氣相色譜-質譜法分析乳腺癌大鼠尿液中的代謝物

方夢嬋, 鄢愛平, 萬益群*,

(1.南昌大學化學學院，江西南昌 330031；2.南昌大學分析測試中心，江西南昌 330031)

乳腺癌是女性最常見的腫瘤，是導致女性癌癥死亡的主要原因之一[1 - 3]。早期乳腺癌的治愈率可達90%，然而大多數(shù)乳腺癌在發(fā)現(xiàn)之時已到中、晚期[4]，導致治愈率下降。目前最普及的乳腺癌篩查和確診方法主要有X-射線檢查、組織病理學以及血液檢查。這些方法對乳腺癌的中、晚期診斷有較好的準確性，但對早期乳腺癌的診斷缺乏特異性和靈敏度[5]。因此，尋找乳腺癌早期診斷新方法，對有效提高乳腺癌患者的治愈率意義重大。

腫瘤標志物能夠較好地反映癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程，且具有簡便、客觀和便于連續(xù)動態(tài)觀測等優(yōu)勢，對于腫瘤的臨床診斷和治療具有較好的輔助作用。近年來，國內外學者通過代謝組學技術對乳腺癌患者的血清、尿液、組織等樣本中的小分子代謝物進行了研究，并取得一定的成效[6 - 9]。Porto-figueira等[10]研究了乳腺癌 (BC)和結腸癌(CC)患者以及健康個體的尿液排泄生物特征。Yu等[11]應用毛細管電泳聯(lián)合質譜方法，分析了晚期乳腺癌患者和健康人的尿液樣本，發(fā)現(xiàn)與健康人相比，在對化療敏感的患者中，化療后半胱氨酸、甘氨酸、組氨酸和色氨酸水平顯著下降，而對化療不敏感的患者，大部分氨基酸均未顯現(xiàn)明顯差異。目前，關于乳腺癌腫瘤標志物篩查研究的樣本大多來自中、晚期[12]，且樣本的可控性差，有可能導致分析結果也會產生一定差異。基于此，本文通過構建大鼠乳腺癌模型，以獲得可控的尿液樣本，應用氣相色譜-質譜聯(lián)用技術，建立了大鼠尿液代謝指紋圖譜，并用隨機森林(RF)算法對實驗數(shù)據進行了分析[13,14]，對乳腺癌標志物的篩查進行了有益的探索。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 5977A/7890B氣相色譜-質譜儀(美國，安捷倫公司)；AR124CN電子天平(奧豪斯儀器有限公司)；TG20.5臺式高速離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；IKA MS3型迷你振蕩器(艾卡廣州儀器設備(中國)有限公司)；MD200-2型氮吹儀(杭州奧盛儀器有限公司)。

N,O-雙甲氧基三氟乙酰胺(BSTFA)+1%三甲基氯硅烷(TMCS)(美國Sigma公司)；甲氧胺鹽酸鹽(美國Sigma公司)；脲酶(分析純，美國Sigma公司)；吡啶(無水級，99.8%，美國Aladdin公司)；甲醇、乙腈、丙酮、正庚烷(色譜純,國藥集團化學試劑有限公司)；正二十二烷(美國Aladdin公司)；7,12-二甲基苯并[a]蒽(Sigma，D3254-1G)。實驗用水由MILLI-QS超純水器(美國Millipore公司)制備。

1.2 大鼠乳腺癌模型構建

SD雌性大鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，重量為150～160 g(5周齡)(合格證編號：43004700033214)。將大鼠隨機分為兩組，對照組為20只，模型組為50只。適應一周后，乳腺癌誘導模型組大鼠給予一次性灌胃7,12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)玉米油溶液，劑量為80 mg/kg，正常對照組大鼠灌胃等體積玉米油。常規(guī)飼養(yǎng)，觀察大鼠成瘤情況，并做記錄，同時進行組織病理學分析。

