尾葉香茶菜水煎液對(duì)實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠的治療作用

楊麗霞，馮婷婷，李思思

（山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西晉中030619）

牙周炎是累及4 種牙周組織的慢性感染性疾?。?］，主要臨床表現(xiàn)是牙齦炎癥、出血、牙周袋形成、牙齒松動(dòng)移位、咀嚼無(wú)力，嚴(yán)重者可自行脫落或?qū)е卵例X拔出［2］，是我國(guó)成年人喪失牙齒的首位原因［3］。目前，臨床上用于治療牙周炎的方法主要是采用機(jī)械治療配合全身和局部應(yīng)用抗生素，然而長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素會(huì)導(dǎo)致機(jī)體菌群失調(diào)，產(chǎn)生耐藥性，并且容易造成變態(tài)反應(yīng)［4］，使其在臨床應(yīng)用中受到一定限制［5］。目前中草藥因其副作用小、標(biāo)本兼治、價(jià)格低廉引起許多學(xué)者在中醫(yī)藥治療牙周炎領(lǐng)域進(jìn)行探索。

尾葉香茶菜為唇形科香茶菜屬多年生草本植物，又名龜葉草、狗日草、野蘇子，始載于《中國(guó)植物志》［6］，在我國(guó)的黑龍江、吉林、遼寧及山西等省份有大面積的野生資源分布。尾葉香茶菜全草入藥，具有清熱解毒、健胃、活血等功效［7］。前期研究證實(shí)，尾葉香茶菜水煎液具有明顯抗炎鎮(zhèn)痛作用［8］，對(duì)口腔常見(jiàn)致病菌具有明顯抑菌作用，對(duì)牙周致病菌具有明顯抑制作用［9］。本研究在前期研究基礎(chǔ)上建立大鼠牙周炎動(dòng)物模型，以尾葉香茶菜水煎液進(jìn)行治療，通過(guò)對(duì)大鼠牙周炎臨床指標(biāo)及牙齦組織和血清中炎癥因子水平的檢測(cè)，考察尾葉香茶菜水煎液對(duì)實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠80 只，體質(zhì)量（180±20）g，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016］，在上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)中心檢驗(yàn)合格。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)均符合中國(guó)倫理委員會(huì)有關(guān)動(dòng)物研究指導(dǎo)原則。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 尾葉香茶菜藥材采自遼寧省本溪市湯溝，經(jīng)鑒定為唇形科香茶菜屬植物尾葉香茶菜［Rabdosia excisa（Maxim.）Hara］的地上部分。人工牛黃甲硝唑膠囊（江西藥都仁和制藥有限公司，批號(hào)181105）；水合氯醛（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào) 20191008）；1L-1β、IL-6、TNF-α 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司）；DNM-9602 酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 尾葉香茶菜水煎液的制備 稱取尾葉香茶菜干葉200 g，粉碎，過(guò)篩，加蒸餾水至浸過(guò)藥面3 cm，使水浸透藥物組織，浸泡30 min，有利于藥效成分煎出。先用大火煎煮至沸，后用小火保持微沸狀態(tài)煎煮30 min，濾取藥液100 mL 放入無(wú)菌瓶中；二煎同上，濾取藥液100 mL；將2 次煎煮所得藥液混合后繼續(xù)煎煮濃縮至1 mL 藥液含生藥1 g［8-9］。

1.2.2 牙周炎動(dòng)物模型的建立 用10%的水合氯醛1 mL/300 g 腹腔注射麻醉大鼠，固定大鼠四肢，牽拉口角，用探針將大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙牙周與牙根面分離，用直徑0.2 mm 正畸鋼絲結(jié)扎大鼠第一磨牙牙頸部，使結(jié)扎絲位于齦下，腭側(cè)打結(jié)，剪去多余鋼絲，并喂養(yǎng)10%的蔗糖水和用蔗糖水浸泡過(guò)的軟飼料［10-12］。6 周后大鼠牙周組織出現(xiàn)牙齦紅腫、出血及牙齒松動(dòng)等牙周炎癥狀表明牙周炎動(dòng)物模型建成［12］。

