益景湯對(duì)早期糖尿病大鼠腦微血管病變的影響及作用機(jī)制

王 麗，劉光輝，林 韻，張洪生，高愛明，孟 春，趙 利，周子鑫

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004；2.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）已成為危害人類健康最大的疾病之一，中國(guó)是目前全球糖尿病患者人數(shù)最多的國(guó)家，2017 年流行病學(xué)調(diào)查顯示中國(guó)糖尿病總患病率高達(dá)11.2%［1］。 DM 并發(fā)癥眾多，長(zhǎng)期高血糖會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)不同程度的學(xué)習(xí)和記憶能力下降，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙甚至癡呆，臨床稱此為糖尿病腦?。╠iabeticencephalopathy，DE），發(fā)病原因可能與長(zhǎng)期高血糖導(dǎo)致腦微血管病變有關(guān)［2］，具體機(jī)制尚不十分明確。

有研究表明：DM 代謝產(chǎn)物——晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end-products，AGEs）能夠激活TGF-β1／Smads 信號(hào)通路，誘導(dǎo)腦微血管相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)異常，損傷血腦屏障，引起腦微血管病變［3］。 益景湯是福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院治療DM 微血管病變的有效經(jīng)驗(yàn)方， 臨床應(yīng)用多年。本團(tuán)隊(duì)臨床研究表明益景湯能夠改善DM 患者眼部微血管循環(huán)［4-6］，降低糖尿病心肌病的血清學(xué)指標(biāo)，對(duì)糖尿病心肌病有較好療效［7］，可有效改善早期DM 腎病患者癥狀［8］。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明益景湯能夠改善DM 大 鼠 眼 部［9-11］、心 臟［12］、腎 臟［13］的 血 流 動(dòng) 力學(xué)，保護(hù)相應(yīng)的器官功能，但在治療腦微血管病變方面尚無(wú)相應(yīng)研究。 本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上，采用DM 大鼠模型，基于TGF-β1／Smads 信號(hào)通路，研究益景湯對(duì)早期DM 腦微血管病變的影響。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性健康清潔級(jí)SD 大鼠，鼠齡5～6 周，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)買自福州諾頓斯生物科技有限公司，合格證號(hào)：20170012009954，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（閩）2020-0002，飼養(yǎng)環(huán)境溫度21～25 ℃，相對(duì)濕度為50%～55%。 普通顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，12 h／12 h 明暗交替光照。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理按國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)1988 年頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》執(zhí)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 鏈脲佐菌素（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；一抗（英國(guó)Abcam 公司），包括：晚期糖基化終產(chǎn)物特異性受體（RAGE）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGFβ1）、同源物4 重組蛋白（Smad4）、纖維連接蛋白（fibronectin）、緊密連接蛋白5（claudin-5）、Ⅳ型膠原蛋白（collagenⅣ）；二抗（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；WB 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；檸檬酸鹽（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；10%中性福爾馬林固定液（北京百奧萊博科技有限公司）；血糖試紙（拜耳醫(yī)藥保健有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 益景湯（福建省名老中醫(yī)金威爾有效經(jīng)驗(yàn)方），組成：生黃芪15 g，山藥15 g，蒼術(shù)9 g，桃仁5 g，紅花5 g，當(dāng)歸9 g，川芎6 g，赤芍10 g，茯苓15 g，生地黃15 g，玄參15 g。 每劑水煎至50 mL（藥物濃度約2.38 g／mL），滅菌玻璃瓶灌裝，密封避光備用。

2 方 法

2.1 造模及分組 將健康雄性清潔級(jí)SD 大鼠30 只隨機(jī)分為正常組、模型組、益景湯組，每組10 只。 正常組常規(guī)喂養(yǎng)，其余2 組進(jìn)行DM 模型制備［11］。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，禁食12 h 后，將鏈脲佐菌素用0.1 mmol／L、pH 值4.5 的無(wú)菌檸檬酸緩沖液溶解，配置成1%溶液后，按70 mg／kg 劑量進(jìn)行一次性腹腔注射。 72 h 后取大鼠尾血檢測(cè)血糖，血糖濃度≥16.7 mol／L 即視為DM 模型制備成功。

