梨樹(shù)專用肥對(duì)翠冠梨樹(shù)體營(yíng)養(yǎng)水平及土壤微生物群落的影響

施春暉，王曉慶，張靜增，李英麗，金風(fēng)雷，張玉星，駱 軍

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 林果果樹(shù)研究所，上海 201403；2.上海市設(shè)施園藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201403；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071001；4.上海松江區(qū)梨樹(shù)研究所，上海 201699)

中國(guó)是砂梨(PyruspyrifoliaNakai.)的起源中心，同時(shí)也是世界上砂梨資源最豐富的國(guó)家，近10年來(lái)，早熟砂梨在長(zhǎng)江流域及長(zhǎng)江以南地區(qū)快速發(fā)展。砂梨樹(shù)體營(yíng)養(yǎng)狀況是決定果實(shí)優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)的關(guān)鍵。

在傳統(tǒng)砂梨生產(chǎn)中，種植者往往重視樹(shù)體管理多于土壤管理，缺乏精準(zhǔn)施肥的管理意識(shí)。事實(shí)上，根據(jù)具體樹(shù)體的營(yíng)養(yǎng)診斷結(jié)果制定科學(xué)合理的施肥方法才是有效改善樹(shù)體營(yíng)養(yǎng)狀況的最佳途徑[1]。20世紀(jì)70年代果實(shí)營(yíng)養(yǎng)診斷的研究與應(yīng)用起步，隨著營(yíng)養(yǎng)學(xué)科的不斷發(fā)展，學(xué)者們提出了綜合診斷法(Diagnosis and Recommendation Integrated System，DRIS)[2]，我國(guó)開(kāi)展關(guān)于樹(shù)體營(yíng)養(yǎng)診斷的研究雖然起步較晚但發(fā)展迅猛，目前已建立了柑橘[3]、梨[4]、蘋(píng)果[5]、芒果[6]等果樹(shù)樹(shù)種營(yíng)養(yǎng)診斷標(biāo)準(zhǔn)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)需肥次序做出診斷。王國(guó)英等[4]建立了黃冠梨營(yíng)養(yǎng)診斷施肥標(biāo)準(zhǔn)，并提出了有針對(duì)性的優(yōu)質(zhì)配方肥。侯岑[7]建立了適于江蘇、浙江、湖北、四川和福建這5省的翠冠梨葉片礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)診斷標(biāo)準(zhǔn)值。

目前，翠冠梨按需科學(xué)施配方肥方面的研究較少，未能充分發(fā)揮土壤營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)果實(shí)產(chǎn)量及品質(zhì)的提升，也鮮見(jiàn)配方肥對(duì)土壤微生物環(huán)境研究的相關(guān)報(bào)道。本文以翠冠為研究對(duì)象，通過(guò)在果實(shí)發(fā)育期施用梨有機(jī)無(wú)機(jī)專用平衡肥，以常規(guī)施化肥為對(duì)照處理，研究了施肥對(duì)翠冠梨樹(shù)產(chǎn)量及品質(zhì)、土壤及梨葉片中營(yíng)養(yǎng)水平、土壤微生物環(huán)境的影響，以期達(dá)到進(jìn)一步按樹(shù)體需求優(yōu)化專用肥配方的目的，從根本上改變現(xiàn)階段落后的施肥現(xiàn)狀，為提高早熟砂梨果實(shí)品質(zhì)、獲得良好經(jīng)濟(jì)效益提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

施肥試驗(yàn)于2018～2020年在上海市崇明區(qū)廟鎮(zhèn)鴿龍村進(jìn)行，位于東經(jīng)121°39′、北緯31°62′。崇明區(qū)屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫16.5 ℃，年平均降雨量1128.9 mm。果園排水通暢，土壤類型為砂質(zhì)壤土，肥力中等。該地區(qū)是上海市梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)。

1.2 試驗(yàn)材料及設(shè)計(jì)

選園內(nèi)樹(shù)齡為12 a的盛果期翠冠品種為研究對(duì)象，樹(shù)形為三主枝開(kāi)心形，株行距 2.5 m×3.5 m；2018～2020年選擇樹(shù)體管理較為一致的樹(shù)，每年采收前4周進(jìn)行施肥處理，以單株為試驗(yàn)小區(qū)進(jìn)行取樣。選用由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)研制的梨有機(jī)無(wú)機(jī)專用平衡肥(Special balanced fertilizer， SBF)，在采收前4周按每50 kg果施入3 kg肥的量采用溝施方式一次性施入；對(duì)照施用常規(guī)復(fù)合肥(化肥)(Chemical fertilizer，CF)，生長(zhǎng)季坐果后應(yīng)施膨果肥，每株施三元復(fù)合肥(N-P2O5-K2O)0.5 kg；果實(shí)膨大期每株用高鉀硫基復(fù)合肥(N-P2O5-K2O比例為14∶14 ∶30的水溶肥)0.1 kg 沖施。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的采集與處理 連續(xù)兩年，每年6月底采集葉片，7月底到8月初采集果實(shí)測(cè)定品質(zhì)及產(chǎn)量；春季前采集土樣分析土樣營(yíng)養(yǎng)水平及微生物環(huán)境。葉片采集及處理參考王國(guó)英等[4]的方法。

