基于磁分離技術的生物傳感器研究進展

李杜娟 馮 碩 樊 凱 劉紅英 王高峰 蘇 暢

1(杭州電子科技大學自動化學院，杭州 310018)

2(杭州電子科技大學電子信息學院，杭州 310018)

3(浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院，杭州 310051)

引言

一些具有高度傳染性的病毒易從人體傳播到人體，并引發(fā)嚴重的疫情。例如，1957年亞洲流感(H2N2)和1968年香港流感(H3N2)，造成了大量的民眾死亡[1]。而最近新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)疫情嚴重，感染人數(shù)眾多，給世界上多個國家和人民造成了巨大的損失。為了防止病毒的大規(guī)模傳播，減少病毒給民眾帶來的生命、財產(chǎn)損失，迫切需要建立簡便、快速、靈敏的醫(yī)學檢測方法。

生物傳感器通過將生物敏感材料固定在傳感器表面，利用生物分子間的特異性識別或反應，實現(xiàn)對諸多目標物的特異性檢測，因其具有體積小、成本低、反應速度快的優(yōu)點，已被廣泛應用于醫(yī)學檢測、食品安全檢測等領域[2-4]。

研究發(fā)現(xiàn)，磁珠(magnetic beads, MBs)具有尺寸小、表面官能團豐富和可控性強的優(yōu)良特性，適合用作生化分析[5]。過去的20年中，報道了很多大小從納米到微米的磁珠被用于分離和檢測各種生物和化學靶標的應用。其中，直徑為20～200 nm的納米磁珠(magnetic nanobeads, MNBs)具有比表面積大、位阻小、分布均勻的優(yōu)點，受到了廣泛的關注[6]。納米磁珠已經(jīng)被應用于病原體檢測中的分離和富集、細胞捕獲和分離、靶向給藥和癌癥治療等多個領域[7-12]。

分離方法對于目標物的捕獲效率至關重要。為實現(xiàn)將目標物與樣品背景分離，一些新興的基于磁珠的分離方法取得了不錯的分離效果，如高梯度磁選(high gradient magnetic separation，HGMS)、磁泳分離(magnetophoretic separation, MPS)和磁流分離(magnetic flow separation，MFS)等。這些方法被證明用于生物傳感器中，可以使傳感器的靈敏度得到有效提高[13-16]。下面主要從納米磁珠、磁分離方法、基于磁分離技術的生物傳感器設計方法以及磁分離在不同檢測目標中的挑戰(zhàn)4個方面進行系統(tǒng)闡述。

1 納米磁珠

納米磁珠是利用磁分離技術分離、富集目標物和設計生物傳感器的關鍵，主要包括納米磁珠的物理結(jié)構(gòu)、制備方法以及表面改性3個方面。

1.1 物理結(jié)構(gòu)

納米磁珠按結(jié)構(gòu)可分為核殼式、夾心式和彌散式三類。核殼結(jié)構(gòu)磁珠，采用無機磁性顆粒為核、聚合物為殼的結(jié)構(gòu)，主要利用聚合物穩(wěn)定劑對磁性顆粒進行表面涂覆合成[17]；夾心結(jié)構(gòu)磁珠，最內(nèi)層為聚苯乙烯，中間層為Fe3O4磁性顆粒，最外層為包裹的聚合物，可利用乳液聚合與表面涂層涂敷的方式合成[18]；彌散結(jié)構(gòu)磁珠，采用聚合物為外殼，不同于核殼結(jié)構(gòu)磁珠，無機磁性顆粒遍布于磁珠復合物中，這種磁珠主要利用聚合物基質(zhì)(納米球)產(chǎn)成聚合物外殼，并包裹無機磁性顆粒產(chǎn)生[19]。

