小檗堿靶向HDAC/H3K9ac/KLF4抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2脂肪變性體外實(shí)驗(yàn)研究*

李經(jīng)緯，王子璇，王夢(mèng)雨，黃瑞賢，信豐智，范建高，汪保燦

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)可以導(dǎo)致2型糖尿病、肝硬化和肝癌及其肥胖相關(guān)癌癥等的發(fā)生[1-4]。小檗堿(berberine， BBR)是一種天然的異喹啉類生物堿，存在于小檗、黃連、黃柏等多種藥用植物中。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，BBR可以緩解NAFLD[5,6]，減輕NAFLD患者肝組織脂肪變，同時(shí)也可以改善胰島素抵抗(IR)、治療代謝綜合征、降低膽固醇等。組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDACs)是一類蛋白酶，在染色體的結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[7]。在高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型小鼠，可以通過(guò)抑制肝組織HDAC活性，使組蛋白H3第9位賴氨酸乙?；?histone H3 lysine residue 9 acetylation，H3K9ac)顯著增加，從而有利于DNA與組蛋白八聚體的解離，使各種轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子能與DNA結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，激活基因轉(zhuǎn)錄[8]。H3K9ac水平升高可以通過(guò)促進(jìn)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α， PPARα)的活化，從而激活脂肪酸β氧化，緩解NAFLD病變[9]。BBR可以顯著抑制葡萄球菌腸毒素B(staphylococcal enterotoxin B，SEB)誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞HDAC活性，起到近似于HDAC抑制劑曲古菌素A(trichostatin A，TSA)的作用[10]。BBR也可以顯著抑制人類肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞HDAC的表達(dá)[11]。Krüppel樣因子4 (Krüppel-like factor4，KLF4)是一種鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在NAFLD患者肝組織KLF4表達(dá)水平較正常人顯著下降[12]。KLF4可以通過(guò)阻斷Apelin信號(hào)通路抑制急性肝損傷時(shí)的肝細(xì)胞脂肪變性13]。KLF4表達(dá)增加抑制了游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FAs)誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞炎癥反應(yīng)[14]。在白血病細(xì)胞K562和人食管癌細(xì)胞系KYSE150等細(xì)胞系H3K9ac水平增加可使KLF4表達(dá)水平顯著增加[15]。本研究應(yīng)用棕櫚酸(palmitic acid，PA)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞構(gòu)建NAFLD細(xì)胞模型，觀察了BBR對(duì)細(xì)胞HDAC1、H3K9ac、KLF4、SREBP-1c和PPARγ表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人肝癌細(xì)胞株HepG2來(lái)自于美國(guó)模式菌收集中心(American type culture collection，ATCC)；BBR(Sigma公司)；PA(Sigma公司)；Lipofectmin 2000(Invitrogen公司)；抗-HDAC1 (武漢谷歌生物)；抗-H3K9ac(Abcam公司)；抗-KLF4(Proteintech公司)；抗- SREBP-1c(Proteintech公司)；抗- PPARγ(武漢谷歌生物)；pEX-3-HDAC1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(Ov-HDAC1)和SiRNA-KLF4-1/2(上海吉瑪基因)；油紅O(Sigma公司)；檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-6 的ELISA 試劑盒(Solarbio公司)；EZ-ChIP試劑盒(Millipore公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取HepG2細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和藥物干預(yù)組。以2×105接種于6孔板(2 ml/孔)，培養(yǎng)24 h，用200 μM PA刺激培養(yǎng)24 h。在BBR處理組，用完全培養(yǎng)基將20 mM BBR儲(chǔ)存液配置成為20 μM BBR工作液。取HepG2細(xì)胞，以2×105接種于6孔板(2 ml/孔)培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)基，加入20 μM BBR工作液2 ml，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。質(zhì)粒和small interfering RNA轉(zhuǎn)染：取HepG2細(xì)胞，以2×105接種于6孔板，培養(yǎng)24 h。隨機(jī)分為HDAC1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(Ov-HDAC1)、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(Ov-NC)、SiRNA-KLF4-1轉(zhuǎn)染組(SiRNA-KLF4-1)、SiRNA-KLF4-2轉(zhuǎn)染組(SiRNA-KLF4-2)和SiRNA-NC轉(zhuǎn)染組(SiRNA-NC)。在轉(zhuǎn)染前，棄去6孔板中含有血清的培養(yǎng)基，用PBS沖洗1～2次，加入Opti-MEM 培養(yǎng)基(1500 μl/孔)。取Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑5 μl和質(zhì)粒DNA 3 μg分別與opti-MEM培養(yǎng)基250 μl混合(使用同樣的方法轉(zhuǎn)染SiRNA)，混勻后靜置10 min，將兩者再混勻后靜置20 min，在每個(gè)孔中加入混合液500 μl，培養(yǎng)6 h，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法，收集細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA法定量檢測(cè)蛋白濃度。按照Western blot步驟對(duì)蛋白樣品電泳和電轉(zhuǎn)移，用5%牛奶封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，加二抗，室溫下孵育1 h，使用ECL發(fā)光試劑盒顯色，進(jìn)行顯色、掃描、拍照，分析蛋白條帶灰度。