土樣采集及處理：于10月底采土。采取五點(diǎn)交叉取樣法，于樹(shù)冠垂直投影處，用土鉆分別取0～20 cm和20～40 cm土層的土，每個(gè)樣由同一土層的5個(gè)點(diǎn)組成，混合后用四分法留樣2 kg左右。將其中50 g土放入50 mL離心管中，將離心管立即放入裝有干冰的泡沫箱中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室放入-80 ℃冰箱保存，用于土壤微生物測(cè)序分析。每個(gè)樣設(shè)8個(gè)重復(fù)。剩下的土壤放在掛有樣品標(biāo)簽的塑料袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室攤開(kāi)晾干，用榔頭砸碎后過(guò)0.25 mm孔徑的篩，保存于信封中，待測(cè)土壤pH值、EC值以及土壤大量、中量及微量元素。

果實(shí)取樣及處理：在翠冠梨采收期，以單株為單位統(tǒng)計(jì)全樹(shù)的結(jié)果量，統(tǒng)計(jì)單株產(chǎn)量，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。單果重用電子天平稱量，果實(shí)可溶性固形物用手持儀(ATAGO Master-20a，日本)測(cè)定。

1.3.2 樣品測(cè)定 葉片元素測(cè)定參考王國(guó)英等[4]的方法。

土壤營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定參照王曉慶等[8]關(guān)于土壤pH值、電導(dǎo)率(EC)以及土壤中元素測(cè)定方法，其中土壤pH值、電導(dǎo)率(EC)分別利用電極法和電位法，有機(jī)質(zhì)含量利用重鉻酸鉀容量法測(cè)定，堿解氮采用堿解-擴(kuò)散吸收法測(cè)定，有效磷含量采用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法測(cè)定，速效鉀含量利用乙酸銨提取-火焰光度法測(cè)定。

土壤微生物環(huán)境檢測(cè)利用16S rDNA 測(cè)序，具體采用Nossa等的方法[9]。采用 DNA 抽提試劑盒對(duì)土壤樣本的基因組 DNA 進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) DNA 的純度和濃度。以稀釋后的基因組 DNA 為模板，根據(jù)16S V3～V4 區(qū)域，使用帶 barcode 的特異引物343F(5’- TACGGRAGGCAGCAG -3’)和798R(5’- AGGGTATCTAATCCT-3’)，利用Takara Ex Taq高保真酶進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物使用電泳檢測(cè)，檢測(cè)后使用磁珠純化，純化后作為二輪PCR模板，并進(jìn)行二輪PCR擴(kuò)增，并再次使用電泳檢測(cè)，檢測(cè)后使用磁珠純化，純化后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Qubit定量。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，并上機(jī)測(cè)序(Agilent 2100 Bioanalyzer, USA)。下機(jī)后獲得原始數(shù)據(jù)為FASTQ格式。使用Trimmomatic軟件[10]對(duì)原始雙端序列進(jìn)行去雜。同時(shí)，利用UCHIME檢測(cè)并去除序列中的嵌合體序列[11]。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，生成優(yōu)質(zhì)序列之后，采用Vsearch軟件[12]，根據(jù)序列的相似性，將序列歸為多個(gè)OTU。序列相似度大于或等于97%被歸為一個(gè)OTU單元。使用QIIME軟件包[13]挑選出各個(gè)OTU的代表序列，并將所有代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋。16S使用Greengenes或者Silva(version123)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，18S使用Silva(version123)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，物種比對(duì)注釋使用RDP classifier軟件[14]，保留置信區(qū)間大于0.7的注釋結(jié)果。ITS使用Unite數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。物種比對(duì)注釋使用blast軟件[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。數(shù)據(jù)處理采用 Excel 2010 軟件，顯著性分析采用 SPSS 17．0 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 梨專用肥對(duì)果實(shí)品質(zhì)及產(chǎn)量的影響

