人工脫色過氧化物酶催化降解莧菜紅活性研究

向亨芳,劉 姣,杜可杰,林英武

(南華大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,湖南 衡陽 421001)

0 引 言

目前，我國紡織工業(yè)達(dá)到甚至領(lǐng)先于世界先進(jìn)水平，但是染料的后處理給生態(tài)環(huán)境帶來了巨大壓力。紡織工業(yè)的特點(diǎn)是產(chǎn)生大量的廢水、高度污染染料和添加劑，紡織品廢水如果不經(jīng)過適當(dāng)處理排入河流，會(huì)嚴(yán)重影響水生植物的光合過程和減少水中的溶解氧，其中許多對(duì)水生植物群和人類具有高度毒性[1]。偶氮染料是紡織工業(yè)使用最廣泛的合成染料之一，是染料廢水中典型的主要污染物。此外，偶氮染料如果在不適當(dāng)?shù)臈l件下(如乏氧條件)分解通常會(huì)產(chǎn)生比原始染料毒性更強(qiáng)的化合物，如芳香胺等，此類化合物對(duì)生命體具有致突變性和致癌作用[2]。偶氮染料廢水常規(guī)處理方法包括吸附處理、膜分離、光催化降解、電化學(xué)高級(jí)氧化法等。此類處理方法具有較多的缺點(diǎn)，如導(dǎo)致大量沉淀物的產(chǎn)生使形成的污泥難以處理、降解效率低等，因此尋找一種更加高效、清潔的染料處理方法成為亟待解決的問題[3]。與物理及化學(xué)方法相比，生物修復(fù)方法由于具有高效和環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)，因此在紡織廢水處理中被逐漸重視起來。自然界中已經(jīng)存在多種能夠降解工業(yè)染料的生物酶，如廣泛存在于微生物中的染料脫色過氧化物酶(DyPs)[4]，其屬于血紅素過氧化物酶類家族。但由于其通常需要在酸性較低(通常為pH3～4)的環(huán)境中才能發(fā)揮較好活性導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制[5-6]。而人工酶由于便于修飾及表達(dá)純化，在近幾年發(fā)展非常迅速，多種具有不同功能的人工酶涌現(xiàn)出來[7]。通過對(duì)天然酶的改造或者人工設(shè)計(jì)，為篩選出高效的染料脫色酶提供了條件。Y.Yu等通過在抹香鯨肌紅蛋白中設(shè)計(jì)功能性氧化酶模型實(shí)現(xiàn)了電子轉(zhuǎn)移(ET)速率比天然氧化還原酶高400倍的目標(biāo)[8]。本課題組以肌紅蛋白作為蛋白質(zhì)骨架設(shè)計(jì)了多種染料脫色過氧化物酶，其中通過在蛋白表面88位點(diǎn)引入色氨酸，設(shè)計(jì)了第三代染料脫色過氧化物酶F43Y/F138W/P88W Mb，其對(duì)活性藍(lán)19的催化活性超過大部分天然染料脫色過氧化物酶[9]。這也表明，對(duì)肌紅蛋白為進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)，可以篩選出高效的人工染料脫色酶。之前的研究表明，天然DyPs中多個(gè)酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)殘基的存在，例如彎曲高溫單孢菌TcDyP中的Tyr330、Tyr332、Trp263和Trp376，對(duì)染料脫色起著至關(guān)重要的作用[10]。本課題組前面報(bào)道的第二代染料脫色過氧化物酶F34Y/F138W Mb、第三代染料脫色過氧化物酶F43Y/F138W/P88W Mb，同樣顯示了色氨酸的合理設(shè)計(jì)引入可以增強(qiáng)人工酶的染料脫色活性[9,11]。因此構(gòu)建了F43Y Mb、F43Y/F138W、F43Y/F138W/P88W Mb三種人工過氧化物酶，選擇了在紡織生產(chǎn)中使用非常廣泛的偶氮染料-莧菜紅作為催化底物，詳細(xì)研究了人工酶對(duì)莧菜紅的氧化脫色效果。我們采用紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)F43Y Mb、F43Y/F138W Mb、F43Y/F138W/P88W Mb的莧菜紅催化降解進(jìn)行了表征，通過快速截留光譜儀對(duì)三個(gè)人工酶的莧菜紅的催化降解動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，人工脫色過氧化物酶F43Y/F138W/P88W Mb具備高效催化降解莧菜紅的能力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 野生型及突變體蛋白制備

