赭曲霉毒素A的研究進展

張 太， 毛 丹， 王少敏， 周 恒， 劉賢賢， 季 申*1，

(1.上海中醫(yī)藥大學中藥學院，上海 201203；2.上海市食品藥品檢驗所，國家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點實驗室，上海 201203)

1 引言

赭曲霉毒素是赭曲霉屬和幾種青霉屬真菌產(chǎn)生的一種毒素，其中以赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)毒性最大。OTA主要由淡褐曲霉屬、硫磺色曲霉屬、菌核和蜂蜜味曲霉屬等產(chǎn)生。OTA廣泛存在于各種食物中，能夠污染小麥、花生、啤酒等多種產(chǎn)品。研究發(fā)現(xiàn)腎臟是OTA誘導毒性的主要的靶器官，但是急性OTA暴露可以引起肝臟、胃腸道等器官和組織的細胞毒性[1]。同時有研究表明OTA與巴爾干腎病有關[2]。國際癌癥研究機構(IARC)將OTA定位2B類致癌物[3]。本文就有關OTA的污染情況、限量、檢測標準、分析方法和防控脫毒研究進展做一綜述。

2 理化性質(zhì)

OTA相對分子質(zhì)量為403.8。由氯化的異香豆素類似物和苯丙氨酸以酰胺鍵連接而成，是一種白色、無味、熱穩(wěn)定的固體結晶物，水溶性差，可溶于NaHCO3溶液，易溶于醇、酮和氯仿等有機溶劑[4]，其熔點168～173 ℃。將OTA的乙醇溶液儲于冰箱中一年以上也無損失，但應注意避光保存，如接觸紫外線幾天就會分解。在紫外線照射下呈綠色熒光，在苯-冰HAc(體積比99∶1)溶劑中的最大吸收峰為333 nm[4]。OTA的化學結構式見圖1。

圖1 赭曲霉毒素A的化學結構式Fig.1 Chemical structure of ochratoxin A

3 污染情況、限量和檢測標準

3.1 污染情況

表1收集了最近10年我國各地區(qū)農(nóng)作物(或以農(nóng)作物為原料)中OTA的污染情況[5 - 20]。除農(nóng)作物外，中藥也常被OTA污染。甘草是中藥中最常見的一味藥，也是全世界范圍使用最為廣泛的一種中藥。ArioA等[21]檢測30批甘草樣品，檢出OTA污染率高達100%。Thirumala-Devi等[22]檢測25批生姜、25批姜黃和50批胡荽樣品。其中，2批生姜檢出OTA，9批姜黃、20批胡荽受到污染，污染率分別為8%、36%和40%。人參是我國的傳統(tǒng)中藥，歷來被視為百草之王，Trucksess等[23]檢測了10批人參樣品，OTA檢出率為40%，陽性樣品中OTA濃度范圍為0.4～1.8 μg/kg。

表1 我國近10年各地區(qū)農(nóng)作物(或以農(nóng)作物為原料)中OTA的污染情況Table 1 OTA pollution in crops(or crops as raw materials) in recent 10 years in China

曲霉屬產(chǎn)生OTA的條件是中溫、寒冷氣候；青霉屬產(chǎn)生OTA的地區(qū)主要是亞熱帶[4]。Nguyen等[24]檢測了美國144份早餐和零食(原料主要為玉米和燕麥)樣品，污染率為52.08%，受污染早餐中OTA濃度為0.01～7.43 ng/g。Moez等[25]檢測一批咖啡，OTA檢出率高達97.7%。Elaridi等[26]檢測了從摩洛哥五個不同城市的零售面包店購買的100份商業(yè)面包樣品，陽性率為48%，并且有26份樣品超過了當?shù)氐南蘖繕藴?。Kumar等[27]收集了印度北部不同地區(qū)的50份小麥樣品，有29份(58%)小麥樣品中含有1.36～21.17 μg/kg的OTA，其中13份(26%)超過歐盟建議的5 μg/kg限量。

3.2 限量和檢測標準

近年來，隨著對OTA研究的深入，越來越多的國家(地區(qū))和國際組織制定了食品和飼料中OTA的限量。表2總結了中國、國際食品法典委員會(CAC)、歐盟和日本、韓國、中國臺灣和加拿大對OTA限量的最新標準。對于OTA的檢測標準，CAC和歐盟指令規(guī)定，只要經(jīng)過方法學驗證的方法均可以用于執(zhí)法目的，并且規(guī)定了方法必須滿足的最低性能指標[28]。

表2 國內(nèi)外對食品和飼料中OTA的限量Table 2 Limits of OTA in food and feed at home and abroad

