?；钚晕勰嘀泻胸S富的難降解有機污染物降解基因, 遠(yuǎn)高于工業(yè)廢水和市政污水處理廠的活性污泥, 其中 Proteobacteria, Bacteroidetes, Planctomycetes, Calditrichaeota 和 Choroflexi是主要的有機物降解功能微生物。