復(fù)合納米粒子修飾的柔性分子印跡傳感器對(duì)四環(huán)素的檢測(cè)研究

郭宣利， 王 玉， 王文廉*

(1.中北大學(xué)儀器科學(xué)與動(dòng)態(tài)測(cè)試教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原 030051；2.中北大學(xué)電子測(cè)試技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原 030051)

四環(huán)素(Tetracycline,TC)因?yàn)閮r(jià)格低且有較強(qiáng)的抗菌能力，被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖以及感染性疾病的預(yù)防和治療[1]。然而，過(guò)量添加四環(huán)素類藥物會(huì)造成其在肉類、牛奶、蜂蜜等動(dòng)物源性食品中較高殘留，嚴(yán)重影響人體骨骼和牙齒[2]發(fā)育，對(duì)腎臟也有損傷[3]。世界衛(wèi)生組織和歐盟規(guī)定牛奶中四環(huán)素最大殘留限量(MRL)為100 mg/L。所以建立一種可以快速便捷的測(cè)量食品、藥物中的四環(huán)素含量的方法具有重要意義。目前四環(huán)素的檢測(cè)主要有分光光度法[4]、高效液相色譜法[5]、化學(xué)發(fā)光法[6]、微生物法[7]、免疫法[8]和毛細(xì)電泳法[9]等方法。

分子印跡技術(shù)(Molecular Imprinting,MIT) 對(duì)特定目標(biāo)分子具有選擇特異性，在分子識(shí)別、固相萃取、色譜分離等方面得到廣泛應(yīng)用。金屬納米顆粒,諸如Au、Pt、Ag、Cu、Ni已經(jīng)成為最熱門(mén)的增加電化學(xué)活性的電催化劑[10]。Au納米粒子(Au NPs)的比表面積大，用它作為增敏材料可有效提高電化學(xué)傳感器的靈敏度、生物相容性[11]以及穩(wěn)定性。Cu納米粒子(Cu NPs)對(duì)一些生物分子具有很好的催化氧化[12]性能。Garaj等研究表明，合金納米粒子展現(xiàn)出多功能性和良好的協(xié)同性,它們?cè)诨A(chǔ)研究和應(yīng)用上比相對(duì)應(yīng)的單一的金屬更具優(yōu)勢(shì)[13]。近些年柔性可穿戴器件發(fā)展迅速，人們對(duì)于柔性電極的需求更加迫切。碳布(Carbon Cloth,CC)是制作柔性電極中最具有吸引力的材料之一[14]，它導(dǎo)電性良好，比表面積大，熱穩(wěn)定性高，而且柔韌性好，耐磨，價(jià)格低。

本文用H2SO4作為活化劑活化碳布，使其更加柔軟且性能穩(wěn)定。在碳布表面修飾Au-Cu NPs復(fù)合納米粒子作為工作電極測(cè)量四環(huán)素，與傳統(tǒng)玻碳電極相比電流響應(yīng)顯著增強(qiáng)，同時(shí)抗干擾性和重復(fù)性良好，可用于牛奶中四環(huán)素的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI600E電化學(xué)分析儀(上海辰華有限公司)；KQ-500DE超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司)；DHG-9013A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；BSA224S-CW電子天平(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；TG16-WS(磁力攪拌器上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；SU-8010型掃描電子顯微鏡(日本，JEOL公司)。

四環(huán)素、卡那霉素、氯霉素、土霉素均購(gòu)于百靈威試劑有限公司；鄰苯二胺購(gòu)于Adamas(上海)有限公司；HAuCl4購(gòu)于北京化學(xué)試劑有限公司；CuSO4、K3[Fe(CN)6]、H2SO4、KCl、甲醇、無(wú)水乙醇購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 柔性分子印跡傳感器的制備

1.2.1 碳布的活化將碳布裁剪成1 cm×2 cm，用去離子水沖洗干凈。將洗干凈的碳布依次在丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水中各超聲清洗15 min，然后放入H2SO4∶HNO3(體積比1∶3)混酸中浸泡過(guò)夜，次日取出用大量去離子水沖洗后，用碳布作為工作電極，在三電極體系下，將電極置于2 mol/L的H2SO4中，用循壞伏安法(CV)在0～2 V電位范圍內(nèi)，以20 mV/s的掃速掃描20圈，取出用去離子水沖洗干凈得到酸化碳布(ACC)。

將酸化碳布放入烘箱干燥后，為了控制有效工作面積，在碳布1 cm×1 cm范圍上方涂覆一圈指甲油，然后用醫(yī)用膠帶包裹住。將電極在磷酸鹽緩沖溶液(PBS,0.01 mol/L)中循壞伏安掃描，直到曲線穩(wěn)定后，活化電極制備成功，放置備用。