對(duì)經(jīng)過(guò)3年SBF處理和對(duì)照CF處理的翠冠梨的果實(shí)產(chǎn)量及品質(zhì)進(jìn)行比較，由表1可知，SBF處理和CF處理在前兩年對(duì)果實(shí)單果重的影響不顯著，第3年SBF處理后果實(shí)單果重較CF處理顯著提高了7.9%，平均單果重達(dá)402.65 g。雖然兩種肥料處理對(duì)單株結(jié)果量的影響不顯著，但由于SBF處理顯著增加了單果重，使得SBF處理的產(chǎn)量達(dá)4811.14 kg/667 m2，與CF處理比較提高了23.45%，差異達(dá)極顯著水平。在品質(zhì)方面，與對(duì)照CF處理相比，SBF處理后的第一年即2018年果實(shí)的可溶性固形物含量便有極顯著的提高，提高了0.97個(gè)百分點(diǎn)，平均可溶性固形物含量為12.12%；第2年和第3年SBF處理相比于CF處理，平均可溶性固形物含量分別提高了0.80和0.29個(gè)百分點(diǎn)，差異均達(dá)顯著水平。

2.2 梨專用肥對(duì)樹(shù)體營(yíng)養(yǎng)水平的影響

2020年對(duì)持續(xù)3年進(jìn)行SBF和CF肥料試驗(yàn)處理的梨樹(shù)葉片進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)元素的測(cè)定及分析， 6月底氮元素含量變化較為平穩(wěn)，是測(cè)定氮元素含量的適宜采樣時(shí)期，采集新梢中段成熟功能葉片，經(jīng)測(cè)定后結(jié)果見(jiàn)表2。處理間梨葉片中常量元素N、K、Ca元素的含量存在顯著差異，其中SBF處理葉片中的N元素含量顯著高于CF處理的；SBF處理后葉片中的K元素含量比CF處理顯著下降了0.04個(gè)百分點(diǎn)。處理間梨葉片中微量元素Zn、Fe、Mn、B的含量存在顯著差異，其中SBF處理中Mn和Fe元素含量分別極顯著、顯著高于CF處理的，分別增加了38.91%和8.19%，而B(niǎo)元素則在CF處理的葉片中含量較高。

表2 不同肥料對(duì)梨葉片營(yíng)養(yǎng)元素含量的影響

2.3 梨專用肥對(duì)梨園土壤理化性質(zhì)及土壤養(yǎng)分的影響

通過(guò)對(duì)兩種施肥處理的土壤營(yíng)養(yǎng)水平進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果(圖1)表明，處理間0～20 cm土壤pH值存在顯著差異，SBF處理后的土壤pH值為7.10，CF處理后的土壤pH值為7.42；在20～40 cm土層中SBF處理的土壤pH值也低于CF處理的，但差異不顯著。土壤中性略微偏堿，略高于南方梨pH適宜值5.8～7.0[17]。土壤有機(jī)質(zhì)含量被視為最重要土壤肥力指標(biāo)。0～20 cm土層的土壤有機(jī)質(zhì)含量經(jīng)SBF處理后較對(duì)照CF顯著提高，達(dá)3.05%，較CF土壤有機(jī)質(zhì)含量高8.54%。土壤水解性氮或稱堿解氮(有效氮)能反映土壤近期內(nèi)氮素供應(yīng)情況，包括無(wú)機(jī)態(tài)氮(銨態(tài)氮、硝態(tài)氮)及易水解的有機(jī)態(tài)氮(氨基酸、酰銨和易水解蛋白質(zhì))。在0～20 cm土層中，經(jīng)SBF處理的有效氮含量顯著低于CF處理的，達(dá)11.17%； 在20～40 cm土層中，經(jīng)SBF處理的有效氮含量比CF處理顯著降低28.57%。而20～40 cm土層中經(jīng)SBF處理的土壤有效磷含量較對(duì)照CF處理增高了21.26%。速效鉀含量的差異主要存在于20～40 cm的土層中，其中CF的速效鉀含量是SBF處理的2.39倍。

圖1 不同肥料對(duì)梨園土壤營(yíng)養(yǎng)水平的影響

2.4 梨專用肥對(duì)梨園土壤微生物菌群的影響

2.4.1 梨專用肥處理土壤細(xì)菌屬水平主要物種豐度及多樣性指數(shù) 通過(guò)16S rDNA基因高通量測(cè)序分析結(jié)果(圖2)表明，兩個(gè)施肥處理后土壤樣品的稀釋曲線逐漸趨于平緩，表明取樣合理，測(cè)序片段讀取基本飽和，并且兩個(gè)處理的取樣，具有很強(qiáng)的代表性。由表3可知，兩個(gè)施肥處理的土壤微生物多樣性指數(shù)存在顯著性差異，SBF和CF處理的土壤微生物平均OTU分別為4123和3897，兩者差異顯著。SBF處理的Chao1、ACE參數(shù)顯著高于CF，表明SBF處理土壤的微生物群落多樣性增加。

