淺談蛋白質(zhì)含量的測定

張琳 顧風(fēng)云 秦宇婷 姜卓君 劉傳玉

摘 要：蛋白質(zhì)是人體中非常重要的組成成分。蛋白質(zhì)含量測定的常用方法有凱氏定氮法、雙縮脲法、酚試劑法、紫外吸收法及燃燒法等?；诖?，本文對蛋白質(zhì)含量的測定進(jìn)行了研究。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì);分析方法;凱氏定氮法

蛋白質(zhì)是構(gòu)成生命的重要物質(zhì)[1]。在人體的細(xì)胞和組織中，蛋白質(zhì)是非常重要的組成成分。在人體中，蛋白質(zhì)占了人體質(zhì)量的18%，其與生命現(xiàn)象有著密切的關(guān)系。人體內(nèi)蛋白質(zhì)的種類很多，但性質(zhì)和功能各有區(qū)別。因此，蛋白質(zhì)的檢測方法就顯得尤為重要。凱氏定氮法是測定蛋白質(zhì)含量最為普遍的方法，同時相比較于其他檢測方式，其具有更多優(yōu)勢[2]，如易于操作、實(shí)驗(yàn)過程安全、成本較為合理、測定結(jié)果準(zhǔn)確。因此，凱氏定氮法成為食品檢驗(yàn)工作中普遍的測定方法。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：電子天平（Metteler Toledo ML204）;石墨消解儀（濟(jì)南海能儀器股份有限公司）;全自動凱氏定氮儀（山東海能科學(xué)儀器有限公司）。

試劑：硫酸銅;硫酸鉀;硫酸;硼酸;氫氧化鈉;甲基紅指示劑;溴甲酚綠指示劑;95%乙醇溶液。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，產(chǎn)生的氨和硫酸結(jié)合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或者鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量計算氮含量。凱氏定氮法的反應(yīng)過程包含以下幾個方面。

消化：蛋白質(zhì)+濃硫酸硫酸銨+二氧化碳+二氧化硫+水

蒸餾：氫氧化鈉+硫酸銨→氨氣+硫酸鈉+水

吸收：氨氣+硼酸→硼酸銨+水

滴定：硼酸銨+水+鹽酸→氯化銨+硼酸

2.2 滴定注意事項

在滴定過程中需要注意以下兩點(diǎn)。①指示劑為甲基紅溴甲酚綠，其在堿性條件下變藍(lán)，酸性條件下暗變紅。②催化定氮片。硫酸銅催化劑;硫酸鉀防止暴沸。

2.3 樣品處理及實(shí)驗(yàn)步驟分析

①稱量。固體試樣0.2～2 g、半固體試樣2～5 g，液體試樣10～25 g。②消化。于消化管中加入硫酸銅、硫酸鉀，10 mL濃硫酸后，放置石墨消解爐上消解90 min，消解溫度為420 ℃，消解儀可選用曲線加熱模式和直線加熱模式。③上機(jī)。消解后的樣品冷卻后，可上機(jī)測試。上機(jī)測試前，需要對機(jī)器進(jìn)行清洗，包括接受杯、堿管路，機(jī)器，清洗完畢后，先測試空白樣品，再測試樣品。④計算。根據(jù)公式可知，試樣的質(zhì)量、試劑空白滴定液體積、試樣滴定液體積和氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)是變量，因此，實(shí)驗(yàn)過程中需要關(guān)注天平的準(zhǔn)確性、消解是否完全、機(jī)器清洗是否干凈、空白試劑的滴定體積數(shù)以及試驗(yàn)滴定液體積數(shù)是否準(zhǔn)確。

3 儀器常規(guī)維護(hù)保養(yǎng)

①儀器要有良好的通風(fēng)和散熱條件。②儀器測試時首先進(jìn)入清洗界面選擇，換酸清洗3次左右，當(dāng)改變滴定酸的濃度時，用換酸清洗的方法將管路及滴定器中的滴定酸排凈，再用新?lián)Q酸沖洗至少6次，并及時排液。③測樣前連續(xù)做儀器空白測試[3]。等到儀器穩(wěn)定后可測試樣品（將機(jī)器中的堿量調(diào)為零，進(jìn)行測試，當(dāng)?shù)味w積之差小于0.05 mL，機(jī)器即為穩(wěn)定）。④每日實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，清洗接收杯1～2次以及堿管路2次，用洗瓶沖洗蒸餾頭殘余堿液。儀器前部的槽皿中，如果積有液體，將其擦洗干凈。⑤為了延長防濺裝置的使用壽命，請每天工作結(jié)束后清洗，即消化管內(nèi)加入一半左右的蒸餾水（以蒸餾完成消化管液體不溢出為準(zhǔn)），上機(jī)蒸餾，一般清洗2次左右（空蒸儀器把加堿量設(shè)置為“0”）。⑥儀器使用結(jié)束后要關(guān)閉水源、電源，儀器上要安裝空消化管（防止防濺裝置內(nèi)殘留液體流到儀器上）。⑦為防止堿路結(jié)晶影響儀器壽命，在完成實(shí)驗(yàn)后，進(jìn)行堿管路清洗。若儀器長時間不用或者使用時間一周以上時，應(yīng)將堿桶中的堿液換為蒸餾水;將消化管放好，選擇手動加堿，達(dá)到清洗管路的作用，防結(jié)晶堵塞。⑧堿液桶、硼酸液桶應(yīng)定期清理沉淀物并清洗干凈。⑨儀器長期使用，在蒸餾瓶中會有水垢產(chǎn)生，將影響加熱效率（建議6個月清理1次）;如使用頻繁，可增加清洗頻率[4]。通過加蒸餾水管路加入除垢劑或一定濃度的弱酸性溶液清洗干凈，按蒸餾水排水閥排凈，再用蒸餾水多次沖洗后將管路連接好。⑩如儀器存放環(huán)境溫度低于零度以下應(yīng)排空儀器內(nèi)所有液體，以免造成儀器損壞。