莧菜紅購買自阿拉丁公司(中國上海)，抹香鯨野生型肌紅蛋白(WT Mb)及突變體蛋白F43Y Mb、F43Y/F138W Mb、F43Y/F138W/P88W Mb在大腸桿菌BL(21)DE3中表達(dá)并按照已有方法進(jìn)行純化[12-13]，通過質(zhì)譜進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)果。其他所有化學(xué)試劑均為商業(yè)產(chǎn)品，純度為分析純。

1.2 紫外可見光譜研究

使用Hewlett-Packard 8453紫外可見光譜儀，檢測(cè)在人工酶同時(shí)加入H2O2和莧菜紅后的200～700 nm范圍內(nèi)吸光度變化。采用吡啶光譜法測(cè)定蛋白的摩爾消光系數(shù)并用于蛋白濃度計(jì)算[14]，F(xiàn)43Y Mb、F43Y/F138W Mb和F43Y/F138W/P88W Mb的消光系數(shù)分別為ε404=146 L/(mmol·cm)、ε405=146 L/(mmol·cm)和ε407=160 L/(mmol·cm)。

1.3 動(dòng)力學(xué)研究

采用快速停流光譜儀(SF-61DX2Hi-TechKinetasystTM)測(cè)定F43Y Mb、F43Y/F138W Mb和F43Y/F138W/P88W Mb的催化效率。反應(yīng)在25 ℃下進(jìn)行，將高濃度莧菜紅加入到10 μmol/L蛋白中預(yù)混合，再與2 mmol/L H2O2等體積反應(yīng)，莧菜紅終濃度為0～140 μmol/L，監(jiān)測(cè)521 nm處吸光度變化以確定初始速率，初始速率與莧菜紅濃度的關(guān)系符合米氏方程(Michaelis-Menten equation)[14]：

υ/[蛋白質(zhì)]=kcat[莧菜紅]/(Km+[莧菜紅])

2 結(jié)果與討論

2.1 人工脫色過氧化物酶催化降解莧菜紅光譜研究

莧菜紅是一種典型的偶氮染料，被廣泛用于纖維、皮革、紙張的染色中，但是其也具有偶氮染料的共性——致突變性。以莧菜紅作為催化底物，通過快速停流光譜儀檢測(cè)三種突變體蛋白的染料脫色活性，設(shè)計(jì)并純化了三突變體蛋白F43Y/F138W/P88W Mb，該突變體蛋白138位點(diǎn)和88位點(diǎn)被色氨酸替代。同時(shí)為系統(tǒng)研究色氨酸及其替代位點(diǎn)對(duì)于催化活性的影響，我們純化了雙突變蛋白F43Y/F138W Mb和單突變蛋白F43Y Mb。蛋白終濃度均為5 μmol/L，莧菜紅終濃度為30 μmol/L，緩沖液為100 mmol/L、pH 7.0的磷酸鉀緩沖液。在H2O2終濃度為1 mmol/L條件下，F(xiàn)43Y Mb表現(xiàn)出了一定的莧菜紅催化降解能力。通過對(duì)其521 nm處的吸光度進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其對(duì)莧菜紅催化效率較低，約150 s后催化速率開始下降(圖1(b))。

圖1 不同蛋白降解莧菜紅紫外可見光譜Fig.1 UV-vis spectra of amaranth degraded by different proteins

