結(jié)石性膽囊炎患者膽囊黏膜組織Hp DNA及CagA和CCK-AR表達(dá)研究*

熊茂程，雷艷梅，李良敏，李 楊

膽囊黏膜化生主要有幽門腺化生和杯狀細(xì)胞化生，均屬腸型化生。66%～84%膽囊切除組織可見幽門腺化生，12%～52%因結(jié)石性膽囊炎切除的膽囊組織可見杯狀細(xì)胞化生[1]。目前，大部分國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為化生是膽囊異型增生的前期病變，膽囊黏膜可由化生發(fā)展為異型增生，最后發(fā)展為癌[2，3]。膽囊癌具有惡性程度高、預(yù)后差等特點(diǎn)，且發(fā)病隱匿，早期診斷困難，故深入分析膽囊炎和膽囊癌發(fā)病機(jī)制，對防控疾病有利[4]。幽門螺桿菌(helicobacter pylori，Hp)是與胃炎和胃癌密切相關(guān)的致病菌。雖然Hp是一種專性微需氧菌，但體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Hp暴露于5%膽汁培養(yǎng)基中30 min，75%Hp可存活，提示Hp可能在通過十二指腸時仍存活，并逆行定植于膽囊內(nèi)[5]。近年研究也發(fā)現(xiàn)，Hp可能產(chǎn)生毒素，并誘導(dǎo)黏膜炎性反應(yīng)，損害膽囊黏膜屏障，參與膽囊黏膜上皮細(xì)胞變性和壞死等過程[6]。本研究從分子生物學(xué)角度分析了Hp DNA及其毒素基因與結(jié)石性膽囊炎患者膽囊黏膜病變的關(guān)系，以評估Hp感染與結(jié)石性膽囊炎發(fā)病的關(guān)系及其可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2019年1月～2020年12月我院收治的結(jié)石性膽囊炎患者98例，男41例，女57例；年齡為24～66(50.3±11.2)歲。經(jīng)影像學(xué)檢查診斷，行擇期膽囊切除術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并膽囊癌或其他惡性腫瘤、膽囊穿孔或積膿；⑵曾接受過膽道手術(shù)；⑶慢性膽囊炎急性發(fā)作；⑷合并肝臟、心血管等其他臟器嚴(yán)重疾病。患者及其家屬簽署知情同意書，本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。

1.2 膽囊組織超微結(jié)構(gòu)檢查 取膽囊黏膜組織，切成1.0 mm×1.0 mm×2.0 mm的小塊，用0.9%等張氯化鈉溶液清洗，經(jīng)4%戊二醛固定，用PBS清洗，以鋨酸固定1 h。用乙醇脫水，用EPON 812和815樹脂混合包埋，經(jīng)超薄切片機(jī)(瑞典LKB，8800-Ⅲ型)切片，用阿利新藍(lán)-過碘酸雪夫行組織化學(xué)染色(染色液由南京森貝伽生物科技有限公司提供)，在透射電鏡下觀察膽囊黏膜組織學(xué)表現(xiàn)和細(xì)胞分泌黏液特點(diǎn)，并根據(jù)病理學(xué)分型特點(diǎn)將其分為單純性增生(上皮細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞間有間隙，細(xì)胞大小均勻且側(cè)面呈高柱狀)、腸型化生(上皮細(xì)胞輕度變性，細(xì)胞表面可見分泌顆粒，也可見聚集的球狀黏液顆粒)和異型增生(成片上皮細(xì)胞破潰、糜爛，上皮下大量膠原纖維呈網(wǎng)狀或束狀排列，部分上皮細(xì)胞再生增殖，增生細(xì)胞排列緊密且大小不一、折疊呈結(jié)節(jié)狀)。

1.3 膽囊組織Hp DNA檢測 取膽囊黏膜組織0.5×1.0×0.5 cm3，與提取液200 μL混合，經(jīng)55℃水浴12 h，95℃水浴15 min，1500 r/m離心5 min。使用等體積酚/氯仿抽提DNA，采用PCR法擴(kuò)增檢測Hp DNA。引物序列上游為5′-CATCTCCCCCAACAAAT

C-3′，下游為5′-TTCACCCACACGACCCATA-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成和純化。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)。最后，72℃延伸10 min，在1%瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物。