表3為我國及我國部分地區(qū)OTA檢測推薦的方法，表4為一些國際機構采納和認可的OTA分析方法。

表3 我國推薦的OTA分析方法Table 3 OTA analysis methods recommended by China

表4 國際機構采納、認可或規(guī)范的OTA分析方法Table 4 OTA analysis methods adopted,recognized or regulated by international organizations

國內(nèi)外對食品中OTA的污染較為重視，建立的標準體系比較完善，對易感染OTA的各種食品也都有明確的限量規(guī)定。但對中藥中OTA的污染情況及限量制訂重視度還不夠。目前，僅歐洲規(guī)定了極少數(shù)藥食同源的中藥(肉豆蔻、干姜、姜黃)和甘草中OTA的限量。真菌毒素的的污染是影響中藥品質(zhì)的主要因素之一，我國是中藥的發(fā)源國，同時又是種植和出口大國，先行制訂中藥中OTA的限定及檢測標準為其他地區(qū)提供參考是必然趨勢。我國即將出版的《中國藥典》(2020年版)規(guī)定了使用液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定中藥材、飲片及中藥制劑中的OTA。雖然并未規(guī)定易感染OTA中藥的限量，但是彌補了中藥中對OTA檢測的空白。

4 分析技術

4.1 前處理

4.1.1 提取OTA為穩(wěn)定的無色晶體化合物，易溶于極性有機溶劑和碳酸氫鈉溶液，微溶于水[4]。目前OTA的提取方法主要有振搖提取、高速均質(zhì)提取、超聲提取和加速溶劑萃取[29]等方法。常用溶劑主要為甲醇、乙腈、磷酸鹽緩沖溶液等。鄭潤生等[30]使用84%乙腈浸泡10種中藥材和3種食品樣品20 min后，渦旋振搖10 min提取，離心，取上清液用甲醇復溶(稀釋4倍)，未經(jīng)過凈化直接上樣檢測10種中藥材和3種食品中OTA污染情況，回收率為84.2%～100.0%。劉海波等[31]比較0.1 moL/L正磷酸∶甲醇∶水(1∶10∶4)、0.1 moL/L正磷酸∶甲醇(1∶10)、甲醇∶水(4∶1)、2%NaHCO3∶1%NaCl(1∶1)4種不同的溶劑對寧夏枸杞中OTA的提取效率，發(fā)現(xiàn)4種方法中0.1 moL/L正磷酸∶甲醇(1∶10)提取最為可靠。鄭榮等[32]比較了不同的溶劑、時間和方法對薏苡仁等9種中藥中OTA的提取效果，最終確定80%甲醇勻漿2 min 為最佳提取方法。Rupesh等[33]評估了可可豆中提取OTA的4種方法，最終確定了使用1%的NaHCO3溶液振搖提取，使用免疫親和柱凈化，加標回收率為86.5%。傅武勝等[34]使用多種方法聯(lián)合提取藥食兩用類食品中OTA，樣品中加入1 g NaCl和80%甲醇20 mL，渦旋5 s，超聲30 min，再以300 r/min的速度振蕩30 min，平均回收率在81．8%～107%之間。

4.1.2 凈化OTA的凈化目前主要有液-液萃取、固相萃取、免疫親和柱凈化法和基質(zhì)固相分散技術等。陳東等[35]使用5%氨水調(diào)至pH=9.0，MAX固相萃取小柱富集的方法對葡萄酒進行前處理。方法的平均回收率為88.6%～108.0%，相對標準偏差為2.1%～9.2%。Karami-Osboo等[36]對葡萄干中OTA進行檢測，比較了液-液萃取和免疫親和柱凈化兩種方法，發(fā)現(xiàn)兩種方法都有良好的效果，最終選擇液-液萃取法對葡萄干中OTA凈化。QuEChERs方法是近年來發(fā)展起來的一種用于農(nóng)產(chǎn)品檢測的快速樣品前處理技術。Fernandes等[37]使用改良的QuEChERs方法提取凈化葡萄酒中的OTA，用乙腈和無水MgSO4∶NaCl∶二水合檸檬酸三鈉∶檸檬酸氫二鈉(4∶1∶1∶0.5)對樣品進行提取和分離。然后，使用分散固相萃取技術進一步提取和除雜。方法回收率為87.2%～102.6%，相對標準偏差均小于9%。

OTA的污染大多處于ppb級甚至更低的水平，且大多數(shù)基質(zhì)復雜，干擾因素多，不利于檢測。樣品前處理的優(yōu)劣很大程度影響檢測結果的準確性。提取和凈化是前處理的兩個重要步驟，根據(jù)不同的基質(zhì)選擇合適的提取凈化方法是保證檢測結果的準確性的必要前提。