無機磁性顆粒主要由鐵氧化物(FeO, Fe2O3, Fe3O4)、金屬(Mn, Co, Ni，Mg)摻雜氧化鐵或多功能復合材料(Fe3O4-Ag, Fe3O4-Au, FePt-Ag, CdSe-FePt)構(gòu)成[20]，而聚合物外殼通常由聚合物穩(wěn)定劑(如殼聚糖、PEG、PVA、右旋糖酐和聚乙烯亞胺等[21-23])涂覆納米磁珠核產(chǎn)生。

1.2 制備方法

近年來，核殼結(jié)構(gòu)的納米磁珠被廣泛應用于生物傳感器的研究中[24-25]，其合成主要包括無機磁性顆粒的合成和聚合物穩(wěn)定劑的涂覆兩個步驟。無機磁性顆粒多采用Fe3O4納米粒子，而共沉淀法是合成超順磁Fe3O4納米粒子簡單、有效的方法。該方法主要包括：首先，向三價鐵和亞鐵的鹽溶液中添加堿(如NaOH或NH4OH)，以沉淀鐵和亞鐵；然后，利用磁析或離心方法，分離凝膠狀沉淀物；最后，在合適的表面活性劑(如油酸)下加熱，將氫氧化鐵沉淀物在空間上穩(wěn)定為Fe3O4[26]。選用適當?shù)木酆衔锓€(wěn)定劑對Fe3O4納米粒子進行表面涂層，可最終實現(xiàn)核殼磁珠的制備。例如，在Fe3O4表面涂覆SiO2,并摻雜三(2,2′-聯(lián)吡啶)釕[Ru-bpy] (見圖1)可合成一種具有超順磁性和發(fā)光特性的核殼磁珠[27]。

圖1 具有超順磁性和發(fā)光特性的Fe3O4/SiO2核殼磁珠[27]Fig.1 Fe3O4/SiO2 core-shell magnetic beads with superpara-magnetic and luminescent properties[27]

1.3 表面改性

表面改性是指將生物識別元件(如抗體、適體或噬菌體等)修飾到納米磁珠的聚合物外殼上[3,7]。針對目標物的抗體為具有氨基或羧基的蛋白質(zhì)，采用的抗體修飾方法主要有：通過EDC/NHS方法，磁珠上的羧基或氨基與抗體上的氨基或羧基之間直接通過共價鍵偶聯(lián)[28]；通過親和素-生物素結(jié)合，磁珠上鏈霉親和素或親和素與生物素化抗體間接結(jié)合[14]；磁珠上蛋白A或蛋白G與抗體IgG的Fc片段間接結(jié)合[29-30]。此外，適配體與納米磁珠的偶聯(lián)主要通過EDC/NHS共價偶聯(lián)實現(xiàn)。在EDC和NHS存在下，適配體的氨基可與羧基化的納米磁珠成功實現(xiàn)偶聯(lián)[31]。

2 磁分離方法

磁分離技術旨在利用改性的納米磁珠，實現(xiàn)樣品背景中目標物的分離和富集。近來，一些新興的磁分離方法(如高梯度磁選、磁泳分離和磁流分離等)被開發(fā)出來，以實現(xiàn)目標物的分離和提高分離效率。

2.1 高梯度磁選

高梯度磁選是指在背景磁場中填充特定形狀的聚磁介質(zhì)，改變原磁場的磁通分布，在分選區(qū)產(chǎn)生高梯度磁場，進而產(chǎn)生強磁場力，實現(xiàn)細微目標物的分離[13]。

Ryumae等[32]開發(fā)了一種快速靈敏地檢測嗜熱黃桿菌的高梯度免疫磁分離-流式細胞儀，通過將釹環(huán)形磁鐵放置在磁性過濾器的曲率外及增大磁珠體積的方式增加了磁力，使該設備對磁珠的捕獲率超過80%。此外，Ryumae等[33]還提出了一種利用PCR和高梯度免疫磁分離檢測超嗜熱黃桿菌的方法，通過在磁過濾器及其附近的色譜柱之間引入高磁梯度磁場來增強磁力，實現(xiàn)了磁珠的高效分離。Lu等[34]提出了一種利用高梯度磁選-紫外光催化聯(lián)合系統(tǒng)高效去除壓載水中大腸桿菌的方法，所設計的系統(tǒng)裝置實現(xiàn)了在由激磁線圈構(gòu)成的高梯度磁場分離區(qū)域中大腸桿菌的有效過濾。