4 注意事項

①實(shí)驗(yàn)前，試劑要準(zhǔn)備充足，保證滿足本批次實(shí)驗(yàn);②開機(jī)前要打開冷卻循環(huán)水，保證冷卻效果;③強(qiáng)酸強(qiáng)堿反應(yīng)劇烈，建議設(shè)置加10～20 mL蒸餾水進(jìn)行稀釋;④添加氫氧化鉀溶液的體積數(shù)為濃硫酸體積的4倍，最為適宜;⑤開始進(jìn)行蒸餾時，消化管中液體的總體積以不超過總體積的1/3為宜;⑥拿取消化管的過程中需要注意高溫燙傷。在放置消化管時，需要左右旋轉(zhuǎn)幾下，確保消化管與蒸餾頭密封;⑦禁止使用邊緣有缺口，或者有裂縫的消化管;⑧儀器蒸餾過程中如遇緊急情況，可直接關(guān)閉電源開關(guān);⑨排廢液管的出口要比儀器安放位置低，以使排液暢通。

5 實(shí)際應(yīng)用與現(xiàn)狀

在目前檢測中，食品中蛋白質(zhì)含量測試參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》（GB 5009.5—2016）、《飼料中粗蛋白的測定 凱氏定氮法》（GB/T 6432—2018），同時，凱氏定氮儀還可以測定食品中揮發(fā)性鹽基氮的含量，參照標(biāo)準(zhǔn)為GB 5009.228—2016以及測定大豆肽粉中多肽含量，參照標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 22492—2008。凱氏定氮法測量蛋白質(zhì)含量最為合適[5]。蛋白質(zhì)的測定有凱氏定氮法、雙縮脲法、酚試劑法、紫外吸收法和燃燒法，其具體操作及特點(diǎn)如下。

5.1 凱氏定氮法

準(zhǔn)備4個50 mL凱氏燒瓶并標(biāo)號，向1、2號燒瓶中加入定量的蛋白質(zhì)樣品，另外兩個燒瓶作為對照，在每個燒瓶中加入硫酸鉀-硫酸銅混合物，再加入濃硫酸，將4個燒瓶放到消化架上進(jìn)行消化，之后進(jìn)行蒸餾，全部蒸餾完畢后用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定各燒瓶中收集的氨量，直至指示劑混合液由綠色變回淡紫紅色，即為滴定終點(diǎn)，結(jié)算出蛋白質(zhì)含量。

5.2 雙縮脲法

雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質(zhì)濃度的方法，硫銨不干擾顯色，Cu2+與蛋白質(zhì)的肽鍵以及酪氨酸殘基絡(luò)合，形成紫藍(lán)色絡(luò)合物，此絡(luò)合物在540 nm波長處有最大吸收。首先利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液和雙縮脲試劑繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測血清與硫酸鈉在待測試管中混合[6]，并用只加入硫酸鈉不含血清的試管作為對照，將兩支試管加入等量的雙縮脲試劑，充分混合后于37 ℃環(huán)境中放置10 min，在540 nm波長處進(jìn)行比色，以對照管調(diào)零，讀取吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接查出蛋白質(zhì)含量。雙縮脲法常用于0.5～10 g/L含量的蛋白質(zhì)溶液測定。

5.3 酚試劑法

取6支試管分別標(biāo)號，前5支試管分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，最后一支試管加待測蛋白質(zhì)溶液，不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補(bǔ)足而保持一致，將液體混合均勻，在室溫下放置30 min，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照，于650 nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。

5.4 紫外吸收法

大多數(shù)蛋白質(zhì)在280 nm波長處有特征的最大吸收，這是由于蛋白質(zhì)中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于測定0.1～0.5 mg/mL含量的蛋白質(zhì)溶液。取9支試管分別標(biāo)號，前8支試管分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，1號試管不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，最后一支試管加待測蛋白質(zhì)溶液[7]，而不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補(bǔ)足而保持一致，將液體混合均勻[8]，在280 nm波長處進(jìn)行比色，記錄吸光度值。

5.5 燃燒法

試樣在900～1 200 ℃高溫下燃燒，燃燒過程中產(chǎn)生混合氣體，其中碳、硫等干擾氣體和鹽類被吸收管吸收，氮氧化物被全部還原成氮?dú)?，形成的氮?dú)鈿饬魍ㄟ^熱導(dǎo)檢測器進(jìn)行檢測。此方法易操作[9]，但需要購買氮/蛋白質(zhì)分析儀，采購費(fèi)用比較昂貴。

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