馬鈴薯脫毒組培快繁技術(shù)與實(shí)踐

房玉潔，張福明，李承永，王教義，趙增建

（濟(jì)南市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250316）

病毒病是為害馬鈴薯生長(zhǎng)的主要病害之一，病毒的侵染會(huì)嚴(yán)重影響馬鈴薯的生長(zhǎng)、發(fā)育、產(chǎn)量與品質(zhì)，應(yīng)用植物脫毒技術(shù)脫除馬鈴薯植株體內(nèi)的病毒，可恢復(fù)其抗病、抗逆性，提高產(chǎn)量和品質(zhì)。利用植物組織培養(yǎng)快繁技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)呈幾何級(jí)數(shù)繁育大量所需苗木。脫毒組培快繁技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用較早且成熟的技術(shù)，近20年來(lái)脫毒種苗的繁育和推廣應(yīng)用快速發(fā)展，在植物品種改良上被應(yīng)用得越來(lái)越廣泛。但優(yōu)質(zhì)脫毒種苗普及率仍較低，如作為糧菜兼用的我國(guó)第四大作物馬鈴薯是脫毒種苗推廣應(yīng)用較廣泛、增產(chǎn)效果較好的，脫毒后，馬鈴薯種性得到恢復(fù)，長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，抗病、抗逆性增強(qiáng)，種苗純度高、整齊度好，一般產(chǎn)量提高30%以上，商品性好，節(jié)肥、省藥且環(huán)保；而其脫毒優(yōu)質(zhì)種苗在全國(guó)應(yīng)用只有50%～60%；因此，還需大力加強(qiáng)脫毒優(yōu)良種苗的推廣應(yīng)用。

1 馬鈴薯病毒病及其危害

1.1 馬鈴薯病毒病

馬鈴薯病毒是具有侵染性的微小生物類(lèi)群，它主要由RNA、DNA與蛋白質(zhì)外殼構(gòu)成，通過(guò)侵染植株體改變細(xì)胞的代謝途徑，使細(xì)胞的正常生理機(jī)能遭到干擾和破壞，影響生長(zhǎng)發(fā)育，致使葉片褪綠、黃化、花葉、皺縮、變小，株型矮小，果實(shí)畸形，產(chǎn)量降低甚至絕產(chǎn)，品質(zhì)變劣，商品性變差甚至失去商品價(jià)值，危害極大。因?yàn)槟壳斑€沒(méi)有藥劑能將植物體內(nèi)病毒殺死，所以病毒一旦侵入植物體內(nèi)很難根除，而馬鈴薯經(jīng)長(zhǎng)期無(wú)性繁殖，病毒長(zhǎng)期積累，可能世代都要帶毒繁育，嚴(yán)重影響了馬鈴薯品種的特性，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。

據(jù)報(bào)道，目前全世界已知的植物病毒種類(lèi)有700多種，中國(guó)統(tǒng)計(jì)有100多種。幾乎所有植物種類(lèi)都有病毒危害，是僅次于真菌病害的主要植物病害。

1.2 馬鈴薯病毒病的危害癥狀

1.2.1 變色

由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被病毒利用，或病毒造成維管束壞死，阻礙了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，葉片的葉綠素形成受阻或積聚，從而產(chǎn)生花葉、斑點(diǎn)、環(huán)斑、脈帶和黃化等；花朵的花青素也可因此改變，使花色變成綠色或雜色等，常見(jiàn)的癥狀為深綠與淺綠相間的花葉癥，如煙草花葉病毒病、馬鈴薯花葉病毒病等。

1.2.2 壞死

植株對(duì)病毒的過(guò)敏性反應(yīng)等導(dǎo)致細(xì)胞或組織死亡，變成枯黃至褐色，有時(shí)出現(xiàn)凹陷。在葉片上常呈現(xiàn)壞死斑、壞死環(huán)和脈壞死，在莖、果實(shí)和根的表面常出現(xiàn)壞死條等。

1.2.3 畸形

由于正常的新陳代謝受到干擾，體內(nèi)生長(zhǎng)素和其他激素的生成及植株正常的生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)生變化，導(dǎo)致器官變形，如莖間縮短，植株矮化，生長(zhǎng)點(diǎn)異常分化形成叢枝或叢簇，葉片的局部細(xì)胞變形而出現(xiàn)皰斑、卷曲、蕨葉及黃化現(xiàn)象。

