人肝癌Bel-7402細(xì)胞及Bel-7402/5-FU細(xì)胞的N-連接聚糖的差異分析

熊思元， 張智慧， 高文杰*， 劉 欣*

(1.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430074；2.武漢洪山區(qū)疾病預(yù)防控制中心，湖北武漢 430064)

2019年發(fā)布的最新全國癌癥報(bào)告數(shù)據(jù)顯示，肝癌已經(jīng)成為我國第四大常見癌癥，而其死亡率位于所有惡性癌癥的第二位[1]。盡管肝癌的診斷和治療技術(shù)有了長足的發(fā)展，肝癌病人的5年存活率依然不盡人意。對于肝癌的治療，不管是手術(shù)還是化療都容易復(fù)發(fā)。而在化療過程中，肝癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性是影響化療結(jié)果的重要因素，這會因肝癌細(xì)胞抵抗化療藥物而導(dǎo)致化療的失敗。因此，如何解決腫瘤細(xì)胞的耐藥性已經(jīng)成為其治療過程中的關(guān)鍵問題。腫瘤細(xì)胞耐藥的產(chǎn)生包括多種復(fù)雜的機(jī)制，主要集中在：膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白高表達(dá)而增加抗癌藥物的外排；增強(qiáng)損傷DNA自我修復(fù)能力；細(xì)胞內(nèi)某些受體數(shù)量及其功能的改變等[2]。雖然國內(nèi)外的研究者進(jìn)行了很多的探索，但仍未完全了解其中的機(jī)理。

糖基化是最常見且復(fù)雜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一。在真核生物細(xì)胞中，有超過50%的蛋白質(zhì)發(fā)生了糖基化修飾[3]。蛋白質(zhì)的糖基化修飾在生物體的生命活動中發(fā)揮著多種功能，例如細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，免疫識別，病原體感染等[4 - 8]。近年來細(xì)胞N-連接聚糖與腫瘤耐藥的相關(guān)性研究日益引起人們的關(guān)注。Kudo等[9]首次報(bào)道了肝癌耐藥細(xì)胞與其親本細(xì)胞中N-連接聚糖的差異分析，研究結(jié)果顯示：與母本細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞中GnT-V表達(dá)下降，三支天線的N-連接聚糖增加，預(yù)示N-聚糖與肝癌細(xì)胞耐藥具有一定相關(guān)性。

由于糖蛋白N-連接聚糖具有多樣性及微觀不均一性的特點(diǎn)，加之糖蛋白在總蛋白中的豐度很低，這些因素都增加了聚糖分析和表征的難度。質(zhì)譜因其高靈敏度和高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于糖蛋白聚糖的分析。然而，聚糖的多羥基帶來的親水特性使其在質(zhì)譜分析時(shí)的離子化效率較低，并且在分析帶唾液酸的聚糖時(shí)會因?yàn)樵磧?nèi)解離或源后解離，而給聚糖的完整分析帶來一定困難。因此，對聚糖進(jìn)行化學(xué)衍生是常用的提高聚糖檢測靈敏度的手段。

本文通過以Bel-7402細(xì)胞和其耐藥株Bel-7402/5-FU細(xì)胞為研究對象，使用本課題組開發(fā)的快速PNGase F酶切，結(jié)合TMPP-Ac-OSu和甲胺化共衍生方法，比較了兩者的總蛋白和分泌蛋白的N-連接聚糖的差異性，為進(jìn)一步探索肝癌細(xì)胞耐藥的診斷提供糖鏈標(biāo)志物起到一定的參考作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TOF/TOF5800基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜儀(美國，Sciex公司)；Triple TOF 5600液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，Sciex公司)。

Bel-7402肝癌細(xì)胞和耐5-FU的Bel-7402/5-FU肝癌細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。(N-琥珀酰亞胺基氧代羰基甲基)三(2,4,6-三甲氧苯基)溴化膦(TMPP-Ac-OSu)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、5-氟尿嘧啶(5-FU)購買自美國Sigma公司；乙腈、甲醇購買自美國TEDIA公司；十二烷基-β-D-麥芽糖苷(DDM)購買自上海阿拉丁生化科技有限公司；RIPA裂解液購買自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；N-糖酰胺酶F(PNGase F)購買自江蘇愚公生命科技有限公司；其他分析純試劑購買自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Bel-7402和Bel-7402/5-FU均在含10%(V/V)胎牛血清，以及100 U/mL雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，不同的是Bel-7402/5-FU在培養(yǎng)基中要加入終濃度為10 μg/mL的5-FU以維持其耐藥性。