表3 不同肥料處理的土壤微生物多樣性指數(shù)

2.4.2 梨專用肥處理對(duì)土壤微生物多樣性的影響 根據(jù)土壤處理樣本SBF和CF微生物群落主要物種注釋及豐度數(shù)據(jù)分析，微生物群落在門水平上豐度最高的4個(gè)門分別為變形細(xì)菌(57.64%)、芽孢桿菌(8.73%)、放線菌(8.16%)、酸菌(7.74%)。選取豐度排名前30位的屬進(jìn)行比較(圖3)，在屬水平上(相對(duì)豐度大于1%)，兩個(gè)肥料處理后的土壤優(yōu)勢(shì)菌以 MND1慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、羅河桿菌屬(Rhodanobacter)、擬桿菌屬(Bacteroides)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)為主。SBF處理與CF處理相比，擬桿菌屬(Bacteroides)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、馬杜拉放線菌屬 (Actinomadura)、竹桿菌屬(Chujaibacter)相對(duì)豐度較高，而硝化螺菌(Nitrospira)在CF處理的土壤中相對(duì)豐度較高(圖3)。土壤中Gaiella菌的相對(duì)豐度與土壤有機(jī)質(zhì)、有效氮、有效磷、速效鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與電導(dǎo)率EC值成反比；纖維弧菌屬(Cellvibrio)的相對(duì)豐度與土壤有機(jī)質(zhì)、有效氮、有效磷、速效鉀含量呈顯著正相關(guān)。

圖2 不同肥料處理下對(duì)土壤樣品的16S rRNA稀釋曲線

A：MND1羅丹桿菌擬桿菌；B：羅河桿菌Rhodanobacter；C：硝化螺菌Nitrospira；D：竹桿菌Chujaibacter；E：擬桿菌屬Bacteroides；F：海洋粘細(xì)菌Haliangium；G：馬杜拉放線菌 Actinomadura；H：雙歧桿菌Bifidobacterium；I：mle1-7；J：Subgroup_10；K：鞘氨醇單胞菌Sphingomonas；L：黃類固醇桿菌 Steroidobacter；M：運(yùn)動(dòng)?xùn)|菌Dongia；N：芽孢桿菌 Gemmatimonas；O：黃桿菌Flavobacterium；P：瘤胃球菌Ruminococcus_2；Q：活潑瘤胃球菌[Ruminococcus] _gnavus_group；L：JdFR-76；S：大腸埃希氏菌 Escherichia-Shigella；T：黃色單胞菌 Luteimonas；U：IS-44；V：放線菌Gaiella；W： Chryseolinea；X：Pseudolabrys；Y：不粘柄菌 Pseudolabrys；Z： 嚴(yán)格梭菌 Clostridium_sensu_stricto_1；A1： 生絲微 Hyphomicrobium；B1：分枝桿菌 Mycobacterium；C1：酸桿菌 Acidibacter；D1：地桿菌 Geobacter。