2.2 磁泳分離

磁泳分離是實現(xiàn)生物分離的手段之一，利用免疫磁珠與目標物預先反應，再通過外部磁場，對磁珠的磁力實現(xiàn)目標物的有效分離[35]。

Arong等[36]提出了一種摻銫(Cs)的多核納米磁珠的磁泳分離ICP-MS免疫法(見圖2)，通過優(yōu)化介質(zhì)的物理條件，并將永磁體固定在1.1 T下，以獲得足夠的磁通密度，從而克服了高噪聲背景的產(chǎn)生。結(jié)果表明，用該方法使傷寒沙門氏菌的捕獲率高達98%。

圖2 磁泳分離ICP-MS免疫法設計原理[36]Fig.2 Schematic outline of magnetophoretic separation ICP-MS immunoassay[36]

Munaz等[37]開發(fā)了一種利用平行鐵磁流體分離不同尺寸抗磁顆粒的簡易微流控平臺，使得具有預定濃度的磁性納米顆粒的鐵磁流體促進負磁泳。結(jié)果表明，該分離平臺對3.2和4.8 μm顆粒的最大分離效率分別為78%和75%。

2.3 磁流分離

磁流分離是指在微流控通道中，以一定流速實現(xiàn)目標物的分離。研究微通道內(nèi)磁珠運動規(guī)律，對實現(xiàn)快速、高效的磁分離具有重要意義[38]。

Munir等[39]采用切向微流控通道，研究了納米磁珠在釹永磁體包圍的亞微升流體中的連續(xù)分離方案，使磁珠的分離速度加快；研究對比了非磁性聚苯乙烯顆粒與磁珠的混合物的分離性能，結(jié)果表明磁珠優(yōu)先從低的微通道向高的微通道移動，從而實現(xiàn)了高效分離。Lee等[40]提出了一種集成的微流控芯片，利用磁選該芯片可以將背景細胞從循環(huán)腫瘤細胞(CTC)群體中排除；血樣分析結(jié)果證明，CTC在溶液中被分類為未固定細胞。Zheng等[41]設計了一種基于多孔金鉑納米催化劑和3D微流控芯片的光學生物傳感器，實現(xiàn)了對鼠傷寒沙門菌的靈敏檢測，結(jié)果表明該3D微流控芯片可在10 min內(nèi)分離出99%的目標細菌。

綜上所述，高梯度磁選、磁泳分離和磁流分離方法有著較高的目標捕獲率。然而，高梯度磁選在分離目標物時，易被樣品基質(zhì)中的大顆粒阻斷；采用磁泳分離，需要大量的免疫磁珠與目標物預先發(fā)生反應；盡管磁流分離能夠在微流控通道中實現(xiàn)，但其通常采用低流速以確保有效捕獲目標物，結(jié)果導致分離時間變長或樣品體積變小。近來，報導了一些有關細胞分選和預富集的磁性顆粒鏈的研究。這種磁性顆粒鏈可以增加與目標物接觸的機會，從而提高分離效率[42]。Wang等[43]設計了一種用于生成磁性顆粒鏈的磁柵，并利用有限元法(FEMM)模擬了磁柵中的磁場分布；結(jié)果證明磁柵中形成了磁性顆粒鏈，可從50 mL體積樣本中高效分離目標細菌。未來，將磁性顆粒鏈與微流控芯片結(jié)合，有望開發(fā)出快速、經(jīng)濟的目標物分離方法。