1.4 HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積檢測(cè) 使用油紅O染色，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)脂滴。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

1.6 細(xì)胞KLF4啟動(dòng)子區(qū)H3K9ac水平檢測(cè) 采用CHIP-qPCR法，使用EZ-ChIP試劑盒裂解HepG2細(xì)胞，超聲處理，將染色質(zhì)切至200～700 bp長(zhǎng)度，離心后取上清液10 μl作為Input，其余上清液用于之后的實(shí)驗(yàn)。將交聯(lián)的DNA與抗H3K9ac抗體和陰性對(duì)照抗IgG抗體在4℃孵育過(guò)夜。加入NaCL使DNA去交聯(lián)，使用蛋白酶K消化去除蛋白質(zhì)，用純化后的DNA用于PCR試驗(yàn)。所用的引物由上海生工生物有限公司合成：KLF4啟動(dòng)子上游引物序列為5′-GAACAGGCGGAAAGAGGC-3′，下游引物序列為5′-CAGGAGAATCGCTTGGACG-3′，GAPDH上游引物序列為5′-CTCCTGCACCACCAACTGCT-3′，下游引物序列為5′-GGGCCATCCACAGTCTTCTG-3′。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞HDACs和H3K9ac蛋白表達(dá)水平比較 PA處理顯著提高了HepG2細(xì)胞HDAC1蛋白表達(dá)水平(P<0.001)，而降低了H3K9ac蛋白表達(dá)水平(P<0.001)；在PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞，BBR抑制了HDAC1蛋白的過(guò)量表達(dá)(P<0.01)，而顯著提高了H3K9ac蛋白的表達(dá)水平(P<0.01，圖1)。

圖1 各組細(xì)胞HDAC1和H3K9ac蛋白表達(dá)比較與對(duì)照組比，***P<0.001；與模型組比，##P<0.01

2.2 轉(zhuǎn)染HDAC1過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒對(duì)HepG2細(xì)胞H3K9ac水平的影響 轉(zhuǎn)染HDAC1過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒顯著增加了HepG2細(xì)胞HDAC1蛋白水平(P<0.001)，證實(shí)HDAC1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。在PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞，加入Ov-HDAC1質(zhì)粒顯著降低了HepG2細(xì)胞H3K9ac水平(P<0.001，圖2)。

圖2 HDAC1過(guò)表達(dá)細(xì)胞H3K9ac水平變化A：轉(zhuǎn)染HDAC1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒HepG2細(xì)胞HDAC1蛋白表達(dá)變化；B：轉(zhuǎn)染HDAC1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒HepG2細(xì)胞H3K9ac水平變化;與Ov-NC組比，***P<0.001

2.3 BBR在PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)H3K9ac水平激活KLF4的表達(dá) 與對(duì)照組比，PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞KLF4蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.001)，而B(niǎo)BR或丁酸鈉(一種HDAC抑制劑)處理后，HepG2細(xì)胞KLF4蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01，圖3A)。此外，CHIP-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，BBR處理后KLF4啟動(dòng)子區(qū)H3K9ac水平顯著增加(P<0.001，圖3B)，提示BBR通過(guò)提高HepG2細(xì)胞H3K9ac水平激活KLF4的表達(dá)。

圖3 各組細(xì)胞KLF4蛋白表達(dá)水平A：KLF4蛋白表達(dá)水平；B：兩組細(xì)胞經(jīng)抗H3K9ac抗體處理后KLF4啟動(dòng)子表達(dá)水平;與對(duì)照組比，***P<0.001；與模型組比，##P<0.01，###P<0.001

2.4 BBR在PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞通過(guò)激活KLF4減輕細(xì)胞脂質(zhì)積聚 與SiRNA-NC處理組比，轉(zhuǎn)染SiRNA-KLF4-1/2的HepG2細(xì)胞KLF4蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.01，圖4A)；與對(duì)照組比，PA誘導(dǎo)加劇了HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積；與模型組比，BBR處理緩解了PA誘導(dǎo)引起的脂質(zhì)沉積，而KLF4的沉默逆轉(zhuǎn)了BBR對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)積累的影響(圖4B)。