1.4 膽囊組織基因檢測 取膽囊黏膜組織，加入Trizol提取液(美國Invitrogen公司)提取總RNA，測定A260/A280值，計(jì)算總RNA濃度。取RNA 2μL，用試劑盒(上?？迫A生物技術(shù)公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)即用型試劑盒制備PCR體系25μL，將制備完成的PCR反應(yīng)管置入實(shí)時熒光定量PCR儀內(nèi)，檢測以下基因：細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(cytotoxin-associated gene A，CagA) mRNA，引物序列上游為5′-GATAACAGGCAAGCTTTGAGG-3′，下游為5′-CTGCAAAGATTGTTTGCGAGA-3′；膽囊收縮素-A受體(cholecystokinin-A receptor，CCK-AR) mRNA，引物序列上游為5′-CACCATGTCCATCCACTTCA-3′，下游為5′-CTTGATCTGCTCGCTCTCCT-3′；β-actin引物序列為上游5′-CCATCGTCCACCGCAAAT-3′，下游5′-CCTGTAACAACGCATCTCATA-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成和純化。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4 min，95℃變性60 s，50℃退火60 s，72℃延伸60 s，共30個循環(huán)。最后，72℃延伸5 min，以β-actin為內(nèi)參，使用凝膠成像系統(tǒng)攝像，采用2-ΔΔCt法定量，以目的基因與β-actin比值作為目的基因mRNA相對水平。

1.5 膽囊組織磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)活性檢測 取膽囊黏膜組織，加入稀釋液4 mL，用玻璃勻漿器勻漿，60℃水浴30 min，置于4℃保溫箱內(nèi)。采用鹽酸滴定法計(jì)算PLA2活性，1個 PLA2活性單位為37℃下1 min、1 mL樣本反應(yīng)消耗1nmol鹽酸的量。

2 結(jié)果

2.1 三組膽囊黏膜Hp DNA陽性檢出率比較 在本組98例結(jié)石性膽囊炎患者中，經(jīng)電鏡檢查，發(fā)現(xiàn)單純性增生33例，腸型化生45例，異型增生20例；在單純性增生組，膽囊黏膜Hp DNA陽性10例(30.3%)，腸型化生組18例(40.0%)，異型增生組10例(50.0%)，三組膽囊黏膜Hp DNA陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=2.103，P=0.40)。

2.2 三組膽囊黏膜CagA、CCK-AR mRNA相對水平和PLA2活性比較 異型增生組膽囊組織CagA mRNA相對水平和PLA2活性顯著高于其他兩組(P<0.05)，而CCK-AR mRNA相對水平顯著低于其他兩組(P<0.05，表1)。

表1 三組膽囊黏膜CagA、CCK-AR mRNA和PLA2活性比較

3 討論

在正常狀態(tài)下，Oddi括約肌可抑制細(xì)菌侵襲和繁殖，健康人膽道常處于無菌狀態(tài)[7]。然而，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可經(jīng)門靜脈系統(tǒng)入侵膽道，引起感染。細(xì)菌可分泌β-葡萄糖醛酸酶，促進(jìn)膽紅素鈣鹽沉積，形成膽色素類結(jié)石，參與膽結(jié)石的形成[8]。作為上消化道感染的主要細(xì)菌，Hp可產(chǎn)生CagA等毒素和磷脂酶等具有毒性作用的酶，對胃黏膜屏障形成損害[9]。Hp可在上消化道長期或暫時存在，并經(jīng)Oddi括約肌逆流進(jìn)入膽道系統(tǒng)[10]，但Hp感染是否與結(jié)石性膽囊炎的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，目前仍存在爭議。本研究中，膽囊粘膜單純性增生組、腸型化生組和異型增生組Hp DNA陽性率分別為30.3%、40.0%和50.0%，提示結(jié)石性膽囊炎患者膽道系統(tǒng)確實(shí)存在明確的Hp感染，與有關(guān)報道一致[11]。但三組膽囊黏膜Hp DNA陽性率比較無顯著性差異，考慮該結(jié)果一方面與Hp感染在膽囊黏膜組織病理學(xué)改變過程中發(fā)揮的作用仍不清楚，另一方面與本研究樣本量較小，導(dǎo)致結(jié)果未出現(xiàn)顯著性差異[12]。