在相同條件下，F(xiàn)43Y/F138W Mb表現(xiàn)出了較快的莧菜紅催化降解能力(圖1(c))。對(duì)其521 nm處吸光度分析看出其催化速率明顯比F43Y Mb提高，其在20 s內(nèi)即可將莧菜紅底物脫色降解(圖1(d))，該結(jié)果顯示，在138位點(diǎn)引入色氨酸可以顯著增強(qiáng)人工蛋白酶的活性。為了驗(yàn)證這一猜想，在合理設(shè)計(jì)后，于88位引入色氨酸基團(tuán)，得到F43Y/F138W/P88W Mb蛋白并研究了其活性。從結(jié)果可以看出(圖1(f))，莧菜紅在521 nm處的特征吸收峰隨著時(shí)間推移顯著降低，在10 s之內(nèi)被快速降解。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，催化降解莧菜紅活性能力F43Y/F138W/P88W Mb最大，F(xiàn)43Y/F138W Mb次之，F(xiàn)43Y Mb最小，這說明蛋白結(jié)構(gòu)中合理位點(diǎn)的色氨酸，在染料催化降解中起了重要的促進(jìn)作用。

2.2 人工脫色過氧化物酶對(duì)莧菜紅的催化動(dòng)力學(xué)分析

為了進(jìn)一步探究三種人工脫色過氧化物酶的活性，我們?cè)谧罴褩l件下(蛋白濃度：5 μmol/L，H2O2濃度：1 mmol/L)改變莧菜紅濃度(0～140 μmol/L)，測(cè)定了酶催化莧菜紅降解的動(dòng)力學(xué)變化(圖2(a))。將kobs與初始速率圖用米氏方程擬合得到動(dòng)力學(xué)參數(shù)kcat和Km(表1)。從最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，三突變體F43Y/F138W/P88W Mb的活性最高，其轉(zhuǎn)化數(shù)kcat分別比F43Y Mb提高了約39倍，比F43Y/F138W Mb提高了約5倍。但是三突變體F43Y/F138W/P88W Mb的Km值比F43Y Mb大了約1.2倍，比F43Y/F138W Mb大了約4.7倍。三突變體F43Y/F138W/P88W Mb的整體催化效率(kcat/Km)相比F43Y Mb提高了約33倍，而雙突變體F43Y/F138W Mb的整體催化效率(kcat/Km)與F43Y/F138W/P88W Mb差不多，比突變體F43Y Mb整體催化效率(kcat/Km)提高了約30倍。盡管雙突變體F43Y/F138W Mb的kcat值偏低，但是其Km值相對(duì)三突變體F43Y/F138W/P88W Mb來說降低了約4.6倍，抵消了kcat降低帶來的催化效率的降低，從而導(dǎo)致整體催化效率的提高。三突變體F43Y/F138W/P88W Mb的Km值最大，說明它與莧菜紅底物之間親和力最小，我們推測(cè)這可能是因?yàn)?8位色氨酸的出現(xiàn)增大了空間位阻，使莧菜紅分子更難接近血紅素邊緣附近。

圖2 不同蛋白催化速率與催化效率Fig.2 Catalytic rate and efficiency of different proteins

表1 在pH 7的100 mmol/L Kpi緩沖液中，三種突變體蛋白降解莧菜紅的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of amaranth degradation by three mutant proteins in pH7,100 mmol/L Kpi buffer

3 總 結(jié)

受天然脫色過氧化物酶的結(jié)構(gòu)特征的啟發(fā)，我們系統(tǒng)構(gòu)建了并純化了三個(gè)突變體蛋白F43Y Mb、F43Y/F138W Mb和F43Y/F138W/P88W Mb，即通過在肌紅蛋白的血紅素口袋中43位點(diǎn)和138位點(diǎn)、以及蛋白表面的88位點(diǎn)進(jìn)行改進(jìn)，并對(duì)三個(gè)突變體蛋白的莧菜紅脫色降解進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，三突變體蛋白F43Y/F138W/P88W Mb相對(duì)其它兩個(gè)突變體蛋白而言具有較高的莧菜紅催化速率，但是由于88位色氨酸的引入，導(dǎo)致其Km高于其它兩個(gè)突變體蛋白。F43Y/F138W Mb、F43Y/F138W/P88W Mb整體催化效率(kcat/Km)比無色氨酸引入的單突變體蛋白F43Y Mb要高，這也證實(shí)了色氨酸的合理引入，有利于提高蛋白的脫色過氧化物酶活性。本研究闡明了色氨酸在脫色過氧化物酶活性中的重要性，為今后人工脫色過氧化物酶的設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)。后面還需對(duì)人工脫色過氧化物酶活性機(jī)理及應(yīng)用條件進(jìn)行深入研究。