1.3 組織學分析

DMBA誘導16周后，統(tǒng)計成瘤率。大鼠斷頸處死，仰臥位固定在解剖板上，用剃毛器剃除腹部和胸部體毛，觀察成瘤數(shù)量、位置和大小，剪開瘤體皮膚，摘下瘤體，用生理鹽水沖洗瘤體，并用4%多聚甲醛固定，用于HE染色。另外，打開成瘤大鼠胸腔，暴露肺臟，觀察肺臟有無明顯轉移病灶，并剪取部分肺臟用4%多聚甲醛固定，做HE染色。未成瘤大鼠則每只取第2對和第4對單側乳房，4%多聚甲醛固定，用于HE染色。正常對照組隨機取3只大鼠取第2對和第4對單側乳房，4%多聚甲醛固定，用于HE染色。將固定的標本包埋在石蠟中，每只制備4～5 μm厚的水平切片，進行常規(guī)蘇木精和伊紅染色。然后由相同的病理學家使用普通白光通過光學顯微鏡檢測準備的病理切片。根據組織病理學分析結果，至第十六周時，DMBA誘導成瘤大鼠共計33只，未成瘤大鼠17只。

1.4 樣品采集及前處理

每周用代謝籠收集對照組和模型組大鼠24 h尿液一次。尿液樣品以14 000 r/min的速度離心10 min,去除蛋白質。取50 μL上清液于1.5 mL離心管中，加入20 μL尿酶溶液(80 mg/mL),混合均勻，然后在37 ℃ 條件下加熱15 min分解尿樣中的尿素。加入180 μL甲醇∶乙腈=2∶1(V/V)混合溶液，渦旋1 min， 14 000 r/min離心10 min。取上清液150 μL，在溫和的氮氣流下蒸發(fā)至近干，然后加入50 μL甲氧胺吡啶溶液(20 mg/mL)，于60 ℃反應1 h。冷卻至室溫，加入100 μL BSTFA+TMCS(99∶1,V/V)，60 ℃反應1 h后，再加入450 μL正庚烷(含0.05 g/L二十二烷內標)終止反應。衍生化完成后進行氣相色譜-質譜分析。

1.5 氣相色譜條件

HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度：250 ℃；升溫程序：70 ℃保持4 min，以6 ℃/min升至150 ℃，以4 ℃/min升至190 ℃，再以9 ℃/min升至250 ℃，最后以5 ℃/min升至280 ℃，保持5 min；載氣：高純氦氣，流速為1.0 mL/min；進樣量1.0 μL；分流進樣：分流比為 2∶1。

1.6 質譜條件

電離方式：電子轟擊離子源(EI)；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；采集方式：全掃描m/z35～800；溶劑延遲5.8 min。

2 結果與討論

2.1 尿液樣品前處理方法的優(yōu)化

大鼠尿液成分較為復雜，其中的內源性代謝物種類多，極性差異大，濃度范圍廣。為了獲得更多內源性代謝物的信息，實驗分別考察了有機溶劑甲醇、乙腈和丙酮對尿液樣品中內源性代謝物的提取效率。結果表明，甲醇和乙腈的混合溶劑性能優(yōu)于其他溶劑。本實驗選擇甲醇∶乙腈=2∶1(V/V)混合溶劑作為尿液樣品的提取溶劑。

尿液樣品中尿素含量高，若不加處理，在進行色譜分析時，會影響其他化合物的分析。本實驗采用脲酶對尿素進行分解，并對脲酶用量、分解溫度和分解時間等條件進行了優(yōu)化。最終選用在50 μL尿液樣品中加入20 μL脲酶溶液(80 mg/mL)，在37 ℃下反應15 min，尿素分解效果最佳。

2.2 色譜分離條件的優(yōu)化

為了使尿樣中的內源性代謝物達到較好的分離效果，實驗分別考察了下列4種升溫程序下物質的分離效果：(1) 80 ℃保持5 min，15 ℃/min升溫到300 ℃保持10 min；(2) 100 ℃保持3 min，以8 ℃/min升溫到280 ℃保持2 min；(3) 70 ℃保持4 min，以6 ℃/min升至150 ℃，以4 ℃/min升至190 ℃，再以9 ℃/min升至250 ℃，最后以5 ℃/min升至280 ℃保持5 min；(4) 70 ℃保持5 min，以5 ℃/min升溫到250 ℃，再以8 ℃/min升溫到300 ℃，保持5 min。綜合考慮色譜峰的數(shù)量以及組分的分離效果，本實驗選擇升溫程序(3)。樣品的總離子流(TIC)色譜圖如圖1所示。