4.2 檢測

4.2.1 薄層色譜薄層色譜法(TLC)是經(jīng)典的分離方法，目前仍然是很多發(fā)展中國家的常規(guī)檢測方法。但該方法操作復雜、重現(xiàn)性和靈敏度低，已逐漸被高效液相色譜法替代。Santos等[38]使用TLC對生咖啡中OTA進行定性和定量，結合IAC凈化步驟，方法的檢測限為0.5 mg/kg，具有較高的靈敏度和分辨率。

4.2.2 液相色譜及液-質(zhì)聯(lián)用技術高效液相色譜法(HPLC)及液-質(zhì)聯(lián)用技術靈敏度高,重現(xiàn)性好,溶劑用量少,能夠準確的對OTA進行定量分析。HPLC是國際化學家聯(lián)合會(AOAC)推薦檢測咖啡、大麥和葡萄酒中OTA的方法。劉文紅等[39]采用HPLC檢測葡萄酒中OTA含量，OTA的回收率提高到88.6%～96.0%，相對標準偏差為0.59%～0.74%。Zhu等[40]采用HPLC測定40種濃香型白酒，30種淡香型白酒和6種醬油香型原液。加標樣品的回收率在81.6%～100.8%之間，檢測限和定量限分別為0.006、0.02 μg/L。Wu等[41]在中國東北地區(qū)隨機收集了110種商業(yè)食品樣品，包括面包、燕麥、大麥、玉米、玉米、小麥、葡萄、可溶性咖啡、大豆、紅酒和嬰兒食品。采用HPLC-熒光檢測(FD)分析，并且使用液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)聯(lián)用技術進行確認,OTA的平均回收率范圍為78.3～103.3%，相對標準偏差為2.1%～4.3%。Campone等[42]通過優(yōu)化主要參數(shù)，開發(fā)了自動在線SPE-HPLC-MS/MS方法，能夠靈敏、可靠地定量葡萄酒樣品中的OTA，該方法在不到20 min內(nèi)完成對OTA的準確測定，可作為傳統(tǒng)IAC方法的有效替代方法。

真菌毒素污染大多是交叉污染，一種毒素可以污染多種食物，一種食物常常被多種毒素污染。液相色譜法及液-質(zhì)聯(lián)用技術檢測多種毒素應用較為廣泛，相對于其他方法節(jié)省時間，方便快捷。Zhang等[43]利用LC-MS/MS技術同時測量29地龍批中多種真菌毒素，檢測限為0.05～1 000 μg/kg。黃曉靜[44]建立了75種真菌毒素的快速、靈敏、高通量的超高效液相色譜-四極桿飛行時間-質(zhì)譜(UHPLC-Q-TOF MS)初篩方法，并成功將其運用在了30批甘草、30批白花蛇舌草及20批瓜蔞皮樣品的多真菌毒素初篩中，并對低分辨質(zhì)譜中的某些樣品的陽性檢出進行確證。

隨著色譜技術的發(fā)展，液相色譜及其聯(lián)用技術在OTA的檢測中運用越來越廣泛。尤其是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術不僅可以對其他檢測方法進行結果驗證，并且靈敏度更高。隨著該技術的逐漸普及，將會成為未來檢測技術的趨勢和首選方法。

4.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)具有靈敏度高、特異性強的特點，適宜大批樣品同時檢測。利用酶標記的OTA與樣品中的OTA競爭性與抗體進行鍵合反應，利用分光光度法測定，樣品中OTA的濃度與吸光度成反比關系[4]。Pei等[45]采用ELISA法測定水稻、玉米、小麥和白葡萄酒樣品中OTA，并與超高效液相色譜-熒光檢測法(UPLC-FLD)對比，證明該方法有良好的重現(xiàn)性且可靠性高。Sun等[46]建立了ELISA法篩選谷物中OTA。發(fā)現(xiàn)該方法具有快速、一次檢測時間不超過20 min、樣品提取和凈化過程簡單、快速、成本低、無需儀器即可對檢測結果進行直觀評價等優(yōu)點，適用于食品的常規(guī)定性分析。ELISA法可作為谷物樣品OTA現(xiàn)場快速篩選的有效工具。ELISA特異性強、分析時間短、前處理簡單，適合現(xiàn)場快速篩查。

4.2.4 基于核酸適配體的檢測方法核酸適配體可與靶分子高親和力、高特異性結合。目前主要有熒光適配體傳感器、比色適配體傳感器和化學發(fā)光適配體傳感器。Lv等[47]利用核酸適配體對1%紅酒緩沖溶液中添加一系列OTA濃度的測定，驗證了其可行性，熒光強度與OTA濃度的對數(shù)呈良好的線性關系。劉繼紅等[48]通過體外指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(SELEX)篩選，獲得了OTA的特異性核酸適配體，親和力較高,特異性好,與OTA結構相似性化合物如赭曲霉毒素B、N-乙酰苯丙氨酸或華法林不結合或結合力非常弱。呂蕾等[49]以OTA適配體作為識別分子熒光素發(fā)射的熒光作為檢測信號、納米金作為熒光猝滅劑，利用熒光法檢測OTA的含量，檢測限達到10 nmol/mL。Wang等[50]建立了OTA的檢測方法?；パaDNA共軛氮摻雜石墨烯量子點(NGQDs-cDNA)作為熒光探針，功能化磁性納米材料Fe3O4-適配體作為猝滅劑和分離介質(zhì)，同時利用磁分離技術，去除了未結合適配體。方法檢出限為0.66 nmol/L，可用于快速測定小麥和玉米中OTA殘留。