1.3 細(xì)胞蛋白抽提

1.3.1 細(xì)胞總蛋白抽提向收集的細(xì)胞中加入200 μL冰的RIPA裂解液，輕微混懸之后在4 ℃下孵育15 min，然后用超聲破碎儀在冰上進(jìn)一步破碎。用轉(zhuǎn)速為15 000 r/min的高速離心機(jī)對細(xì)胞裂解液離心5 min，取上清液溶用于細(xì)胞總蛋白的抽提。使用有機(jī)溶劑沉淀法對細(xì)胞總蛋白進(jìn)行抽提[10]。

1.3.2 分泌蛋白細(xì)胞培養(yǎng)到約70%覆蓋度時(shí)，換掉帶血清的培養(yǎng)基，并用1 mL無血清培養(yǎng)基洗5次，接著加入5 mL的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。將含有分泌蛋白的無血清培養(yǎng)基移入到10 mL離心管中，用低溫高速離心機(jī)，于4 ℃下6 000 r/min離心10 min去掉細(xì)胞碎片。最后小心將上清液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，同樣用有機(jī)溶劑沉淀法對分泌蛋白進(jìn)行抽提。

1.4 快速酶切及TMPP-Ac-OSu和甲胺化共衍生

N-聚糖的酶切和衍生使用本課題組之前提出的方法[11,12]。向抽提得到的細(xì)胞蛋白中加入50 μL含1%DDM,50 mmol/L DTT和0.1%SDS的50 mmol/L HEPES緩沖溶液(pH=8.0)?；靹蚝笤?00 ℃下煮沸2 min使蛋白質(zhì)變性，之后冷卻到50 ℃。然后向上述混合溶液中加入1.0 μL的PNGase F，并且在50 ℃下反應(yīng)5 min。向上述溶液中加入50 μL用乙腈溶解的現(xiàn)用現(xiàn)配的TMPP-Ac-OSu，在40 ℃下反應(yīng)20 min。纖維素柱純化，洗脫液旋蒸后進(jìn)行甲胺化衍生，繼續(xù)過纖維素柱純化除鹽。

1.5 質(zhì)譜檢測

1.5.1 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)分析制備好的樣品溶于10 μL 50%甲醇溶液，取0.5 μL樣品與0.5 μL 10 mg/mL的CHCA溶液(溶于70%乙腈中)混合后點(diǎn)到靶板上，待樣品干燥后進(jìn)行檢測。儀器相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下：檢測模式：正離子反射模式(Reflector Positive)；加速電壓：20 kV；激光強(qiáng)度：5 000；掃描范圍：m/z1 000～5 000。數(shù)據(jù)由軟件Data Explore 4.5解析。

1.5.2 納升液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜(NanoLC-ESI-MS/MS)分析納升液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜儀由Analyst進(jìn)行系統(tǒng)控制，質(zhì)譜的電離模式為正離子模式；電噴霧的電壓設(shè)定為2 300 V；去簇電壓為100 eV；接口溫度為150 ℃。一級質(zhì)譜的掃描范圍：m/z400～2 000，電荷數(shù)范圍：2～5，母離子的積累時(shí)間：0.25 s。母離子中豐度最高的5個(gè)離子用于后續(xù)的二級質(zhì)譜檢測。二級質(zhì)譜的掃描范圍：m/z100～2 000；檢測模式為IDA(Information Dependent Acquisition)，四極桿碰撞池能量為40 eV，積累時(shí)間為0.1 s。數(shù)據(jù)由軟件Peakview1.2解析。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異

使用光學(xué)顯微鏡對兩種細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上的差異進(jìn)行了分析。Bel-7402細(xì)胞呈不規(guī)則多邊形，明顯的上皮樣細(xì)胞形態(tài)。而Bel-7402/5-FU細(xì)胞的形態(tài)與之有明顯不同，呈分片樣，棱角減少且往梭形樣發(fā)展，細(xì)胞質(zhì)清亮，折光性增強(qiáng)，有些細(xì)胞有細(xì)長的偽足狀結(jié)構(gòu)。

2.2 NanoLC-ESI-MS/MS糖型鑒定

使用NanoLC-ESI-MS/MS對本文中檢測到的N-連接聚糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并推測可能的糖型結(jié)構(gòu)。圖1所示為糖型質(zhì)荷比為m/z937.34[M+3H]3+和m/z1 042.40[M+3H]3+的二級質(zhì)譜圖，分別對可以確定糖型結(jié)構(gòu)的二級診斷離子用綠色數(shù)字進(jìn)行了標(biāo)注。如圖1(a)二級質(zhì)譜圖所示，305為唾液酸甲胺化衍生后的碎片離子，可以推測出該糖型中含有唾液酸；m/z512、674、1 977和1 252(+2)碎片離子，推測出該糖型中含有非核心巖藻糖存在；m/z1 466和1 628碎片離子推測出該糖型中還含有1個(gè)核心巖藻糖，進(jìn)而推測出可能的糖型結(jié)構(gòu)為[Hex]5[HexNAc]4[NeuAc]1[Fuc]2。

