原發(fā)性膽汁性膽管炎患者血漿細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4基因多態(tài)性分析

李衍強(qiáng)，石 慧，王文珊，林學(xué)賢，王英運(yùn)

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis，PBC)屬于自身免疫性肝病，是免疫功能紊亂介導(dǎo)的進(jìn)行性非化膿性膽管炎，可導(dǎo)致肝內(nèi)中小膽管損傷和肝內(nèi)膽汁淤積，最終可從肝纖維化發(fā)展為肝硬化[1，2]。有研究表明[3]，PBC 的發(fā)生具有一定的家族傾向性，患者直系親屬患PBC的風(fēng)險(xiǎn)是一般人群的50～100倍，且同卵雙胞胎共同患病概率高達(dá)63%左右。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4( cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4) 屬于免疫球蛋白超家族基因成員，與CD28有70%的同源性，主要以二聚體的形式表達(dá)于T細(xì)胞表面，在CD4+T細(xì)胞激活過(guò)程中具有關(guān)鍵性作用，能觸發(fā)機(jī)體整個(gè)T細(xì)胞群增殖和相關(guān)的細(xì)胞因子合成下調(diào)，抑制免疫應(yīng)答反應(yīng)[4，5]。CTLA-4基因具多個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位點(diǎn)。SNP的存在從不同方面影響著CTLA-4基因的表達(dá)。既往對(duì)于CTLA-4基因多態(tài)性的研究多集中在胃癌、肝癌、宮頸癌和乳腺癌等人類腫瘤和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病[6-8]。本研究檢測(cè)了PBC患者外周血CTLA-4基因多態(tài)性，旨在為該病的發(fā)病機(jī)制研究提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年9月～2020年12月我院收治的PBC患者30例，男性2例，女性28例；年齡為43～65歲，平均年齡為(59.4±5.5)歲。符合2015年發(fā)布的膽汁淤積性肝病診斷和治療共識(shí)中有關(guān)PBC的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤、精神異?；蚱渌J(rèn)知功能障礙、合并心、肺、腎、腸胃等其他重要臟器嚴(yán)重疾病、病毒性肝炎、藥物性肝損傷、酒精性肝炎、合并高血壓、糖尿病、存在感染、外傷等應(yīng)激狀態(tài)。另選擇同期在我院體檢、無(wú)肝腎功能異常、糖尿病、高血壓病的健康人35例作為對(duì)照組，男性3例，女性32例；年齡為42～66歲，平均年齡為(58.6±5.1)歲。入組人員簽署知情同意書(shū)，本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血漿CTLA-4基因多態(tài)性檢測(cè) 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法檢測(cè)血漿CTLA-4基因rs231775、 rs4675369和rs7599230位點(diǎn)多態(tài)性。抽取靜脈血6 mL，其中4 mL與乙二胺四乙酸混合后，保存于-80 ℃冰箱中備檢，用于DNA提取。使用貝克曼AMPurea XPDNA血液基因組提取試劑盒提取樣本基因組，雙蒸水溶解，樣本經(jīng)檢測(cè)純度合格后，-80℃條件下保存。針對(duì)CTLA-4基因rs231775、 rs4675369和rs7599230位點(diǎn)，參照美國(guó)Sequenom公司提供的序列設(shè)計(jì)引物，由蘇州泓迅生物科技有限公司負(fù)責(zé)合成。通過(guò)Sequenom MassAR-RAY 技術(shù)對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行分型。(1)目的基因擴(kuò)增：取適量基因組DNA，加入96孔板，取DNA 5 ng，加Taq聚合酶0.1 U，引物各2.5 pmol和dNTP 2.5 mmol。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：92℃，15 min；94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，45 s，循環(huán)40次，72℃，5 min。(2)SAP反應(yīng)：以0.3 U堿性磷酸酶除去剩余dNTP，37℃，40 min；83℃，5 min。(3)單堿基延伸：添加延伸引物5.4 pmol與50μmo的ldNTP和ddNTP混合物、Thermosequenase DNA聚合酶0.5 U，反應(yīng)條件設(shè)置為：96℃，2 min；96℃，5 s；54℃，5 s；72℃，5 s，循環(huán)35次；72℃，3 min。(4)脫鹽、上機(jī)：產(chǎn)物經(jīng)樹(shù)脂脫鹽處理15 min，將檢測(cè)樣品轉(zhuǎn)移到表面覆蓋基質(zhì)的SpectroCHIP芯片，通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0軟件分析，計(jì)數(shù)資料以%表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。采用Logistic回歸分析疾病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBC組與健康人血漿CTLA-4基因型和基因頻率分布比較 經(jīng)擬合優(yōu)度卡方檢驗(yàn)，兩組人群CTLA-4基因rs231775、rs4675369和rs7599230位點(diǎn)的基因型分布符合Hardy-Weinburg平衡定律(P>0.05)；PBC患者CTLA-4基因rs7599230位點(diǎn)等位基因和基因型頻率與健康人比，無(wú)顯著性差異(P>0.05)；PBC患者CTLA-4基因rs231775位點(diǎn)基因型為GG型和等位基因G比率顯著高于健康人，AA基因型和等位基因A比率顯著低于健康人(P<0.05)；PBC患者CTLA-4基因rs4675369位點(diǎn)基因型為GG型和等位基因G比率顯著高于健康人，AA基因型和等位基因A比率顯著低于健康人(P<0.05，表1)。