3 設計方法

采用磁分離技術的主要目的是利用納米磁珠實現(xiàn)目標物的分離、富集；該技術與不同的分析方法結(jié)合，是實現(xiàn)生物傳感器靈敏檢測的關鍵。

3.1 磁分離結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，是一種利用抗原和抗體免疫反應的特異性和酶的高效催化作用實現(xiàn)樣品中待測物微量檢測的測定方法，具有敏感性高、特異性強的特點。Hamidi-Asl等[44]將靶序列與生物素化信號探針雜交，并與功能化磁珠捕獲探針進行“三明治雜交”得到目標夾心復合物；最終利用微流控平臺對其進行ELISA，利用底物與酶作用的電流變化，成功實現(xiàn)了檢測p53抑癌基因序列中的靶DNA序列和單核苷酸突變。Seo等[45]利用抗體功能化的磁珠濃縮細胞，并利用辣根過氧化物酶催化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺顯色，設計了一種ELISA生物傳感器系統(tǒng)，實現(xiàn)了對食品樣品中單核細胞增生李斯特菌的檢測，結(jié)果證明該傳感器能夠在6 h內(nèi)檢測到濃度為2.4 CFU/g的細胞。

3.2 磁分離結(jié)合聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)是一種用于放大擴增特定DNA片段的分子生物學技術。利用磁分離技術和PCR，可以實現(xiàn)微量DNA的大幅增加，能夠使所設計的生物傳感器更加靈敏。Tian等[46]利用多重超聚合酶鏈式反應同時識別和擴增雙致病菌，并實現(xiàn)了PCR產(chǎn)物5′-PO4端的ssDNA尾信號到反應產(chǎn)物3′-OH端的ssDNA尾信號的轉(zhuǎn)換；最終利用脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端與血紅素結(jié)合形成G-四鏈DNA酶，實現(xiàn)了催化顯色反應。實驗結(jié)果表明，該傳感器可同時靈敏地檢測沙門氏菌和金黃色葡萄球菌。Zhang等[47]利用高梯度磁場，使磁珠-細菌復合物在同軸通道內(nèi)外兩壁上被均勻捕獲；并利用微流控PCR系統(tǒng)，實現(xiàn)了大腸桿菌DNA的擴增；最終利用商業(yè)探針及檢測平臺，對微流控芯片中提取的DNA進行檢測，從而測定了細菌的濃度。

3.3 磁分離結(jié)合電化學分析法

電化學分析法根據(jù)溶液中物質(zhì)的電化學性質(zhì)及其變化規(guī)律，在建立電位、電流、電量、電導等電學量與被測物質(zhì)某些量之間的計量關系的基礎上，對物質(zhì)的組分進行定量分析。在生物傳感器中，主要應用的有伏安法、陽極溶出伏安法和電化學阻抗法。

3.3.1磁分離結(jié)合伏安法

伏安法是根據(jù)電解過程中的伏安特性進行物質(zhì)分析的方法，可與磁分離技術結(jié)合，實現(xiàn)生物傳感器的靈敏檢測。Xu等[48]首先合成了核殼磁珠-葡萄糖氧化酶-多巴胺納米復合物，后利用金納米粒子實現(xiàn)了抗體和葡萄糖氧化酶的吸附，合成了用于分離和放大信號的抗體-氧化酶-金納米粒子-多巴胺復合物；最終利用該復合物實現(xiàn)了目標菌的分離，并利用普魯士藍修飾的絲網(wǎng)印刷叉指微電極測量電流響應，完成了大腸桿菌O157:H7的檢測。結(jié)果表明，該生物傳感器的檢出限為1×102CFU/mL。

