米曲霉和黑曲霉協(xié)同發(fā)酵杏仁粕風味物質(zhì)的變化

零春甜，湯輝煌，周彩瑩，楊 晨，汪建明

(天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457)

苦杏仁俗稱山杏仁，是世界上最流行的堅果之一[1].杏仁粕是杏仁油提取后的副產(chǎn)物，蛋白質(zhì)含量豐富，占杏仁粕的50%以上.采用微生物發(fā)酵杏仁粕，不僅可以將蛋白質(zhì)降解為多肽和氨基酸等物質(zhì)，還可以產(chǎn)生具有杏仁粕曲料特征的風味.黑曲霉是一種廣泛運用于食品發(fā)酵的真菌，用來發(fā)酵杏仁粕不會產(chǎn)生真菌毒素，符合食品衛(wèi)生的要求[2].米曲霉是一種生長快、酶系豐富、不產(chǎn)毒素的菌種，目前廣泛應用于調(diào)味品的生產(chǎn)[3].

近年來，利用微生物發(fā)酵改良食品風味已有較多報道.周彩瑩等[4]在最佳工藝條件下用黑曲霉發(fā)酵亞麻籽粕，測得氨基態(tài)氮含量為1.92%時產(chǎn)生風味的香氣濃郁.左勇等[5]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵甜面醬的氨基態(tài)氮含量為13.78～16.6mg/g時，對鮮味有重要貢獻.任利平等[6]利用發(fā)酵酶解法優(yōu)化干腌火腿風味基料氨基態(tài)氮含量為2.25%，風味評分最高.混菌發(fā)酵產(chǎn)生的酶系比單一菌種復雜，可顯著改良食品的風味和口感.

因此，本文采用黑曲霉、米曲霉協(xié)同發(fā)酵杏仁粕，以氨基態(tài)氮含量和特征風味強度為考察指標，通過感官評價和儀器測定的方法，研究影響杏仁粕發(fā)酵過程中風味物質(zhì)的關鍵因素，使杏仁粕在微生物發(fā)酵下有效風味成分充分釋放，賦予杏仁粕豐滿的風味，為杏仁粕制曲產(chǎn)肉味香精基料提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

杏仁粕，張家口永昌源果仁食品有限公司；黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)菌粉，山東康源生物技術有限公司.

甲醛、三氯乙酸(TCA)，分析純，天津市津科精細化工研究所；石油醚，分析純，天津市津東天正精細化學試劑廠；硼酸，分析純，天津市大茂化學試劑廠.

DW-86L386型超低溫冰箱，青島海爾股份有限公司；TDZ5-WS型低速離心機，長沙湘儀離心機有限公司；自動凱氏定氮儀，山東海能科學儀器有限公司；HFU586BASIC型立式超低溫冰箱，德國Thermo Scientific公司；Evolution300型紫外可見分光光度計，Thermo Fisher Scientific 公司；LE438型pH電極，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Trace1300 ISQ型氣質(zhì)聯(lián)用儀，蘇州冷杉精密儀器有限公司.

1.2 制曲方法

材料預處理：杏仁粕經(jīng)過粉碎機粉碎，80目過篩，密封備用.

制曲流程：取粉碎、過篩后的杏仁粕10g裝入三角瓶，120℃高壓蒸汽滅菌30min，降溫取出迅速打散，待溫度降至室溫，根據(jù)杏仁粕的質(zhì)量接種5%的混合菌粉(黑曲霉、米曲霉)，再加入適量水，混合均勻.30℃恒溫培養(yǎng)5d，當瓶內(nèi)布滿菌絲且菌絲聯(lián)結(jié)基質(zhì)成塊后翻曲，最后出曲.

1.3 測定方法

揮發(fā)物含量測定：參考GB/T 14489.1—2008《油料水分及揮發(fā)物含量測定》方法；氨基態(tài)氮的測定：采用甲醛滴定法，參考ZB X 66038—1987《氨基態(tài)氮測定法》.

曲料風味強度的評定：具體方法參照文獻[7]高溫大曲質(zhì)量的評分，風味強度＝外觀＋皮厚＋斷面＋香氣.在前人研究方法的基礎上，選擇外觀、皮厚、斷面、香氣等感官評價標準，評分標準見表1.篩選14名經(jīng)過培訓的小組成員(男7名，女7名，年齡23～48歲)進行描述性感官評價分析.