3 討論

梨樹(shù)屬于多年生木本植物，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)診斷技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在各生長(zhǎng)周期梨樹(shù)各部位中的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)表現(xiàn)出不同的需肥特點(diǎn)，花后到果實(shí)成熟生殖生長(zhǎng)階段對(duì)元素的需求量增加，種植者需要根據(jù)需肥規(guī)律通過(guò)追肥為根系輸送礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)。長(zhǎng)期不同的施肥措施會(huì)影響土壤養(yǎng)分水平和土壤微生物群落的多樣性[19]。果樹(shù)專用肥既具備了無(wú)機(jī)肥的快速高效性，也具備了有機(jī)肥的長(zhǎng)效性，能有效提高果實(shí)的產(chǎn)量及品質(zhì)。河北農(nóng)大根據(jù)梨樹(shù)、蘋(píng)果樹(shù)的需肥特點(diǎn)、梨優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)葉片營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)值以及果園營(yíng)養(yǎng)水平研制了富含梨樹(shù)必需營(yíng)養(yǎng)元素及腐殖質(zhì)的平衡專用肥，并且在黃冠上施用專用肥后土壤有機(jī)質(zhì)含量比傳統(tǒng)施入化肥有顯著的提高[1，4]。張超等[19]研究發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果專用肥顯著提高了土壤有機(jī)質(zhì)的含量以及微生物群落功能的多樣性。在本研究中，梨專用平衡肥的施用對(duì)梨園土壤有機(jī)質(zhì)、土壤有效養(yǎng)分及土壤微生物菌群均有不同程度的提高，與上述的研究結(jié)果一致。SBF處理和CF處理后在0～20 cm土層有效氮和速效鉀含量差異不顯著，但其含量在20～40 cm土層化肥CF處理的顯著高于SBF處理的，究其原因可能是化肥短期提高土壤有效養(yǎng)分含量的能力要強(qiáng)于有機(jī)肥，以有機(jī)肥為主的專用肥雖然肥效較為緩慢，但可有效降低土壤酸堿度，抑制土壤鹽堿化，同時(shí)有效提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，平均有機(jī)質(zhì)含量達(dá)3.05%。黃春輝[20-21]等研究表明土壤有機(jī)質(zhì)含量和可溶性固形物含量之間呈正相關(guān)的關(guān)系，有機(jī)質(zhì)為土壤提供植物所需的單糖類、氨基酸和維生素等小分子有機(jī)物，可有效提升果實(shí)的風(fēng)味，是保證果樹(shù)基礎(chǔ)產(chǎn)量及品質(zhì)的關(guān)鍵。

目前，福建、江蘇、浙江制定了高產(chǎn)翠冠梨葉片營(yíng)養(yǎng)診斷標(biāo)準(zhǔn)值[7, 22]，而上海地區(qū)還未見(jiàn)翠冠梨葉片營(yíng)養(yǎng)診斷標(biāo)準(zhǔn)值的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)葉片中氮含量略低于浙江、江蘇兩地的，但經(jīng)過(guò)施用有機(jī)無(wú)機(jī)專用肥后葉片中的氮含量為2.21%，與常規(guī)施化肥的相比有顯著的升高，并且與土壤中的氮含量無(wú)顯著相關(guān)性，該結(jié)果與王曉慶等[9]在同一地區(qū)測(cè)定的翠冠梨葉片氮含量值相近，并且上海不同地區(qū)葉片氮含量值差異明顯，推測(cè)這可能與上海地區(qū)土壤類型差異相關(guān)。SBF處理后的葉片中常量元素Ca、Mg和微量元素Zn、Fe、Mn的含量均比常規(guī)化肥CF處理的高，除Fe元素含量偏低以外，其他元素含量均符合高產(chǎn)園翠冠葉片元素標(biāo)準(zhǔn)，可見(jiàn)梨專用肥基本滿足翠冠梨需肥要求，能較為平衡地為樹(shù)體提供針對(duì)性的營(yíng)養(yǎng)。

果樹(shù)有機(jī)無(wú)機(jī)專用肥不僅改善了土壤理化性質(zhì)和土壤養(yǎng)分，還進(jìn)一步改善了土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)。本研究中SBF專用肥處理顯著提高了果園土壤有機(jī)質(zhì)含量，同時(shí)該處理的土壤微生物OTU、Chao1、Shannon 指數(shù)均高于CF無(wú)機(jī)肥處理的，提高了土壤微生物群落多樣性，這與邵麗[21，23-24]等的研究結(jié)果基本一致。本研究中梨有機(jī)無(wú)機(jī)專用平衡肥處理的土壤中Gaiella菌的相對(duì)豐度下降，Spearman相關(guān)性分析結(jié)果表明Gaiella菌與有效氮含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(表4)。研究表明土壤中硝態(tài)氮N-NO3含量上升的土壤中Gaiella菌群數(shù)量會(huì)降低[25]，這與電導(dǎo)率EC值成反比。梨專用肥料處理中纖維弧菌屬(Cellvibrio)的相對(duì)豐度與土壤有機(jī)質(zhì)、有效氮、有效磷、速效鉀含量呈顯著正相關(guān)，其作為促進(jìn)植物高效腐解的優(yōu)勢(shì)菌，能通過(guò)促進(jìn)土壤中的碳源快速分解而提高土壤的有機(jī)質(zhì)及其他礦物質(zhì)的含量[26]?？傊?，梨有機(jī)無(wú)機(jī)專用肥可以在一定程度上提高梨園土壤的有機(jī)質(zhì)含量，提高土壤中菌群數(shù)量，為有效提高梨樹(shù)果實(shí)產(chǎn)量及品質(zhì)提供均衡的營(yíng)養(yǎng)。

表4 土壤元素與土壤細(xì)菌數(shù)相關(guān)性分析