3.3.2磁分離結(jié)合溶出伏安法

溶出伏安法是將待測物在適當電位下電解并富集在電極上，后反向改變電位讓富集在電極上的物質(zhì)重新溶出，同時記錄電流電壓曲線，再根據(jù)溶出峰電流的大小進行定量分析。Wu等[49]將多個堿性磷酸酶信號分子固定在納米磁珠表面，用于放大檢測信號，并將抗體成功地修飾在磁珠上，通過抗原抗體的親和結(jié)合反應實現(xiàn)了病毒的捕獲(見圖3)。最終他們利用銀沉積和陽極溶出伏安法積累酶產(chǎn)物，實現(xiàn)了酶誘導金屬化，進而實現(xiàn)了放大檢測信號。結(jié)果表明，在最佳條件下生物傳感器的線性范圍為0.01～20 ng/mL。

圖3 H7N9堿性磷酸酶分子的固定和病毒的捕獲[49]Fig.3 The ALP is fixed on the MBs and the target virus was captured by MBs[49]

3.3.3磁分離結(jié)合電化學阻抗分析

電化學阻抗法是電化學測量的重要方法之一，同時也是表征電化學系統(tǒng)的一種實驗方法，它通過測量系統(tǒng)在一定頻率范圍內(nèi)的阻抗來揭示系統(tǒng)的頻率響應。Xu等[50]利用生物素化抗體對鏈霉親和素修飾的納米磁珠進行功能化，并將功能化磁珠與目標菌結(jié)合，形成磁珠-抗體-細菌復合物；利用葡萄糖氧化酶對復合物進行標記，并利用氧化酶催化葡萄糖來降低溶液阻抗，最終利用絲網(wǎng)印刷叉指微電極測定了致病菌濃度。結(jié)果表明，該免疫傳感器的線性范圍為102～106CFU/mL。Chen等[51]利用抗李斯特菌單克隆抗體修飾的納米磁珠捕獲細菌，并與尿素酶修飾的金納米粒子在分離芯片中形成夾心復合物；最終利用高梯度磁選在分離芯片中捕獲該復合物，并利用叉指微電極的微流控芯片測量酶催化產(chǎn)物溶液阻抗，確定了李斯特菌細胞的數(shù)量。結(jié)果表明，依靠阻抗幅值和相位角的變化，均能檢測到低至1.6×102CFU/mL的李斯特菌。

3.4 磁分離結(jié)合光學分析法

光學分析法在生物傳感器中的應用較為廣泛，總的來說可以分為光譜法與非光譜法兩大類。利用光學分析法與磁分離技術設計生物傳感器，主要涉及光譜分析法、比色法、化學發(fā)光法、熒光分析法、共振法等。

3.4.1磁分離結(jié)合光譜分析法

光譜分析法是一種利用物質(zhì)的光譜特征進行定性、定量及結(jié)構(gòu)分析的方法。近來利用磁分離技術與光譜法設計生物傳感器，實現(xiàn)了對多種目標物的檢測，而研究中大多利用可見光光度法和拉曼散射法作為生物傳感器的檢測方法。Chen等[52]利用鏈霉親和素修飾的納米磁珠與生物素化抗體特異性分離目標菌，并形成磁標記細菌；然后將尿素酶修飾的金納米顆粒和通過靜電吸附的多克隆抗體與磁標記細菌反應，形成磁珠-細菌-脲酶復合物。利用尿素酶能催化尿素水解為碳酸銨導致尿素溶液的pH值增加的特性，將溴甲酚紫作為pH指示劑，在588 nm的特征波長處測定了細菌的濃度，結(jié)果表明該傳感器檢測限低至1×102CFU/mL。Sun等[53]成功將4-巰基苯甲酸分子自發(fā)吸附在金納米粒子的表面，形成自組裝單分子層SERS標記，并與氧化鐵-金納米粒子、H3N2病毒結(jié)合形成“三明治”復合物；最終利用磁選富集病毒和便攜式拉曼光譜儀對加標樣本進行檢測，以測定SERS光譜的方式測定了H3N2禽流感病毒樣品的濃度。結(jié)果表明，該生物傳感器檢出限低至102TCID50/mL(TCID50是指50%組織細胞感染量)。