表1 曲料質(zhì)量評分指標Tab. 1 Standards for evaluation of koji quality

頂空固相微萃取(HS-SPME)：準確稱取5g樣品于20mL的樣品瓶中，(60±0.5)℃水浴恒溫平衡15min，將三相萃取頭插入樣品瓶中頂空萃取40min后取出萃取頭，再插入GC-MS進樣口解析15min，檢測其揮發(fā)性組分.色譜條件：色譜柱為TR-5MS型石英毛細管柱(30m×0.32mm×0.25μm)；進樣口溫度250℃；初始溫度40℃，保持3min，以4℃/min升到150℃保持4min；載氣為高純氮氣，不分流模式，流量為1mL/min.質(zhì)譜條件：連接口溫度250℃，EI離子源，電子能量70eV，離子源溫度300℃，質(zhì)譜掃描范圍(m/z)50～300.

1.4 杏仁粕曲料風味的影響因素優(yōu)化

1.4.1 單因素實驗

菌種比對曲料風味的影響：按照米曲霉與黑曲霉質(zhì)量比(g﹕g)為1﹕0、0﹕1、2﹕1、3﹕1、4﹕1進行發(fā)酵，發(fā)酵溫度37℃，水料比(mL﹕g)為1﹕1.以氨基態(tài)氮含量和風味強度為指標確定適宜菌種比.

水料比對曲料風味的影響：在上述確定的適宜菌種比的基礎上，按照水料比(mL：g)為0.2﹕1、0.4﹕1、0.6﹕1、0.8﹕1、1.0﹕1進行發(fā)酵，發(fā)酵溫度37℃.以氨基態(tài)氮含量和風味強度為指標確定適宜水料比.

發(fā)酵溫度對曲料風味的影響：在上述確定的適宜菌種比和水料比的基礎上，按照25、30、35、40、45℃的發(fā)酵溫度進行發(fā)酵，以氨基態(tài)氮含量和風味強度為指標確定適宜發(fā)酵溫度.

1.4.2 響應面分析

以菌種比、水料比、發(fā)酵溫度3個因素的不同設定條件進行優(yōu)化，測定曲料中的物質(zhì)風味強度和氨基態(tài)氮含量.在單因素的實驗結(jié)果基礎上，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實驗設計，確定最佳工藝參數(shù).

1.5 數(shù)據(jù)處理

單因素實驗數(shù)據(jù)使用Origin9軟件分析，Box-Benhnken的中心組合實驗采用Design-Expert 10.0.7統(tǒng)計軟件進行分析.所有實驗均經(jīng)過3次平行實驗.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗對曲料風味的影響

杏仁粕發(fā)酵過程菌種比、水料比、發(fā)酵溫度對曲料風味的影響如圖1所示，其中不同字母表示組間有顯著差異.

圖1 培曲菌種比、水料比、發(fā)酵溫度對氨基態(tài)氮含量和風味強度的影響Fig. 1 Effects of culture strains ratios，waters-material ratios and temperature on amino acid nitrogen and sensory properties

菌種比決定菌種在發(fā)酵過程中的生長繁殖速度，并直接決定發(fā)酵產(chǎn)物種類和含量[7].由圖1(a)可知：曲料中氨基態(tài)氮含量和風味強度在發(fā)酵過程中的變化趨勢相似，成曲的氨基態(tài)氮含量和風味強度隨著黑曲霉的增加而減少，表明成曲中酸性蛋白酶活力較少，中性蛋白酶活力較高.氨基態(tài)氮含量和風味強度隨米曲霉的增加而增加.在米曲霉和黑曲霉質(zhì)量比為3﹕1時，氨基態(tài)氮含量和風味強度都達到最大值，表明中性蛋白酶活力較強[8].當米曲霉和黑曲霉質(zhì)量比為4﹕1時，氨基態(tài)氮含量和風味強度都出現(xiàn)下降，可能是菌株分泌的酶下降導致.因此，初步確定米曲霉和黑曲霉的適宜質(zhì)量比為3﹕1.