圖4 沉默KLF4基因抑制了BBR對(duì)PA 誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的保護(hù)作用A：轉(zhuǎn)染SiRNA的HepG2細(xì)胞KLF4蛋白表達(dá)變化；B：各組HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積情況(油紅O，100×);與SiRNA-NC組比，**P<0.01，***P<0.001

2.5 BBR在PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞通過(guò)激活KLF4改善炎癥反應(yīng) 與對(duì)照組比，PA誘導(dǎo)促進(jìn)了HepG2細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌(P<0.001)，而B(niǎo)BR處理可以顯著改善PA誘導(dǎo)引起的炎癥因子分泌(P<0.001)。同樣地，沉默KLF4逆轉(zhuǎn)了BBR的這種改善作用(圖5)。

圖5 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子水平比較與對(duì)照組比，***P<0.001；與模型組比，###P<0.001；與藥物干預(yù)組比，$$P<0.01，$$$P<0.001

2.6 BBR在PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞通過(guò)激活KLF4調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá) 與對(duì)照組比，PA誘導(dǎo)可以顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)合成相關(guān)基因SREBP-1c表達(dá)(P<0.001)，同時(shí)降低脂質(zhì)分解相關(guān)基因PPARγ表達(dá)水平(P<0.001)；與模型組比，BBR處理顯著抑制SREBP-1c表達(dá)(P<0.001)，同時(shí)促進(jìn)了PPARγ表達(dá)(P<0.001)，而沉默KLF4削弱了BBR對(duì)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用(P<0.001，圖6)。

圖6 各組細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較與對(duì)照組比，***P<0.001；與模型組比， ###P<0.001；與藥物干預(yù)組比， $$$P<0.001

3 討論

PA是FFAs的一種，可刺激細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生，促進(jìn)肝細(xì)胞的脂質(zhì)積累。在本研究中，我們建立了經(jīng)典的PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂肪變細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積顯著增加，細(xì)胞培養(yǎng)上清TNF-α、IL-1β和IL-6水平也顯著增加，證實(shí)NAFLD細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，BBR能保護(hù)肝臟功能。研究發(fā)現(xiàn)BBR可以通過(guò)激活Nrf2/HO-1和PPARγ信號(hào)通路減輕甲氨蝶呤誘導(dǎo)的肝損傷大鼠氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。BBR也可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和線粒體依賴性的細(xì)胞凋亡，保護(hù)急性肝衰竭(acute liver failure，ALF) 小鼠。在本研究，我們?cè)隗w外應(yīng)用BBR刺激PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BBR可以顯著改善PA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，降低細(xì)胞促炎細(xì)胞因子水平，提示BBR可以在體外緩解PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂肪變。

HDACs是一類通過(guò)組蛋白和非組蛋白去乙?；瘉?lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄過(guò)程的酶家族。HDAC1可以通過(guò)調(diào)控組蛋白H3K9ac水平在同型半胱氨酸介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝紊亂過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。此外，預(yù)防心血管疾病的藥物洛伐他汀通過(guò)降低HDAC1表達(dá)，使H3K9ac水平增加，從而抑制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。丁酸鈉(一種HDAC抑制劑)可以通過(guò)降低HDAC 1蛋白表達(dá)使H3K9ac水平上升，進(jìn)而促進(jìn)PPARα的活化，減輕肝脂肪變。HDAC抑制劑還能誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞KLF4表達(dá)，而甲基硒酸(methylseleninic acid，MSA)可以通過(guò)提高KLF4啟動(dòng)子區(qū)H3K9ac水平進(jìn)而激活KLF4的表達(dá)。KLF4的激活可能在緩解肝脂肪變方面發(fā)揮一定的作用。在本研究，我們發(fā)現(xiàn)PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞經(jīng)BBR處理后，HDAC1表達(dá)下降，H3K9ac水平升高，而HDAC1的過(guò)表達(dá)抑制了H3K9ac水平，表明HDAC1對(duì)H3K9ac的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，BBR通過(guò)調(diào)節(jié)H3K9ac水平來(lái)提高KLF4的表達(dá)，而沉默KLF4則逆轉(zhuǎn)了BBR對(duì)PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積和炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用，提示KLF4的激活參與了BBR對(duì)肝脂肪變的干預(yù)作用。