1.2.3 分組與給藥 80 只SD 大鼠中選取牙體牙列完整，無(wú)齲壞及牙周病的10 只大鼠作為空白對(duì)照組（正常組），采取正常飼養(yǎng)，不給予任何干預(yù)。其余牙體牙列完整，無(wú)齲壞及牙周病的大鼠用來(lái)建造牙周炎動(dòng)物模型。6 周后，選取50 只造模成功大鼠將其隨機(jī)分為5 組，模型組10 只，陽(yáng)性對(duì)照組10 只、實(shí)驗(yàn)低、中、高劑量組各10 只，在基礎(chǔ)麻醉下去除結(jié)扎絲，對(duì)實(shí)驗(yàn)牙進(jìn)行手工潔治，正常飲食，模型組不給予藥物治療，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃人工牛黃甲硝唑膠囊0.13 g/kg，實(shí)驗(yàn)低、中、高劑量組分別灌胃尾葉香茶菜水煎液2 g/kg、4 g/kg、8 g/kg（相當(dāng)于生藥材量），1 次/d，持續(xù)給藥 3 周。

1.2.4 牙周組織臨床指標(biāo)觀察 參照文獻(xiàn)［13-17］，檢查各組大鼠的牙齦指數(shù)、出血指數(shù)、牙齒松動(dòng)度和菌斑指數(shù)4 項(xiàng)臨床指標(biāo)。牙齦指數(shù)（gingival index，GI）：將牙周探針?lè)诺窖例l邊緣齦溝開(kāi)口處，并沿齦緣輕輕滑動(dòng)，牙齦組織只被輕微地觸及。按照不同程度記 0~4 分，0 分為正常牙齦；1 分為牙齦略有水腫，探針探之不出血；2 分為牙齦水腫，并探診出血；3 分為牙齦有自發(fā)出血傾向或潰瘍。出血指數(shù)（bleeding index，BI）：用鈍頭牙周探針輕探入齦溝，取出探針30 s 后，觀察有無(wú)出血及出血程度。按照不同程度記0~5 分，0 分為牙齦健康，無(wú)炎癥及出血；1 分為牙齦顏色有炎癥性改變，探針不出血；2 分為探針后有點(diǎn)狀出血；3 分為探針出血沿牙齦緣擴(kuò)散；4 分為出血流滿并溢出齦溝；5 分為自動(dòng)出血。牙齒松動(dòng)度（tooth mobility degree，TMD）：閉合鑷子，用鑷子尖端抵住頰面窩，向頰舌或近遠(yuǎn)中方向搖動(dòng)。分為I~Ⅲ度記錄，I 度為松動(dòng)超過(guò)生理松動(dòng)度，但幅度在1 mm 以內(nèi)；Ⅱ度為松動(dòng)幅度1~2 mm；Ⅲ度為松動(dòng)幅度在2 mm 以上。菌斑指數(shù)（plaque index，PLI）：用菌斑顯示劑涂布于牙面，沖洗后再檢查著色的菌斑在牙面的分布部位和范圍。按照不同程度記0~5 分，0 分為牙面無(wú)菌斑；1 分為牙頸部齦緣處有散在的點(diǎn)狀菌斑；2 分為牙頸部連續(xù)窄帶狀菌斑寬度不超過(guò)1 mm；3 分為牙頸部菌斑覆蓋面積超過(guò)1 mm，但少于牙面1/3；4 分為菌斑覆蓋面積至少占牙面1/3，但不超過(guò)2/3；5 分為菌斑覆蓋面積占牙面 2/3 或 2/3 以上。

1.2.5 牙齦組織中 1L-1β、IL-6、TNF-α 含量的測(cè)定 麻醉大鼠，剝離大鼠右上第一磨牙牙齦組織，清洗，稱重后加入9 倍體積0.9%生理鹽水，勻漿，離心，取上清液得10%牙齦組織勻漿液。按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)加樣，溫育，洗滌，加酶，終止，測(cè)定，計(jì)算樣品中 1L-1β、IL-6、TNF-α 的濃度。剝離大鼠左上第一磨牙牙齦組織，清洗，濾紙吸水，浸入10%中性福爾馬林中固定，備用。

1.2.6 血清中 1L-1β、IL-6、TNF-α 的含量測(cè)定 將大鼠固定好，用50 ℃溫水浸泡尾部2 min，血管充血后，棉球消毒、擦干鼠尾，用消毒手術(shù)剪剪去尾尖5~10 mm，然后從尾根部向尾尖按摩，血自尾尖流出，可采1.5~2 mL 血液。尾尖采血后輕輕倒轉(zhuǎn)采血管混合4~5 次，直立置于室溫待血液完全凝固，離心10 min，分離血清。將采集好的血清轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的凍存管，冷凍備用。嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中 1L-1β、IL-6、TNF-α 的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用標(biāo)準(zhǔn)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 牙周組織臨床指標(biāo)檢查結(jié)果