5 防控和脫毒

5.1 防控

目前，對OTA的防控手段主要為物理、化學和生物防控。物理防控是利用輻射、熱、光等物理手段抑制毒素生長和合成。Oueslati等[51]研究了三種交替溫度循環(huán)(20/30 ℃、20/37 ℃和25/42 ℃)和光周期對OTA產(chǎn)生的影響，結果表明不同溫度條件對菌絲生長和OTA產(chǎn)量均有顯著影響?；瘜W防控是利用化學試劑殺滅真菌，但由于化學試劑大多為有毒有害物質(zhì)，所以應用較少。目前，有研究人員發(fā)現(xiàn)植物精油可以干擾OTA的合成[52]，有較好的應用前景。生物防控是利用不產(chǎn)毒真菌對抗產(chǎn)毒真菌，降低產(chǎn)毒真菌種群密度的從而減少OTA的污染。趙琳等[53]對27種植物乳桿菌對液體培養(yǎng)基內(nèi)OTA的清除能力、清除途徑、影響因素進行研究。發(fā)現(xiàn)有些植物乳桿菌能夠有效地吸附培養(yǎng)基中OTA。Cebrián等[54]利用不產(chǎn)毒真菌和酵母共同對抗火腿中產(chǎn)生OTA的青霉，顯著降低了火腿中OTA的含量。彭青枝等[55]研究了紫外照射處理、溫度處理和殺菌劑處理(抑霉唑、多菌靈和咪鮮胺)對果蔬采后OTA產(chǎn)生量的影響。實驗結果表明：OTA產(chǎn)生量隨著紫外照射時間延長呈先增加后減少；4 ℃下可以完全抑制生長和OTA的產(chǎn)生，25 ℃時其生長量和毒素產(chǎn)生量最多；多菌靈0.12 μg/mL，抑霉唑和咪鮮胺0.06 μg/mL會刺激炭黑曲霉產(chǎn)生大量的OTA。

5.2 脫毒

對于已被污染的食物可采用脫毒的方法來減少OTA的污染。遲蕾等[56]比較不同劑量γ射線輻照處理的OTA的降解率。結果表明，玉米中OTA經(jīng)過輻照后含量明顯降低，在10 kGy的輻照劑量下，降解率可達50%。羅小虎等[57]使用臭氧和電束輻照降解OTA，比較了不同濃度的臭氧和不同處理時間、不同輻照劑量的電子束輻照對OTA的降解率，實驗結果表明50 mg/L的臭氧處理30 s，以及12 kGy劑量電子束輻照對OTA的降解效果最佳。熊科等[58]將黑曲霉M00988菌株中具有降解OTA能力的關鍵羧肽酶cp基因進行克隆，并原核重組表達該酶。解決了天然酶酶量低且不易純化的缺點，為羧肽酶降解OTA在工業(yè)上的固定化應用奠定了基礎。Calado等[59]測定γ射線對不同基質(zhì)中OTA降解的情況，發(fā)現(xiàn)OTA對水溶液中的輻射非常敏感，但對其干燥形式和食品基質(zhì)具有抗性。為后續(xù)研究OTA降解提供了依據(jù)。

6 結語

OTA具有高毒性，在食品及中藥中污染范圍廣，各國已陸續(xù)規(guī)定了食品和飼料中OTA的限量和檢測標準，但對中藥中OTA的限量和檢測規(guī)定不夠完善。為保證安全地使用中藥，建議可參照食品中限量和檢測標準，制訂相關法定標準。隨著研究的深入，對OTA的檢測方法也越來越多，由早期的薄層色譜法到現(xiàn)在的液相色譜、免疫測定等方法發(fā)展都較為迅速，在對OTA檢測時，應根據(jù)不同的需求和目的選擇合適的方法。OTA的防控和脫毒一直是熱點，同時也是難點。其中防控主要以化學方法為主，但由于化學試劑有毒、污染環(huán)境、破壞生態(tài)，其使用一直受到限制。生物防控的研究為OTA的防控提供了新思路，其具有環(huán)保、無殘留、效果好等優(yōu)點，具有較好的發(fā)展前景。