3.4.2磁分離結(jié)合比色法

比色分析法是通過眼睛或光電比色計，對加入顯色試劑后呈現(xiàn)的顏色進行觀察或測量，以確定溶液中被測物質(zhì)的濃度。Wang等[43]首先制備了用于實現(xiàn)免疫磁分離的磁柵，并合成了鉑負載沸石咪唑骨架納米催化劑，用于放大生物信號；然后利用抗體修飾的納米磁珠和磁柵，實現(xiàn)了目標菌的有效分離，并與制備的納米催化劑結(jié)合，形成磁珠-細菌-納米催化劑復合物；最終利用該復合物催化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺，在450 nm的特征波長下對催化產(chǎn)物進行測定，實現(xiàn)了沙門氏菌的檢測。結(jié)果表明，該生物傳感器的線性范圍為10 ～104CFU/mL。Luan等[54]利用金納米粒子標記單鏈DNA結(jié)合蛋白制備了磁性探針，在二氧化硅-金納米顆粒的外殼固定了核酸適體和辣根過氧化物酶制備了檢測探針，并通過磁性探針與檢測探針結(jié)合構(gòu)建了一種親和性復合探針；將氯霉素加入反應體系，利用磁分離使氯霉素-磁珠-過氧化物酶復合物釋放到上清液中，催化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺體系顯色，實現(xiàn)了氯霉素的檢測。結(jié)果表明，該生物傳感器的線性范圍為0.05～100 ng/mL。

3.4.3磁分離結(jié)合化學發(fā)光法

化學發(fā)光法是一種痕量分析方法，主要依據(jù)化學檢測體系中待測物濃度與體系的化學發(fā)光強度在一定條件下呈線性定量關系的原理，利用儀器對體系化學發(fā)光強度的檢測來確定待測物的含量。Yang等[55]采用溶膠-凝膠法，制備了氧化鈦包覆的氧化鈰納米磁珠，并與石墨烯包覆的氧化鐵納米粒子結(jié)合，形成石墨烯-氧化鐵復合物；將該復合物與金納米粒子雜交并固定抗體，合成了石墨烯-氧化鐵-氧化鈦復合物，利用氧化鈦光作為催化劑，實現(xiàn)了癌胚抗原的檢測。結(jié)果表明，該免疫傳感器的線性范圍為0.01～10 ng/mL。Sun等[56]首先制備了殼聚糖修飾的氧化鐵-石墨烯微球，然后將凝血酶適配體和血紅素依次修飾到復合物表面，制備了氧化鐵-石墨烯-適配體-血紅素復合物；利用凝血酶與適配體的特異性識別以及血紅素與復合物的解析，實現(xiàn)了催化魯米諾-過氧化氫化學發(fā)光，最終實現(xiàn)了人凝血酶的檢測。結(jié)果表明，該生物傳感器的檢出限為1.5×10-15mol/L。

3.4.4磁分離結(jié)合熒光分析法

熒光分析法是一種利用熒光染料作為信標的光學檢測方法。近來將磁分離技術與熒光分析法結(jié)合設計生物傳感器，大多利用半導體量子點(quantum dots, QDs)作為標記物來實現(xiàn)目標物的靈敏檢測。Xue等[57]將蛋白G修飾的納米磁珠注入到外加高梯度磁場的雙層毛細管通道中，并使其被均勻捕獲；然后向通道中注射抗大腸桿菌O157:H7單克隆抗體與細菌形成的磁珠-細菌復合物，并與量子點修飾的抗大腸桿菌O157:H7多克隆抗體一起，在通道中與磁珠-細菌復合物反應，形成磁珠-細菌-量子點復合物；最終利用便攜式光學系統(tǒng)，測定了細菌的濃度(見圖4)。結(jié)果表明，該生物傳感器在2 h內(nèi)可檢測到低至14 CFU/mL的大腸桿菌細胞。

圖4 使用便攜式光學儀器檢測大腸桿菌的原理[57]Fig.4 Schematic outline of using portable optical instrument to detect E.coli O157:H7[57]