1.2.2 分子印跡傳感器的制備將碳布、Ag/AgCl電極、鉑網(wǎng)電極三電極浸入50 mmol/L H2SO4和20 mmol/L苯胺的混合溶液中，然后以25 mV/s的掃描速度進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃描結(jié)束取出聚苯胺(PAIN)/CC電極，去離子水洗滌，60 ℃下干燥備用。將制備好的PANI/CC電極浸入含有10 mmol/L HAuCl4、1 mol/L H2SO4和5 mmol/L CuSO4混合溶液中，然后通氮?dú)獗４?0 min，再在-0.6 mA/cm2的電流密度下聚合900 s，聚合過(guò)程中用磁子不斷攪拌。聚合結(jié)束取出電極，用大量去離子水沖洗，60 ℃下干燥，得到Cu-Au NPs/PANI/CC修飾電極。

以0.01 mol/L PBS配制含1 mmol/L四環(huán)素、5 mmol/L鄰苯二胺的混合溶液。將Cu-Au NPs/PANI/CC放在混合溶液中，利用循環(huán)伏安法在0～0.8 V的電位下，以50 mV/s的掃速，掃描40圈(期間對(duì)混合溶液進(jìn)行緩慢的磁力攪拌)。將電聚合后的電極放在甲醇∶乙酸(體積比9∶1)洗脫液中洗脫10 min，除去模板分子四環(huán)素，即可得到四環(huán)素分子印跡電極(Au-Cu NPs/PANI/TC/CC)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

配制20 mL含有不同濃度四環(huán)素的0.1 mol/L PBS，將Au-Cu NPs/PANI/TC/CC修飾電極在配制好的溶液中孵育10 min后，在0.01 mol/L PBS中，利用差分伏安法(DPV)在0～0.6 V電位下掃描，記錄不同濃度四環(huán)素所對(duì)應(yīng)的DPV峰值電流。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米材料的表征

2.1.1 納米材料的掃描電鏡表征使用掃描電鏡(SEM)表征柔性傳感器的形貌。圖1A為未修飾碳布的SEM圖，從圖中可以看出碳布的管狀結(jié)構(gòu)。圖1B為修飾過(guò)納米復(fù)合粒子的碳布傳感器SEM圖，可以看出，碳布的管狀結(jié)構(gòu)上附著了納米級(jí)的顆粒結(jié)構(gòu)，說(shuō)明納米材料修飾成功，即Cu-Au NPs/PANI/CC傳感器制備成功。

圖1 修飾納米復(fù)合材料前(A)后(B)的碳布掃描電鏡(SEM)圖Fig.1 SEM images of carbon cloth before(A) and after(B) modification with nanocomposite

2.1.2 納米材料的電化學(xué)特性為了檢測(cè)活性材料的電催化能力，在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]溶液和0.1 mol/L KCl溶液中，分別對(duì)裸碳布和Cu-Au NPs/PANI/CC修飾電極進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)試，掃描速度為50 mV/s。結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，未修飾納米復(fù)合材料的碳布電極的電流響應(yīng)明顯低于修飾納米復(fù)合材料后的碳布電極，說(shuō)明納米復(fù)合材料對(duì)碳布電極有明顯的電催化作用。

圖2 在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl溶液中碳布電極鍍材料前(a)和后(b)的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammograms of carbon cloth electrodes before(a) and after(b) plating materials in 5 mmol/L K3[Fe(CN)6] and 0.1 mol/L KCl solutions

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1 碳布活化溶液分別用H2SO4和KOH溶液對(duì)碳布進(jìn)行改性，比較后選擇出較好的活化方式。堿性活化在1 mol/L的KOH溶液中用陽(yáng)極極化法在2.0 V 的電位下掃描200 s，其他步驟同酸化碳布的處理進(jìn)行制備。比較堿化碳布、酸化碳布的電化學(xué)響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)酸化碳布的響應(yīng)電流更大。所以本文采用酸化法對(duì)碳布進(jìn)行活化。

2.2.2 沉積電流與時(shí)間采用DPV法研究沉積電流和沉積時(shí)間的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在沉積電流-0.8～-0.6 mA范圍內(nèi)，峰值電流增大，而沉積電流大于-0.6 mA，峰值電流開(kāi)始減小。當(dāng)沉積時(shí)間在600～900 s時(shí)，峰值電流增大，繼續(xù)沉積，峰值電流減小。因此，當(dāng)沉積電流為-0.6 mA，沉積時(shí)間為900 s時(shí)，響應(yīng)電流達(dá)到最大值。