1.3 馬鈴薯病毒病的傳播方式和途徑

馬鈴薯等無(wú)性繁殖作物經(jīng)長(zhǎng)期的無(wú)性繁殖，病毒在植株體內(nèi)積累。但近些年的研究證明，花粉與種子可傳播瓜類(lèi)及豆類(lèi)植物的病毒，植物病毒除借帶毒的繁殖材料如接穗、鱗莖、塊根、塊莖等傳播外，主要是通過(guò)昆蟲(chóng)、螨類(lèi)及土壤中的真菌、線蟲(chóng)等媒介傳播，稱(chēng)介體傳播。傳毒昆蟲(chóng)以具刺吸式口器者為主，如蚜蟲(chóng)、葉蟬、飛虱、薊馬等，僅少數(shù)具咀嚼式口器。它們?cè)跒楹χ参锏耐瑫r(shí)將病毒從病株傳到健株上。

2 馬鈴薯脫毒技術(shù)

2.1 脫毒原理

植物體內(nèi)病毒主要通過(guò)維管束流動(dòng)，因此未形成維管束的莖尖、根尖生長(zhǎng)點(diǎn)病毒無(wú)法達(dá)到，切除植物的生長(zhǎng)點(diǎn)，離體培養(yǎng)成植株，可獲得脫毒苗，從而獲得脫毒種苗。

2.2 脫毒方法

2.2.1 莖尖剝離脫毒法

莖尖剝離脫毒是根據(jù)莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)還沒(méi)有形成維管束，不含病毒，在高倍解剖鏡下，將莖尖剝離到葉原基，切取0.1～0.3 mm的莖尖，接種到培養(yǎng)基上，培養(yǎng)成脫毒試管苗，再進(jìn)而培育獲得脫毒種苗的過(guò)程（圖1）。

圖1 脫毒苗培育流程

2.2.2 熱處理脫毒法

將植物種植在花盆中，放在35～45 ℃溫度下的光照培養(yǎng)箱內(nèi)處理2～8周，再切取植物莖段作接穗，從而達(dá)到脫毒的目的。

2.2.3 其他脫毒方法

化學(xué)處理脫毒：將帶毒外植體接種在含有抑制病毒復(fù)制的培養(yǎng)基上，經(jīng)長(zhǎng)期培養(yǎng)脫除病毒；愈傷組織培養(yǎng)脫毒：通過(guò)器官和組織的培養(yǎng)，分化誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，愈傷組織再分化產(chǎn)生芽，再長(zhǎng)成小植株，可以得到無(wú)病毒苗。

2.3 脫毒苗檢測(cè)

經(jīng)過(guò)脫毒處理以后，病毒脫除與否，還要對(duì)經(jīng)脫毒苗處理獲得的試管苗進(jìn)行檢測(cè)方能確定，不經(jīng)檢測(cè)無(wú)法確定是否脫毒，脫去什么病毒，也就無(wú)法進(jìn)行應(yīng)用。

脫毒苗的檢測(cè)方法有以下幾種：指示植物法、 酶聯(lián)免疫法（ELISA）、PCR擴(kuò)增與酶聯(lián)免疫相結(jié)合。目前常用的是酶聯(lián)免疫法，快速且成本低，但準(zhǔn)確度較PCR擴(kuò)增法差，當(dāng)植株體內(nèi)病毒含量低到一定程度時(shí)，則檢測(cè)不到病毒的存在。在田間取樣較多且要求不太高，進(jìn)行定性了解時(shí)常采用酶聯(lián)免疫法。相對(duì)準(zhǔn)確的檢測(cè)方法首推PCR擴(kuò)增檢測(cè)法，在病毒含量極低的情況下就能檢測(cè)到病毒；因此，試管苗的檢測(cè)應(yīng)用這種方法較可靠，但成本高，在樣品數(shù)量多時(shí)，可采用此法。

2.4 對(duì)脫毒種苗的認(rèn)識(shí)誤區(qū)

2.4.1 脫毒種苗不發(fā)生病害

有人對(duì)脫毒不了解，以為脫毒后的種苗種在地里不發(fā)生病害，這種認(rèn)識(shí)是片面的，把病毒病和真菌、細(xì)菌性病害混為一體。脫毒只是把種苗體內(nèi)病毒脫除，土壤、環(huán)境中有真菌、細(xì)菌，作物仍可能染病，也可重新感染病毒，再次退化。