Wu等[58]提出了一種基于電致發(fā)光納米球的高效擴增和免疫磁選相結(jié)合的埃博拉病毒檢測方法。他們通過超聲波將大量的CdSe/ZnS量子點嵌入到納米磁珠復合物中，制備了均勻的發(fā)光納米微球，并利用磁分離將目標物從復雜樣品中分離出來，建立了一種靈敏的電致發(fā)光生物傳感器。結(jié)果表明，該生物傳感器的檢出限為5.2 pg/mL。

3.4.5磁分離結(jié)合共振法

表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)是一種靈敏的表面分析技術，利用分子吸附在重金屬膜上引起介電常數(shù)的變化來進行檢測。Wu[59]等用羧基功能化的氧化石墨烯作為敏感膜，實現(xiàn)了抗體的固定，并將檢測抗體與Fe3O4納米粒子和金納米粒子雜交，得到了用于特異性分離目標物的磁珠復合物；最終利用在抗體與人免疫球蛋白結(jié)合過程中金納米粒子放大敏感膜介電變化產(chǎn)生的SPR信號，實現(xiàn)了人免疫球蛋白的檢測。結(jié)果證明，該傳感器的檢出限為1.88 ng/mL。

綜上所述，磁分離技術與不同的檢測方法結(jié)合，實現(xiàn)了病毒、細菌、細胞、核酸和蛋白的靈敏檢測，并且基于磁分離技術的生物傳感器具有良好的線性關系[49,54]。磁分離與電化學免疫分析法結(jié)合的電化學免疫傳感器具有靈敏度高、成本低等優(yōu)點，被廣泛應用于臨床診斷領域[60]。電化學發(fā)光法結(jié)合了電化學免疫法高靈敏度和化學發(fā)光法良好穩(wěn)定性的優(yōu)點，實現(xiàn)了病毒的靈敏檢測[61]。然而，由于缺乏高效的電化學發(fā)射源和抗干擾能力，因此電化學發(fā)光生物傳感器的臨床應用受到了很大限制。為克服這一缺點，Luo等[62]在二氧化硅納米粒子中嵌入了多個Ru(bpy)32+，并用多克隆抗體進一步修飾、制備了用作信號探針的二氧化硅納米球，實現(xiàn)了H9N2病毒的超高靈敏檢測。此外，磁分離技術與比色技術、量子點技術等結(jié)合，還成功實現(xiàn)了食源性致病菌的超高靈敏檢測[43,58]。

4 面臨的挑戰(zhàn)

實現(xiàn)目標物與樣品背景分離是提高檢測靈敏度的重要環(huán)節(jié)。近10年來，磁分離技術被廣泛應用于病毒、細菌、細胞、蛋白和核酸等生物標靶的特異性分離[59,63-64]，通過生物識別元件修飾的納米磁珠與生物標靶發(fā)生特異性反應形成磁性標靶，并利用磁場定向捕獲磁性標靶，實現(xiàn)目標物的分離和富集。

4.1 磁分離在病毒檢測中的挑戰(zhàn)

在臨床診斷中，一方面由于樣品中目標病毒的含量極低，導致基于免疫磁分離的生物傳感器的靈敏度不夠高；另一方面由于抗體價格昂貴，生物傳感器只適用于小體積樣品中的病毒檢測，而一些病毒(如甲肝病毒)新抗原變體的快速出現(xiàn)，削弱了病毒與抗體的結(jié)合，易造成假陰性檢測的風險[65]。此外，雖然納米磁珠在分離病毒中得到了廣泛的應用，但其作為病毒分離載體和信號載體的聯(lián)合應用卻鮮有研究。二者結(jié)合的設計方法有助于在復雜樣品中構(gòu)建一種靈敏度高、抗干擾能力強的免疫傳感器[49]。因此，將磁珠作為分離載體和信號載體來構(gòu)建一種高靈敏生物傳感器，是實現(xiàn)病毒檢測的一個重要方向。