2.2.3 電聚合圈數(shù)在電聚合時(shí)可以通過(guò)控制聚合圈數(shù)來(lái)控制分子印跡膜的厚度。利用DPV法記錄其峰值實(shí)驗(yàn)表明電聚合10～40圈時(shí)，峰值電流逐漸變大，電聚合40圈時(shí)峰值電流達(dá)到最大，當(dāng)電聚合圈數(shù)大于40圈，峰值電流開(kāi)始減小。

2.2.4 洗脫時(shí)間將電極浸泡到甲醇∶乙酸(體積比9∶1)溶液中進(jìn)行洗脫實(shí)驗(yàn)，利用DPV法記錄洗脫不同時(shí)間后，碳布電極在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl溶液中的電流響應(yīng)。結(jié)果表明，當(dāng)洗脫時(shí)間為10 min時(shí)，電流響應(yīng)增大，當(dāng)洗脫時(shí)間大于10 min時(shí)，電流響應(yīng)開(kāi)始減小。實(shí)驗(yàn)選擇最佳洗脫的時(shí)間為10 min 。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，將Cu-Au NPs/PANI/TC/CC修飾電極置于不同濃度四環(huán)素溶液中孵育10 min后，放入PBS(0.01 mol/L)中進(jìn)行DPV掃描，記錄不同濃度四環(huán)素分子印跡傳感器在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl溶液中的峰值電流，結(jié)果如圖3所示。隨著四環(huán)素濃度增大，響應(yīng)電流逐漸減小，在濃度1.0×10-7～3.0×10-5mol/L范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系，線性方程為：IP=-0.5752lgc+3.6307(IP:10-3A,c:mol/L)，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9996。信噪比為3時(shí)，檢出限為2.57×10-11mol/L。

圖3 不同濃度的四環(huán)素在0.01 mol/L PBS中的DPV曲線以及線性擬合圖Fig.3 DPV curve and linear fitting diagram of different concentrations TC in 0.01 mol/L PBS

2.4 抗干擾性和重復(fù)性

由于土霉素(OTC)、卡那霉素(KA)、氯霉素(CAP)和四環(huán)素(TC)結(jié)構(gòu)相似，因此在四環(huán)素溶液中分別加入100倍濃度的上述物質(zhì)，利用DPV法觀察其電流響應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖中可以看出，加入其它物質(zhì)對(duì)電流響應(yīng)影響很小，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<3.5%,說(shuō)明抗干擾性良好。

圖4 四環(huán)素和不同干擾物混合溶液的DPV曲線(A)以及峰值電流大小柱狀圖(B)Fig.4 DPV curve of mixed solutions of TC and different interference substances(A) and histogram of peak current(B)

將制備的分子印跡傳感器連續(xù)5 d利用DPV法測(cè)定相同濃度的四環(huán)素，DPV的峰值電流分別為0.963、0.954、0.961、0.966、0.949，測(cè)定結(jié)果的RSD<3%，說(shuō)明傳感器的重復(fù)性良好。

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

取10 mL牛奶(購(gòu)于超市某品牌)與10 mL無(wú)水乙醇混合后，超聲處理20 min，將混合物離心10 min后，過(guò)濾，收集濾液，放在冰箱中(4 ℃)備用。

將分子印跡柔性電極置于含樣品的PSB(0.1 mol/L,pH=7.0)中，測(cè)定四環(huán)素的電流響應(yīng)值。采用相同的辦法制備加標(biāo)樣品溶液(牛奶加標(biāo)濃度為0.02、0.04、0.06 μmol/L)進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果在牛奶樣品中并未檢測(cè)出四環(huán)素，3個(gè)不同濃度下四環(huán)素的回收率為97.3%～105%，RSD為2.1%～4.7%。

3 小結(jié)

本文用酸化碳布構(gòu)建了復(fù)合納米粒子分子印跡傳感器，用于對(duì)四環(huán)素的檢測(cè)研究。酸化碳布電極更加穩(wěn)定柔軟，比玻碳電極電流響應(yīng)更大，納米合金的修飾使碳布電極有更好的電催化特性。四環(huán)素的濃度在1.0×10-7～3.0×10-5mol/L范圍內(nèi)與DPV峰電流成良好的線性關(guān)系，檢出限為2.57×10-11mol/L。該傳感器成本低廉，制作簡(jiǎn)單，柔軟穩(wěn)定，靈敏度高，可用于實(shí)際樣品中的四環(huán)素檢測(cè)。