CagA蛋白是Hp CagA基因編碼的產(chǎn)物，在Hp感染引起炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮效應(yīng)蛋白的作用，它還可調(diào)控多種信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞過度增殖、凋亡抑制、遷徙能力增強(qiáng)等異常生物學(xué)行為，促進(jìn)細(xì)胞癌變[13，14]。另有報道指出[15]，Hp致病性與細(xì)菌毒力因子和宿主細(xì)胞應(yīng)答等因素相關(guān)。CagA等毒素表達(dá)水平在Hp致病過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。在本研究中，膽囊黏膜CagA mRNA相對水平在單純性增生組、腸型化生組和異型增生組逐漸升高，結(jié)石性膽囊炎患者膽囊黏膜病變與膽囊黏膜CagA mRNA相對水平呈顯著正相關(guān)，這也說明Hp感染可能參與了結(jié)石性膽囊炎的膽囊黏膜病變的發(fā)展，隨著膽囊黏膜病理學(xué)損害程度的加重，Hp的致病性也變得明顯。另外，Hp具有高于其他細(xì)菌的PLA2活性。PLA2是前列腺素合成的限速酶，而前列腺素E2可刺激膽囊炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)膽囊黏膜分泌糖蛋白，促進(jìn)結(jié)石形成，故Hp感染還可能通過增加PLA2活性，促進(jìn)膽結(jié)石的形成[16，17]。本研究也發(fā)現(xiàn)，結(jié)石性膽囊炎患者膽囊黏膜病變與膽囊黏膜PLA2活性呈顯著正相關(guān)，提示Hp感染可能通過增加PLA2活性，促進(jìn)膽囊炎癥增強(qiáng)及結(jié)石的形成，加速膽囊黏膜病變的進(jìn)程。

另據(jù)文獻(xiàn)報道[18]，結(jié)石可引起膽囊收縮功能下降，而CCK-AR表達(dá)降低與膽囊收縮功能下降有關(guān)，進(jìn)而可引起膽汁淤積和結(jié)石的形成，加劇結(jié)石性膽囊炎的病情進(jìn)展。在本研究中，膽囊黏膜CCK-AR mRNA相對水平在單純性增生組、腸型化生組、異型增生組中逐漸降低，結(jié)石性膽囊炎患者膽囊黏膜病變與膽囊黏膜CCK-AR mRNA相對水平呈顯著的負(fù)相關(guān)，與上述報道相似。近年研究也發(fā)現(xiàn)[19]，Hp感染能降低膽囊壁CCK-AR表達(dá)能力，降低CCK-AR敏感性，導(dǎo)致膽囊收縮功能進(jìn)一步降低。因此，Hp感染還可能經(jīng)抑制CCK-AR表達(dá)等方式，參與結(jié)石性膽囊炎患者膽囊黏膜病變的進(jìn)展。

此外，結(jié)石性膽囊炎患者膽囊黏膜病變與年齡等因素相關(guān)[20]。有研究指出[21]，隨年齡的增長，結(jié)石性膽囊炎患者膽囊黏膜由腸型化生發(fā)展至異性增生耗時約為3年，黏膜病變可隨年齡的增加而更為嚴(yán)重。但本研究僅將年齡作混雜因素分析，未對膽囊黏膜病變與Hp感染的關(guān)系行年齡分層研究，也是本文存在的缺陷之一。為保證結(jié)論的科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性，今后還需針對不同年齡層患者的膽囊黏膜病變和Hp感染情況作進(jìn)一步的探究。

綜上所述，Hp感染可能通過增加CagA毒素表達(dá)、上調(diào)PLA2活性和抑制CCK-AR表達(dá)等方式，參與結(jié)石性膽囊炎患者膽囊粘膜病變的發(fā)生發(fā)展，促進(jìn)膽囊黏膜病變惡化。結(jié)石與膽囊炎的關(guān)系、膽囊炎與癌變的關(guān)系以及各基因在這個復(fù)雜的過程中的相互作用，仍需要深入研究。由于膽囊炎患者多存在多種基礎(chǔ)疾病，包括高脂血癥、高血壓、糖尿病、非酒精性脂肪性肝病和心腦血管疾病等，以及在處理這些復(fù)雜疾病過程中的用藥問題，都將影響膽囊粘膜病變的最終轉(zhuǎn)歸，這些都需要認(rèn)真研究。