2.4.2 脫毒種苗可以長(zhǎng)期應(yīng)用

有些脫毒種苗只能用1年，如玉米等雜交種；有些需要年年換種苗，如脫毒馬鈴薯、草莓；有些作物抗性強(qiáng)，退化慢，可連續(xù)應(yīng)用3～5年，如脫毒甘薯、姜等，但產(chǎn)量會(huì)逐年下降。

3 脫毒苗的組培快繁（工廠化生產(chǎn)）、煉苗、移栽

在生產(chǎn)上，為了提高脫毒率，馬鈴薯脫毒常用熱處理加莖尖剝離脫毒的方式進(jìn)行脫毒。步驟：第一步，高溫處理鈍化病毒。把選擇好的、準(zhǔn)備繁育的馬鈴薯放在35～40 ℃條件下，經(jīng)30 d左右，可降低花葉病毒的濃度，提高脫毒成功率，同時(shí)也進(jìn)行了催芽。第二步，進(jìn)行莖尖組織剝離和接種。在經(jīng)過(guò)高溫處理和催芽的塊莖上取3～4 cm長(zhǎng)的幼芽若干個(gè)，在無(wú)菌室的超凈工作臺(tái)上40倍的解剖鏡下，切取0.1～0.3 mm莖尖，接種到培養(yǎng)基上，培養(yǎng)成試管苗。

經(jīng)過(guò)病毒檢測(cè)已經(jīng)脫除病毒的試管苗稱(chēng)為脫毒苗，以脫毒苗為基礎(chǔ)苗進(jìn)行組培快繁?；A(chǔ)苗達(dá)到3個(gè)莖節(jié)以上可進(jìn)行擴(kuò)繁，將每株苗切為單個(gè)帶莖節(jié)的節(jié)段，轉(zhuǎn)到擴(kuò)繁培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁，組培快繁速度呈幾何倍數(shù)增長(zhǎng)。1株馬鈴薯試管苗20 d后可分為3株，40 d后為9株，60 d后為27株，以此類(lèi)推，只要有足夠的人力和空間，1株苗1年后理論上可繁育3.8億多株。實(shí)際生產(chǎn)上，可根據(jù)生產(chǎn)需要進(jìn)行脫毒苗繁育。脫毒種苗工廠化生產(chǎn)流程：培養(yǎng)基配制→培養(yǎng)基高壓滅菌→擴(kuò)繁→培養(yǎng)室培養(yǎng)→煉苗→移栽。

進(jìn)入生產(chǎn)環(huán)節(jié)前，還需進(jìn)行試管苗的煉苗、移栽。馬鈴薯試管苗室內(nèi)培養(yǎng)的溫濕度相對(duì)穩(wěn)定、光照弱（3 000～5 000 lx），與自然環(huán)境差異大，試管苗直接移栽到自然環(huán)境條件下，成活率低，需要逐步適應(yīng)外界的溫度、光照、濕度，這一過(guò)程稱(chēng)為煉苗。不同品種適應(yīng)性差異不大。煉苗期間需要保溫、保濕和遮陰，溫度控制在10～30 ℃，濕度保持在90%以上，遮陰用遮光率為50%～70%的遮陽(yáng)網(wǎng)覆蓋，光照強(qiáng)度在3萬(wàn)～5萬(wàn)lx。

煉苗過(guò)程首先進(jìn)行室外瓶?jī)?nèi)煉苗7～10 d，然后可移栽到保濕、保溫較好的溫室、網(wǎng)室，移栽后10～15 d可以逐步去掉遮陽(yáng)網(wǎng)并通風(fēng)，適應(yīng)外界環(huán)境，最終達(dá)到與外界環(huán)境條件一致。

4 脫毒良種體系的建立及推廣應(yīng)用

獲得脫毒苗只是第一步，脫毒種苗進(jìn)入應(yīng)用必須建立完善的脫毒良種繁育體系，即需要建立接種、培養(yǎng)基配制、滅菌、病毒檢測(cè)等系列實(shí)驗(yàn)室，生產(chǎn)車(chē)間等脫毒、組培快繁設(shè)施、設(shè)備，隔離條件良好的溫室、網(wǎng)室組成的原原種（苗）繁育基地，隔離條件良好的原種繁育基地，生產(chǎn)種繁育基地及優(yōu)良的種苗質(zhì)量管控體系、儲(chǔ)存設(shè)施等。諸多環(huán)節(jié)構(gòu)成了脫毒種苗良繁體系，缺一不可，否則產(chǎn)品質(zhì)量得不到有效保證。