與正常組比較，模型組 GI、BI、TMD、PLI 均明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和尾葉香茶菜高劑量組4 項(xiàng)臨床指標(biāo)均明顯降低（P<0.01），中劑量組 GI、BI、TMD，3 項(xiàng)臨床指標(biāo)明顯降低（P<0.01），低劑量組 BI 明顯降低（P<0.01）。與尾葉香茶菜低劑量組比較，高劑量組4 項(xiàng)臨床指標(biāo)均明顯降低（P<0.01），中劑量組 GI、BI、TMD明顯降低（P<0.05，P<0.01）。與尾葉香茶菜中劑量組比較，高劑量組 GI、BI、PLI 明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠牙周組織牙齦指數(shù)、出血指數(shù)、牙齒松動(dòng)度、菌斑指數(shù)比較 （）

表1 各組大鼠牙周組織牙齦指數(shù)、出血指數(shù)、牙齒松動(dòng)度、菌斑指數(shù)比較 （）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01；與低劑量組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01；與中劑量組比較，5）P＜0.05，6）P＜0.01

組別 n GI BI TMD PLI正常組 10 0.00±0.00 0.00±0.00 1.00±0.00 0.60±0.52模型組 10 2.20±0.421） 3.20±0.421） 2.60±0.521） 1.90±0.321）陽(yáng)性對(duì)照組 10 0.70±0.482） 0.60±0.522） 1.10±0.322） 1.00±0.472）尾葉香茶菜低劑量組 10 1.90±0.32 2.10±0.322） 2.20±0.42 1.70±0.48尾葉香茶菜中劑量組 10 1.30±0.482）4） 1.40±0.522）4） 1.60±0.522）3） 1.50±0.53尾葉香茶菜高劑量組 10 0.90±0.322）4）5） 0.80±0.422）4）5） 1.30±0.482）4） 0.90±0.322）4）6）

2.2 牙齦組織中 1L-1β、IL-6、TNF-α 的水平比較

與正常組比較，模型組牙齦組織中1L-1β、IL-6、TNF-α 的含量均明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、尾葉香茶菜高、中劑量組牙齦組織中 1L-1β、IL-6、TNF-α 的含量均明顯降低（P<0.01），低劑量組牙齦組織中1L-1β 的含量明顯降低（P<0.01）。與尾葉香茶菜低劑量組比較，高、中劑量組牙齦組織中 1L-1β、IL-6、TNF-α 的含量均明顯降低（P<0.01）。與尾葉香茶菜中劑量組比較，高劑量組牙齦組織中1L-1β、TNF-α 的含量明顯降低（P<0.01，P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠牙齦組織相關(guān)炎癥指標(biāo)比較（）

表2 各組大鼠牙齦組織相關(guān)炎癥指標(biāo)比較（）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01；與低劑量組比較，3）P＜0.01；與中劑量組比較，4）P＜0.05，5）P＜0.01

組別n劑量1L-1β/（pg/mL）IL-6/（pg/mL）TNF-α/（pg/mL）正常組 10 - 9.61±0.87 83.62±8.94 4.17±0.63模型組 10 - 43.16±5.791） 246.65±47.571） 16.90±2.561）陽(yáng)性對(duì)照組 10 0.13 g/kg 14.75±1.862） 110.65±14.302） 8.05±1.202）尾葉香茶菜低劑量組 10 2 g/kg 35.52±3.192） 212.66±30.02 15.06±1.38尾葉香茶菜中劑量組 10 4 g/kg 28.22±3.232）3） 152.40±41.362）3） 11.39±1.282）3）尾葉香茶菜高劑量組 10 8 g/kg 19.56±2.882）3）5） 126.07±22.702）3） 10.03±1.202）3）4）

2.3 血清中 1L-1β、IL-6、TNF-α 的水平比較

與正常組比較，模型組血清中1L-1β、IL-6、TNF-α 的含量均明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、尾葉香茶菜高、中劑量組血清中1L-1β、IL-6、TNF-α 的含量均明顯降低（P<0.01），低劑量組血清中 1L-1β、IL-6、TNF-α 的含量明顯降低（P<0.01，P<0.05）。與尾葉香茶菜低劑量組比較，高劑量組血清中 1L-1β、IL-6、TNF-α 的含量均明顯降低（P<0.01），中劑量組血清中IL-6、TNF-α的含量明顯降低（P<0.05）。與尾葉香茶菜中劑量組比較，高劑量組血清中1L-1β、TNF-α 的含量明顯降低（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清中相關(guān)炎癥指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（）

表3 各組大鼠血清中相關(guān)炎癥指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01；與低劑量組比較，4）P＜0.05，5）P＜0.01；與中劑量組比較，6）P＜0.05