2.2 給藥 正常組常規(guī)喂養(yǎng)；益景湯組予益景湯水煎液灌胃，按10.71 g／（kg·d）計(jì)算，取藥1.35 mL，加蒸餾水稀釋至3 mL，一次性灌胃，每日1 次；模型組給予生理鹽水3 mL／d 一次性灌胃，每日1 次。 2 組分別干預(yù)16 周。

2.3 取材及制片 各組大鼠干預(yù)16 周后，采用一氧化二氮吸入麻醉后，記錄體質(zhì)量；脫椎處死3 組大鼠，剪開顱骨，剝離出完整腦組織，記錄腦實(shí)質(zhì)重量，并測(cè)量體積。 沿矢狀面對(duì)剖，取一半放入液氮保存，另一半沿矢狀面2 mm 厚度切片，放入包埋盒，投入10%中性福爾馬林固定24 h 后行病理切片制備。

2.4 Western blot 檢測(cè) 取出3 組液氮保存的腦組織，勻漿、裂解后置入離心管中，4 ℃條件下離心5 min，取上清液進(jìn)行蛋白含量測(cè)定；SDS-PAGE 凝膠電泳；將3 組蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜，5%牛奶37 ℃封閉1 h 后，加入RAGE、TGF-β1、Smad4、fibronectin、claudin-5、collagen Ⅳ和GAPDH 一 抗，4℃孵 育 過(guò)夜；TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入二抗37 ℃孵育2 h；TBST 洗膜3 次，ECL 發(fā)光、顯影、定影后室溫下晾干、掃描，以GAPDH 作為內(nèi)參，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析各目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值，獲取目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 計(jì)量資料屬正態(tài)分布的以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用最小顯著性差異法（LSD 法）。

3 結(jié) 果

3.1 3 組大鼠一般情況比較 見表1。

表1 各組大鼠一般情況比較（±s）

表1 各組大鼠一般情況比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

腦實(shí)質(zhì)重量／g 1.91±0.15 1.59±0.031）1.73±0.061）組別正 常 組模 型 組益景湯組n 10 10 10體質(zhì)量／g 519.02±21.39 196.28±22.491）211.30±27.301）腦體積／cm3 3.81±0.66 2.09±0.291）3.49±0.592）

3.2 3 組大鼠腦微血管的光鏡觀察 重點(diǎn)觀察3 組大鼠腦組織海馬區(qū)域。 正常組腦組織見少量毛細(xì)血管增生，管壁薄，無(wú)充血、出血；益景湯組與正常組比較，毛細(xì)血管略增生，管壁稍增厚，管腔稍充血；與模型組比較，毛細(xì)血管增生緩解，血管壁相對(duì)較薄，未見明顯充血及出血區(qū)域。 見圖1。

圖1 光鏡下3 組大鼠腦微血管形態(tài)觀察（×400）

3.3 3 組大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的光鏡觀察 重點(diǎn)觀察3 組大鼠腦組織海馬區(qū)域。 正常組腦組織海馬結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)正常；益景湯組與正常組比較，膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增加；與模型組比較，缺血神經(jīng)元明顯減少，未見神經(jīng)纖維纏結(jié)，膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多、體積增大。 見圖2。

圖2 光鏡下3 組大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)觀察（×400）

3.4 3 組對(duì)大鼠TGF-β1／Smads 信號(hào)通路相對(duì)蛋白表達(dá)量比較 見圖3。

圖3 3 組TGF-β1／Smads 信號(hào)通路相對(duì)蛋白表達(dá)量比較

4討 論

DE 是DM 微血管并發(fā)癥之一， 其發(fā)病原因可能與腦微血管病變導(dǎo)致腦部缺血有關(guān)［14-15］。 與機(jī)體其他血管系統(tǒng)比較，腦微血管分布錯(cuò)綜復(fù)雜，機(jī)體為了保障腦內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定，形成了一個(gè)特殊的微血管結(jié)構(gòu)——血腦屏障（BBB），主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞組成［16-17］。 血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)緊密連接蛋白彼此緊密連接，奠定了BBB最基本的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，血管基底膜進(jìn)一步維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。claudin-5 是構(gòu)成細(xì)胞間緊密連接的主要組分，在內(nèi)皮細(xì)胞上高表達(dá)，有研究表明claudin-5 缺失會(huì)導(dǎo)致BBB 發(fā)生選擇性滲漏［18］。 BBB 的基底膜主要由細(xì)胞外基質(zhì)組成， 包括fibronectin、collagenⅣ等［19］。