表1 PBC患者與健康人血漿CTLA-4基因型和基因頻率分布比較

2.2 CTLA-4基因型與PBC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)分析 應(yīng)用非條件Logistic回歸模型計(jì)算校正性別、年齡后的OR及95%CI，結(jié)果顯示rs4675369位點(diǎn)GG基因型是影響PBC發(fā)生的危險(xiǎn)基因型， rs231775位點(diǎn)GG基因型是影響PBC發(fā)生的危險(xiǎn)基因型(表2)。

表2 血漿CTLA-4基因型與PBC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)分析

3 討論

T淋巴細(xì)胞在人體免疫反應(yīng)中具有重要的作用，是細(xì)胞免疫和體液免疫的重要環(huán)節(jié)，能在抗原刺激下活化產(chǎn)生功能各異的淋巴因子，調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)[10，11]。PBC患者體內(nèi)包括多種類型的自身免疫性抗體，可導(dǎo)致機(jī)體肝臟以及其他臟器損傷，影響體液免疫反應(yīng)[12]。相關(guān)研究[13]通過(guò)在動(dòng)物體內(nèi)注射抗CTLA-4單克隆抗體來(lái)阻斷B7和CTLA-4之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致自身免疫性疾病動(dòng)物病情加重，這一現(xiàn)象證實(shí)了CTLA-4在自身免疫性疾病發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵性作用。CTLA-4也被稱為CD152，是T細(xì)胞活化的負(fù)性調(diào)節(jié)分子，基因定位于人2q31-2q33，包括4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，與CD28具有結(jié)構(gòu)同源性。CTLA-4可抑制信號(hào)傳導(dǎo)，終止細(xì)胞活化過(guò)程，其抑制作用一方面是通過(guò)與CD28分子競(jìng)爭(zhēng)性與B7結(jié)合，阻滯T淋巴細(xì)胞激活的第二信號(hào)傳遞；另一方面是通過(guò)胞內(nèi)域介導(dǎo)信號(hào)抑制細(xì)胞活化過(guò)程，從而達(dá)到T細(xì)胞活化的負(fù)向調(diào)控，促進(jìn)T細(xì)胞凋亡的最終目的[14]。近些年來(lái)，人類開(kāi)始廣泛關(guān)注CTLA-4 基因多態(tài)性與疾病發(fā)生的關(guān)系，多項(xiàng)研究[15，16]也已經(jīng)證實(shí)CTLA-4 的基因多態(tài)性與多種自身免疫性疾病之間存在密切關(guān)系。

研究表明[17]，CTLA-4基因中第一外顯子rs231775位點(diǎn)的A等位基因具保護(hù)性，G等位基因則與自身免疫性疾病的發(fā)生有關(guān)。該位點(diǎn)基因多態(tài)性與T細(xì)胞表面CTLA-4表達(dá)有關(guān)，可降低sCTLA-4水平，削弱其免疫抑制功能，促進(jìn)自身免疫性疾病的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示CTLA-4基因rs231775位點(diǎn)GG基因型是導(dǎo)致PBC發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。當(dāng)該基因位點(diǎn)發(fā)生A-G基因突變時(shí)，CTLA-4信號(hào)肽中蘇氨酸與甘氨酸發(fā)生替換，導(dǎo)致CTLA-4蛋白亞細(xì)胞出現(xiàn)定位異常，新生肽鏈和分子伴侶間作用受到影響，使CTLA-4折疊過(guò)程出現(xiàn)異常，導(dǎo)致其發(fā)生功能變化。研究表明[18]伴自身免疫性疾病的患者，CTLA-4基因rs4675369位點(diǎn)GG基因型表達(dá)水平顯著升高。本研究結(jié)果顯示rs4675369位點(diǎn)多態(tài)性與PBC易感性有關(guān)，對(duì)比PBC患者與健康人群，PBC患者血漿CTLA4基因rs4675369位點(diǎn)G等位基因頻率較高，GG基因型使PBC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)性增加了52.3%，與上述研究結(jié)果一致。rs4675369位點(diǎn)GG基因型可降低CTLA-4 轉(zhuǎn)錄水平，因此rs4675369位點(diǎn)GG基因型可弱化機(jī)體CTLA-4對(duì)T細(xì)胞激活的抑制，促使PBC的發(fā)生[19，20]。有研究顯示CTLA-4基因rs7599230位點(diǎn)CC基因型是PBC易感基因型。但本研究比較PBC患者與健康人群基因型和基因頻率分布無(wú)顯著性差異，這可能與本次研究收集的樣本量不足等因素有關(guān)，尚需要更大樣本量的深入研究，了解其差異。對(duì)于CTLA-4基因多態(tài)性與其他人群的差異問(wèn)題，需要更多層面的研究。不同性別、年齡、地域、基礎(chǔ)疾病等人群PBC易感性是否存在差異，都需要進(jìn)一步研究。為什么女性PBC發(fā)病率高，是否激素水平也有影響，均需闡明。