組別n劑量1L-1β/（pg/mL）IL-6/（pg/mL）TNF-α/（pg/mL）正常組 10 - 13.89±1.11 99.12±8.47 5.10±0.76模型組 10 - 53.96±7.241） 258.55±39.641） 21.96±3.331）陽(yáng)性對(duì)照組 10 0.13 g/kg 18.96±2.393） 142.55±16.683） 8.85±1.333）尾葉香茶菜低劑量組 10 2 g/kg 44.40±3.993） 211.10±27.833） 18.68±2.292）尾葉香茶菜中劑量組 10 4 g/kg 40.32±4.603） 167.64±45.503）4） 16.09±1.933）4）尾葉香茶菜高劑量組 10 8 g/kg 22.35±3.293）5）6） 141.03±21.793）5） 10.43±1.733）5）6）

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)選用的陽(yáng)性對(duì)照藥人工牛黃甲硝唑膠囊是復(fù)方制劑，每粒含甲硝唑200 mg，人工牛黃5 mg，用于急性智齒冠周炎、局部牙槽膿腫、牙髓炎、根尖周炎等，高劑量時(shí)可引起癲癇發(fā)作和周圍神經(jīng)病變，長(zhǎng)期用藥可產(chǎn)生持續(xù)性周圍神經(jīng)病變。人工牛黃甲硝唑膠囊為抗厭氧菌藥，其中的甲硝唑?qū)Υ蠖鄶?shù)厭氧菌具有強(qiáng)大抗菌作用，長(zhǎng)期服用會(huì)使全身菌群失調(diào)、引起耐藥菌感染等。尾葉香茶菜水煎液對(duì)多數(shù)口腔常見(jiàn)致病菌有不同程度的抑菌作用，對(duì)厭氧菌的作用與舒康口腔噴劑相當(dāng)，對(duì)變形桿菌、中間型普氏菌的作用則強(qiáng)于甲硝唑［9］，同時(shí)尾葉香茶菜水煎液具有清熱解毒、抗炎鎮(zhèn)痛作用［8］，且副作用較少。本實(shí)驗(yàn)采用尾葉香茶菜水煎液治療慢性牙周炎，以觀察其對(duì)慢性牙周炎臨床指標(biāo)的影響，為采用中醫(yī)中藥輔助治療慢性牙周炎提供臨床參考。本實(shí)驗(yàn)正常組大鼠牙齦健康，無(wú)炎癥及出血，牙面無(wú)菌斑或牙頸部齦緣處有散在點(diǎn)狀菌斑，牙齒松動(dòng)度Ⅰ度。造模6 周后，模型組實(shí)驗(yàn)牙牙齦紅腫，質(zhì)地松軟，探診出血沿牙齦緣擴(kuò)散，牙頸部出現(xiàn)連續(xù)窄帶狀菌斑，牙齒松動(dòng)度Ⅱ~Ⅲ度。灌胃3 周后，尾葉香茶菜高劑量治療組實(shí)驗(yàn)牙牙齦略有水腫，探針探之不出血，牙頸部齦緣處有散在點(diǎn)狀菌斑，牙齒松動(dòng)度Ⅰ~Ⅱ度，4 項(xiàng)臨床指標(biāo)均明顯降低，表明高劑量治療組牙周狀態(tài)有所改善。

牙周炎作為感染性疾病，其始動(dòng)因子是牙菌斑［18-19］，牙周細(xì)菌產(chǎn)生的毒素、抗原成分、代謝產(chǎn)物等可刺激上皮細(xì)胞產(chǎn)生 IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥因子，IL-1β 可促進(jìn) IL-6、TNF-α 等表達(dá)。正常水平的IL-6 有保護(hù)機(jī)體的作用，但當(dāng)炎癥局部IL-6 達(dá)到一定水平時(shí)就會(huì)破壞牙槽骨，抑制牙周主體細(xì)胞生長(zhǎng)，加重牙周組織炎癥；同時(shí)TNF-α可激活破骨細(xì)胞，從而破壞牙周組織，引發(fā)牙周炎；IL-1β 可通過(guò)直接產(chǎn)生或促進(jìn)IL-6 產(chǎn)生大量的蛋白酶和PGE2 等破壞牙周組織。這些炎癥因子之間協(xié)同作用，共同參與牙周組織的破壞。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M右上第一磨牙牙齦組織和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 炎癥因子水平均明顯高于正常組，尾葉香茶菜高、中劑量對(duì)3 項(xiàng)炎癥因子水平均有明顯降低作用。說(shuō)明尾葉香茶菜水煎液高、中劑量能夠抑制大鼠牙齦組織和血清中炎癥因子1L-1β、IL-6、TNF-α 釋放，減輕牙周組織炎癥，減緩牙周組織破壞，且具有濃度依賴性。