4.2 磁分離在細菌和細胞檢測中的挑戰(zhàn)

納米磁珠因具有表面官能團豐富和響應速度快等優(yōu)良特性，被廣泛應用于細菌和細胞的分離。利用靶細菌或細胞的抗體對磁珠進行修飾，可實現(xiàn)磁珠與靶細菌或細胞的結(jié)合；利用磁分離可實現(xiàn)背景和懸浮物的去除，進而濃縮細菌或細胞，提高生物傳感器的靈敏度[66]。然而，免疫磁分離通常采用人工操作，不適合從大體積樣品中分離目標細菌或細胞。盡管Lin等[67]已利用高梯度磁選嘗試從大量細菌中分離目標細菌，但由于真實的食品樣品中細菌濃度低、大顆粒物對分離通道的堵塞，以及蛋白質(zhì)和其他殘留物的非特異性結(jié)合，極大地限制了在復雜食品樣品中的實際應用。因此，實現(xiàn)從大體積樣品中分離目標菌，是磁分離技術更好地應用在細菌檢測中的一個主要挑戰(zhàn)。

4.3 磁分離在蛋白和核酸檢測中的挑戰(zhàn)

用磁分離技術分離富集核酸或蛋白，通常包括吸附、洗滌和解吸等步驟，而人工操作會增加核酸或蛋白與外部環(huán)境的接觸和轉(zhuǎn)移機會，容易造成交叉污染。另外，人為干預可能導致背景噪聲過大，從而降低生物傳感器的信噪比[68]。為解決交叉污染和背景噪聲的問題，開發(fā)磁分離和基于磁納米珠的生物傳感器一體的微流控芯片，是未來重要的發(fā)展趨勢。

5 展望

高梯度磁選、磁泳分離和磁流分離對食源性致病菌等具有較高的分離效率，且具有分離速度快和操作簡單的優(yōu)點[13-14,40]。然而，高梯度磁場在分離目標物時，易被樣品中的大顆粒阻斷；磁泳分離時，需要大量的免疫磁珠與目標物預先發(fā)生反應；盡管磁流分離能夠在微流控通道中實現(xiàn)分離，但它通常低流速使用，以確保有效捕獲目標細菌，從而導致分離時間變長，或使樣品體積變小。3種方法都無法在短時間內(nèi)實現(xiàn)高效、經(jīng)濟的目標物分離，目前也沒有任何有關從大體積樣品中實現(xiàn)快速、低成本和特異性分離食源性病原菌的報導[43]。因此，開發(fā)有效的磁分離方法，實現(xiàn)從大體積樣品中分離目標物，是未來磁分離技術發(fā)展的一個主要挑戰(zhàn)。

磁分離技術已經(jīng)被廣泛應用于生物傳感器中，可提高生物傳感器的靈敏度，進而實現(xiàn)高靈敏檢測，并且基于磁分離技術的生物傳感器已被證明具有良好的線性關系[49,53,57]。此外，磁分離技術與比色法、陽極溶出伏安法、量子點技術結(jié)合，使生物傳感器的靈敏度得到了進一步提高，并實現(xiàn)了超高靈敏檢測[43,49,57]。然而,基于磁分離技術的生物傳感器還需要依賴一些大型、昂貴設備的支持，不具有便攜性，無法在現(xiàn)場實現(xiàn)快速檢測[43,56,69]。因此，利用磁分離技術，依托小型、便捷設備設計生物傳感器，實現(xiàn)快速、靈敏和特異性的檢測，是一個有前途的發(fā)展方向，這將為疾病的早期診斷與疫情的及時防控提供有力保障。期待未來能夠?qū)⒋欧蛛x方法與生物傳感器有機結(jié)合，開發(fā)出高效的便攜設備和平臺，在現(xiàn)場實現(xiàn)靈敏和快速的檢測，這對醫(yī)學檢測、疾病預防以及臨床診斷與治療等都具有重要意義。