圖1 細(xì)胞中典型的N-連接聚糖二級質(zhì)譜圖。(a)為m/z937.34[M+3H]3+，推測糖型為[Hex]5[HexNAc]4[NeuAc]1-[Fuc]2的二級質(zhì)譜圖；(b)為m/z1042.40[M+3H]3+,推測糖型為[Hex]5[HexNAc]4[NeuAc]3的二級質(zhì)譜圖。Fig.1 Typical MS/MS spectra of the derivatized N-glycans from cells.(a)NanoLC-ESI-MS/MS spectrum of m/z937.34[M+3H]3+ with the composition of [Hex]5[HexNAc]4[NeuAc]1[Fuc]2;(b)NanoLC-ESI-MS/MS spectrum of m/z 1042.40[M+3H]3+with the composition of [Hex]5[HexNAc]4[NeuAc]3.

表1所列為本文中鑒定到的可能的所有糖型及其對應(yīng)的分子量。

表1 本文中使用MALDI-MS鑒定到的N-連接聚糖Table 1 N-glycans detected in this article by MALDI-MS

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

2.3 Bel-7402和Bel-7402/5-FU細(xì)胞總蛋白N-連接聚糖分析

為了提高細(xì)胞聚糖檢測的靈敏度，采用本課題組開發(fā)的PNGase F快速酶切，結(jié)合TMPP-Ac-OSu和甲胺化共衍生的方法[10,11]。圖2為Bel-7402和Bel-7402/5-FU兩種細(xì)胞總蛋白N-連接聚糖典型的MALDI質(zhì)譜圖。使用約105個(gè)細(xì)胞，即可從兩種細(xì)胞總蛋白中共檢測到56種N-連接聚糖。

圖2 Bel-7402(a)和Bel-7402/5-FU(b)細(xì)胞總蛋白N-連接聚糖的MALDI質(zhì)譜圖Fig.2 MALDI mass spectra of cell total protein N-glycan profiling from Bel-7402(a) and Bel-7402/5-FU(b)

在比較兩種細(xì)胞總蛋白N-連接聚糖的差異之前，將所有糖型的信噪比進(jìn)行歸一化處理，得到每個(gè)糖型在兩種細(xì)胞中的相對比例，結(jié)果如圖3(a)所示。為了比較三種細(xì)胞糖型在大的分類上的差異，將檢測到的糖型歸類為高甘露糖型、雜合型、復(fù)雜型和寡甘露糖型。Bel-7402細(xì)胞和其5-FU耐藥細(xì)胞總蛋白N-連接聚糖在這四類糖型中的比例分別是73.38%±1.13% vs 63.32%±1.24%；14.84%±0.94% vs 24.31±1.05%；4.65%±0.28% vs 7.13%±0.21%和7.13%±0.58% vs 5.24%±0.31%。從圖3(b)中可以看出，高甘露糖型N-聚糖在兩種細(xì)胞的總糖譜中都占了很大的比例。此外，還對含有較大差異的高甘露糖和巖藻糖化復(fù)雜糖中的單個(gè)糖型進(jìn)行了逐一比較，結(jié)果如圖3(c)和3(d)所示。在Bel-7402細(xì)胞中，Man5-10GlcNAc2五種糖型的相對比例都比耐5-FU的Bel-7402細(xì)胞要高，這是之前文獻(xiàn)中沒有報(bào)道過的。而在核心巖藻糖化的復(fù)雜糖中，文獻(xiàn)報(bào)道多分支核心巖藻糖在耐藥細(xì)胞中的比例明顯增加，這與本文的結(jié)果相一致[12,13]。除此之外，還發(fā)現(xiàn)兩分支的巖藻糖化糖型在Bel-7402細(xì)胞中的相對比例比在5-FU耐藥的Bel-7402細(xì)胞高。

圖3 Bel-7402和Bel-7402/5-FU細(xì)胞總蛋白中N-連接聚糖的差異分析。(a)為所有糖型；(b)為不同大類糖型；(c)單個(gè)高甘露糖型比較；(d)為核心巖藻糖化糖型在兩種細(xì)胞總蛋白N-連接聚糖中的差異分析。Fig.3 Differential analysis of N-glycans from total proteins between Bel-7402 and Bel-7402/5-FU cells.The difference in total N-glycans(a),four types(b),single high mannose(c)and core-fucosylation N-glycans(d) of two cell lines.