曲料水分與氨基態(tài)氮含量有重要關系.水分過多時，不利于各種酶類的代謝反應，造成曲料過稀，對于酶活力有一定的影響.由圖1(b)可知：不同的水料比對氨基態(tài)氮的含量有影響，隨著水分的增加，曲料中的氨基態(tài)氮含量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢.水料比(mL﹕g)為0.2﹕1～0.4﹕1時，由于水分含量適宜，適合蛋白酶活性，將蛋白質(zhì)分解成游離氨基酸，使氨基態(tài)氮含量增加，風味強度也隨之逐漸增加[9].水料比為0.4﹕1時，曲料中的氨基態(tài)氮含量最高為1.197%，水料比超過0.4﹕1時，由于水分活度大，對蛋白酶起到抑制作用，蛋白酶分解蛋白的能力降低，使得曲料中氨基態(tài)氮含量逐漸減少.當水料比超過0.6﹕1時，曲料中氨基態(tài)氮含量和風味強度均隨著水分的增加而下降，原因是微生物的生長需要適宜的水分，過多或過少的水分均會影響其生長繁殖，對其發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)生影響[10]，水分的稀釋作用也會對滋味和香氣造成不利影響[11].因此，初步確定水料比的適宜比例(mL﹕g)為0.4﹕1.

發(fā)酵溫度通過改變微生物的蛋白質(zhì)、核酸的結(jié)構(gòu)和活性進而影響微生物的代謝產(chǎn)物的生成種類和生長情況[12].由圖1(c)可知：在制曲過程中，氨基態(tài)氮含量隨著溫度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢.當培養(yǎng)溫度達到30℃時氨基態(tài)氮含量達到最高，并顯著高于其他組(P＜0.05)；從30℃升高到45℃的過程中，氨基態(tài)氮含量直線下降，這可能是由于溫度高于30℃抑制了菌種發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶活性[13].相反，風味強度隨著溫度的升高而逐漸升高，這可能是由于溫度越高，杏仁粕發(fā)生美拉德反應的產(chǎn)物越多，香氣越厚重，風味強度越高.當溫度高于40℃時，氨基態(tài)氮含量下降，不利于風味物質(zhì)的產(chǎn)生，因此初步確定適宜發(fā)酵溫度為30℃.

2.2 響應面實驗結(jié)果

以米曲霉與黑曲霉質(zhì)量比(A)、溫度(B)、水料比(C)為因素，曲料的氨基態(tài)氮含量(Y1)和風味強度(Y2)為響應值進行制曲優(yōu)化實驗.響應面Box-Behnken實驗設計與結(jié)果見表2.氨基態(tài)氮含量響應面模型的方差分析結(jié)果見表3.

表2 Box-Behnken實驗設計與結(jié)果Tab. 2 Box-Behnken design and results

表3 氨基態(tài)氮含量的響應面方差分析Tab. 3 Analysis of variance of response surface of amino acid nitrogen

從表3中可以看出，模型的F值為19.79，P＞F小于0.05，說明總體該模型顯著.該模型失擬項的P＞F為0.86，大于0.05，失擬項不顯著，說明該模型選擇合適，可以用于氨基態(tài)氮含量變化的分析.

顯著影響因素對氨基態(tài)氮含量的交互作用如圖2所示.菌種比和溫度、溫度和水料比之間存在顯著的交互作用(P＜0.05)，與方差分析的結(jié)果一致.利用Design-Expert 10.0.7 分析軟件對數(shù)據(jù)進行擬合得到氨基態(tài)氮含量的二次回歸方程為

圖2 顯著影響因素對氨基態(tài)氮含量的交互作用Fig. 2 Interaction of significant influencing factors on amino nitrogen content

風味強度響應面模型方差分析結(jié)果見表4.

表4 風味強度的響應面方差分析Tab. 4 Analysis of variance for response surface of sensory properties

從表4中可以看出：模型的F值為15.56、“P＞F”小于0.05，說明總體該模型顯著.該模型失擬項的“P＞F”為0.85，大于0.05，失擬項不顯著，說明該模型選擇合適，可以用于風味強度變化的分析.

顯著影響因素對風味強度的交互作用如圖3所示.從圖3中可以看出，菌種比與溫度之間存在顯著的交互作用(P＜0.05)，與方差分析的結(jié)果一致.