圖1 大鼠乳腺癌尿液樣品的總離子流(TIC)色譜圖Fig.1 TIC chromatogram of urine samples from rats with breast cancer

2.3 尿液分析

本實驗采集了對照組大鼠尿樣20例、未成瘤大鼠尿樣17例、乳腺癌大鼠尿樣33例，在優(yōu)化的實驗條件下進行分析，得到48個共同峰。為了鑒定尿液中的復雜代謝物，將代謝物分為：氨基酸、碳水化合物和脂肪酸三類。脂肪酸衍生物直接用NIST數(shù)據庫鑒定，而氨基酸和碳水化合物衍生物則通過標準化合物鑒定。實驗以正二十二烷為內標，定量結果以代謝物峰面積(Ax)與內標物峰面積(Ai)比值的形式表示。 最后成功鑒定了48個共同峰，定性和定量分析結果列于表1。

表1 大鼠尿樣中48個色譜共有峰分析結果Table 1 Analytical results of 48 common chromatographic peaks in the rat urine samples

(續(xù)表1)

2.4 實驗數(shù)據分析

在本實驗中，我們采用RF算法對三組大鼠尿液樣本中的代謝物分析結果進行分類。RF算法是一種受監(jiān)督的機器學習分類器，由于能夠有效地區(qū)分不同組樣本之間的差異，因此得到了廣泛的應用[15,16]。該方法能處理高維度的數(shù)據，并在訓練過程中得到各代謝物的變量重要度信息。其中重要度越高的變量說明對分類的貢獻越大，可能是潛在的生物標志物。

如圖2所示，不同組之間的差異明顯，乳腺癌組可以與健康組、未成瘤組有效地區(qū)分開。其中乳腺癌組樣本點與健康組的樣本點距離較遠，未成瘤組樣本點分布位于乳腺癌組與健康組之間。未成瘤組大鼠因受藥物誘導雖未成瘤，但其代謝與健康組大鼠會有一定差異。圖3列出了各代謝產物的變量重要度。結果表明，在乳腺癌組樣本和非乳腺癌組樣本中具有顯著性差異的物質主要有甲基丙二酸、3-羥基丁酸、蘇糖酸、對羥基苯乙酸、D -麥芽糖。甲基丙二酸是丙二酸的衍生物，是脂肪和蛋白質代謝中的重要中間體。甲基丙二酸含量出現(xiàn)顯著性差異說明乳腺癌可能導致脂肪和蛋白質代謝過程發(fā)生異常。3-羥基丁酸是支鏈氨基酸(主要是纈氨酸)的典型部分降解產物，3-羥基丁酸顯著減少顯示了氨基酸代謝異常。以上結果表明，由于乳腺癌的存在，導致了生物本身的一些代謝發(fā)生了改變，其差異性代謝物有可能是乳腺癌潛在的標志物。

圖2 三類樣本的隨機森林算法分析結果Fig.2 Analytical results of three group samples with random forest algorithm

圖3 各代謝產物的變量重要度Fig.3 The variable importance of metabolites

3 結論

本研究通過構建大鼠乳腺癌模型，獲得了可控的樣本，采用氣相色譜-質譜聯(lián)用技術對大鼠乳腺癌尿液中的代謝物進行了系統(tǒng)研究，結合隨機森林算法，對對照組、未成瘤組和乳腺癌組進行了分類，篩選出具有顯著性差異的5種代謝物：甲基丙二酸、3-羥基丁酸、蘇糖酸、對羥基苯乙酸、D -麥芽糖。這5種物質出現(xiàn)了明顯的差異，說明乳腺癌疾病導致了大鼠代謝發(fā)生異常，有可能成為潛在的乳腺癌標志物。