2.4 Bel-7402和Bel-7402/5-FU細(xì)胞分泌蛋白N-連接聚糖分析

細(xì)胞分泌蛋白是生物活性糖蛋白的一個(gè)重要來源，分析細(xì)胞分泌蛋白的糖譜為科研工作者研究蛋白質(zhì)糖基化與腫瘤耐藥之間的關(guān)系提供了機(jī)會。通過對5 mL無血清培養(yǎng)細(xì)胞24 h后得到的分泌蛋白進(jìn)行蛋白濃度測定，得到分泌蛋白約為30 μg。這一數(shù)值比之前文獻(xiàn)報(bào)道的分泌蛋白濃度偏高[14]?？赡艿脑蚴歉闻K是代謝旺盛的器官，因而肝細(xì)胞分泌蛋白的量更多一些。圖4所示為兩種細(xì)胞分泌蛋白N-聚糖的MALDI質(zhì)譜圖，共檢測到38種N-連接聚糖。

圖4 Bel-7402(a)和Bel-7402/5-FU(b)細(xì)胞分泌蛋白N-連接聚糖的MALDI質(zhì)譜圖Fig.4 MALDI mass spectra of cellsecreted protein N-glycan profiling from Bel-7402(a) and Bel-7402/5-FU(b)

與細(xì)胞總蛋白N-連接聚糖分析相同，將分泌蛋白中所有糖型的信噪比進(jìn)行歸一化處理，得到每個(gè)糖型在兩種細(xì)胞中的相對比例，結(jié)果如圖5(a)所示。同樣，將Bel-7402細(xì)胞和其5-FU分泌蛋白中檢測到的糖型歸類為高甘露糖型、雜合型、復(fù)雜型和寡甘露糖型。這四類糖型中在Bel-7402細(xì)胞和Bel-7402/5-FU中的比例分別是23.87%±1.57% vs 6.76%±0.54%；64.75%±1.41% vs 88.07±0.63%；10.75%±0.08% vs 4.92%±0.65%和0.62%±0.23% vs 0.23%±0.17%。從圖5(b)可以看出，與細(xì)胞總蛋白N-連接聚糖糖譜不同，細(xì)胞分泌蛋白的糖譜以帶唾液酸的復(fù)雜型聚糖為主，這與人血清中的N-連接聚糖糖譜類似，從側(cè)面說明了血清中蛋白多由細(xì)胞分泌到血液中。而細(xì)胞分泌蛋白中的高甘露糖型聚糖變化情況與細(xì)胞總蛋白相反，在5-FU耐藥細(xì)胞中顯著增加(圖5(c))。此前有文獻(xiàn)報(bào)道，耐藥細(xì)胞分泌蛋白中的核心巖藻糖化N-連接聚糖相比與母本細(xì)胞的比例顯著增加[9,13]，本文亦得到了相同的結(jié)論(圖5(d))。

圖5 Bel-7402和Bel-7402/5-FU細(xì)胞分泌蛋白中N-連接聚糖的差異分析。(a)為所有糖型；(b)為不同大類糖型；(c)單個(gè)高甘露糖型比較分析；(d)為核心巖藻糖化糖型在兩種細(xì)胞總蛋白N-連接聚糖中的差異分析。Fig.5 Differential analysis of N-glycans from secreted proteins between Bel-7402 and Bel-7402/5-FU cells.The difference in total N-glycans(a),four types(b),single high mannose(c)and core-fucosylation N-glycans(d) of two cell lines.

3 結(jié)論

使用快速PNGase F酶切，結(jié)合TMPP-Ac-OSu和甲胺化共衍生方法，對Bel-7402和Bel-7402/5-FU兩者的總蛋白和分泌蛋白的N-連接聚糖進(jìn)行了MALDI質(zhì)譜的差異分析。5-FU與Bel-7402相比，耐藥細(xì)胞在總蛋白和分泌蛋白中的巖藻糖化唾液酸糖型顯著升高；高甘露糖型N-聚糖在總蛋白中下降，而在分泌蛋白中顯著增加。本研究為進(jìn)一步探索肝癌耐藥提前診斷提供糖鏈標(biāo)志物起到一定的參考作用，并為后續(xù)解決肝癌的治療的耐藥提供理論依據(jù)。