圖3 顯著影響因素對風味強度的交互作用Fig. 3 Interaction of significant factors on flavor intensity

用Design-Expert 10.0.7分析軟件對數(shù)據(jù)進行擬合，得到風味強度的二次回歸方程為

Y2＝81.6－0.25A－3.38B＋9.63C－5.50AB＋1.50AC－0.75BC－5.18A2－5.93B2－2.43C2加權(quán)綜合評分(Y)算法參考文獻[14].本實驗中曲料的氨基態(tài)氮含量和風味強度對曲料的風味同樣重要，所以加權(quán)系數(shù)均定為0.5.

Y＝0.5Y1＋0.5Y2

即

Y＝41.35-0.06A-1.76B＋5.01C-2.83AB＋0.78AC-0.45BC-2.69A2-3.01B2-1.34C2

2.3 最佳工藝條件

綜合以上對氨基態(tài)氮含量和風味強度的響應面模型進行數(shù)學分析，以加權(quán)綜合評分最大化為指標，得到發(fā)酵的最優(yōu)條件為米曲霉與黑曲霉質(zhì)量比(g﹕g)0.375﹕0.125、溫度30℃、水料比(mL﹕g)為0.5﹕1.此條件下發(fā)酵5d成曲的加權(quán)綜合評分為43.10，氨基態(tài)氮含量為0.95%，風味強度為75.20.考慮到實際操作情況，將各條件修正為米曲霉與黑曲霉質(zhì)量比(g﹕g)3﹕1、溫度30℃、水料比(mL﹕g)0.5﹕1.在此條件下進行3次平行實驗，氨基態(tài)氮含量為1.25%，風味強度為80.00，加權(quán)綜合評分為40.61，與預測值接近.這說明該模型很好地預測了曲料的氨基態(tài)氮含量和風味強度，優(yōu)化工藝條件可靠.

2.4 揮發(fā)性風味物質(zhì)分析

杏仁粕發(fā)酵前后鑒定香氣物質(zhì)見表5.

共檢測了22種主要成分，其中酯類3種、醛類5種、醇類5種、酮類1種、酸類2種、酚類2種、含氮化合物3種、雜環(huán)化合物1種.曲料風味物質(zhì)主要為苯甲醛、苯甲醇、3–辛酮、苯甲酸甲酯和苯甲酸乙酯，其中醛類和酮類是含羰基化合物，是肉香的特征物質(zhì).醇類化合物主要是脂質(zhì)的氧化降解或者是羰基化合物還原生成，主要具有花香、甜香和水果香.酯類化合物可以通過醇和有機酸酯化反應生產(chǎn)，一般賦予食品花香和果香.雜環(huán)化合物具有焦香味，可以使食物呈現(xiàn)烤肉香味[15].發(fā)酵后的醇類和酯類酸類總量均高于發(fā)酵前的杏仁粕，這與文獻[16]研究結(jié)果一致，特別是發(fā)酵后總的醇類含量是未發(fā)酵的總醇類含量的6倍，是曲料產(chǎn)香的主體成分，也是形成酯類物質(zhì)的前體，這使得曲料的風味大大增加[17].適量的酸也可以提高曲料的整體協(xié)調(diào)性[18].曲料生產(chǎn)的過程中，由于溫度升高，曲料中的蛋白質(zhì)和微生物殘體自溶，轉(zhuǎn)化為氨基酸等物質(zhì)產(chǎn)生曲香[19].風味物質(zhì)的差異是造成原樣和曲料感官特征不同的主要原因.

3 結(jié) 語

以杏仁粕為制曲基質(zhì)，對曲料中氨基態(tài)氮含量和風味強度的影響因素進行分析.結(jié)果表明，菌種比、水料比和發(fā)酵溫度對杏仁粕曲料的風味都有影響，其影響程度由大到小依次為溫度、水料比、米曲霉與黑曲霉質(zhì)量比.當米曲霉與黑曲霉質(zhì)量比(g﹕g)3﹕1、溫度30℃、水料比(mL﹕g)0.5﹕1，發(fā)酵5d成曲的氨基態(tài)氮含量為1.25%、風味強度為80.00，杏仁粕曲料風味較好.對曲料進行揮發(fā)性風味成分進行分析，曲料風味物質(zhì)主要為苯甲醛、苯甲醇、3–辛酮、苯甲酸甲酯和苯甲酸乙酯.與未發(fā)酵相比，發(fā)酵的杏仁粕顏色加深、風味加強，這為進一步研究發(fā)酵杏仁粕曲料風味，提高其應用價值奠定了基礎.