有研究表明：機(jī)體在長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)下，AGEs 過(guò)度積累，與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞表面的RAGE結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，導(dǎo)致腦微血管病變［20］。TGF-β1／Smads 信 號(hào) 通 路 是 其 中 的 重 要 通 路［21］，AGEs 與RAGE 結(jié)合后，誘導(dǎo)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞表達(dá)TGF-β1，激活Smads 信號(hào)通路，Smad2／3 磷酸化后與關(guān)鍵亞基Smad4 形成異聚復(fù)合體，將信號(hào)從胞漿轉(zhuǎn)移到胞核中。 一方面誘導(dǎo)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞分泌fibronectin、collagenⅣ，導(dǎo)致血管基底膜增厚，管腔變窄，加上糖尿病患者脂質(zhì)代謝紊亂，血液黏稠度升高，血流緩慢，導(dǎo)致微血栓形成或微血管閉塞，使腦血流灌注明顯減少；另一方面抑制內(nèi)皮細(xì)胞分泌claudin-5，破壞細(xì)胞間的緊密連接，破壞BBB 的完整性，使BBB 通透性升高，破壞大腦微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，引起神經(jīng)元的損害和凋亡，最終導(dǎo)致DE 的發(fā)生［22］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為DE 屬于“健忘”“呆癥”范疇，基本病機(jī)以氣陰兩虛為本，以血瘀為標(biāo)。 長(zhǎng)期糖尿病導(dǎo)致氣虛血行無(wú)力，瘀血內(nèi)停，阻滯腦絡(luò)，蒙蔽腦竅。因此DE 的中醫(yī)治療應(yīng)以“益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)”為原則。

益景湯是我院用于防治早期DM 微血管病變的有效經(jīng)驗(yàn)方，臨床應(yīng)用20 余年，是福建省名老中醫(yī)金威爾在益氣活血名方——補(bǔ)陽(yáng)還五湯的基礎(chǔ)上，去地龍，加山藥、蒼術(shù)、茯苓、玄參、生地黃而成。方中生黃芪益氣，生地黃、玄參養(yǎng)陰生津，山藥、蒼術(shù)、茯苓健脾，桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎、赤芍活血化瘀。 全方共奏益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)之功效，組方符合中醫(yī)防治DE 的基本原則， 具有中醫(yī) “治本” 的優(yōu)勢(shì)。 團(tuán)隊(duì)前期臨床研究表明：益景湯對(duì)于改善DM患者眼部、心肌、腎臟微血管循環(huán)，保護(hù)相應(yīng)臟器功能均有一定的療效［4-13］。

本研究結(jié)果顯示：①高血糖導(dǎo)致大鼠體質(zhì)量明顯減輕，腦實(shí)質(zhì)萎縮，大腦體積下降，益景湯可以改善這些癥狀，對(duì)大腦正常體積的維持作用尤為明顯；②高血糖導(dǎo)致大鼠腦組織缺血神經(jīng)元明顯增多，甚至出現(xiàn)神經(jīng)纖維纏結(jié)（神經(jīng)元的一種病理變化，與老年性癡呆相關(guān)），益景湯可以緩解高血糖導(dǎo)致的腦部缺血性變化，緩解腦萎縮，改善腦部血流灌注；③高血糖導(dǎo)致大鼠腦組織TGF－β1／Smads 信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白TGF－β1 和Smad4 表達(dá)升高，下游血管相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白fibronectin 和collagenⅣ表達(dá)升高，claudin-5 表達(dá)降低，提示該通路是DM 腦微血管病變的發(fā)病機(jī)制之一。益景湯可以通過(guò)調(diào)節(jié)TGFβ1／Smads 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)異常，保護(hù)細(xì)胞間的緊密連接，保護(hù)血管基底膜，對(duì)于維持腦微血管正常結(jié)構(gòu)及功能有一定的效果。

綜上，益景湯能一定程度的改善早期DM 大鼠的消瘦和腦組織萎縮，并通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1／Smads信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，改善DM 大鼠早期腦微血管損害，改善腦部血流灌注。 對(duì)TGF-β1／Smads信號(hào)通路的調(diào)控可能是益景湯干預(yù)早期DM 腦微血管病變的作用機(jī)制之一。