布魯氏菌病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

歐陽(yáng)志良，黃添祥，溫 蕾

（廣東省東莞市厚街鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，廣東 東莞 523960）

布魯氏菌病（以下簡(jiǎn)稱“布病”）是由布魯氏菌引起的一種人畜共患傳染，病原是革蘭氏陰性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，可在巨噬細(xì)胞中增殖，從而引起宿主動(dòng)物慢性感染。布病可感染多種動(dòng)物和人，臨床上主要引起母畜流產(chǎn)、公畜睪丸炎，人感染主要表現(xiàn)為長(zhǎng)期反復(fù)的波狀熱、乏力、多汗、肌肉和關(guān)節(jié)疼痛等。近幾年，隨著畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展壯大，我國(guó)布病在人間和畜間的流行傳播呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人們健康和畜牧業(yè)發(fā)展。因此，研究和豐富布病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法、大力提升基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室布病診斷水平對(duì)該病的防控工作具有重要意義。本文除基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)布病的各類(lèi)檢測(cè)方法進(jìn)行如下概述。

1 病原學(xué)檢測(cè)

1.1 布魯氏菌的分離培養(yǎng)

主要是從感染個(gè)體的血液、乳汁或組織中通過(guò)特定培養(yǎng)基分離布魯氏菌，結(jié)合其它試驗(yàn)方法對(duì)培養(yǎng)出菌體進(jìn)行鑒別。這是布病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是分離效率低、容易污染、操作難、從業(yè)人員感染風(fēng)險(xiǎn)大，不適于普遍推廣。

1.2 分子生物學(xué)診斷技術(shù)

主要包括PCR技術(shù)、核酸探針技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP技術(shù)）。此類(lèi)技術(shù)是根據(jù)布魯氏菌基因研究深入而發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)診斷技術(shù)。

1.2.1 PCR技術(shù) 布魯氏菌基因的特異保守序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)病料提取物DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小診斷分析。此技術(shù)靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、效率高，準(zhǔn)確度也高。但是單一的引物無(wú)法判斷布魯氏菌的生物型，因此根據(jù)布魯氏菌基因組高度保守序列和有拷貝數(shù)差異的保守序列設(shè)計(jì)引物建立多重PCR應(yīng)運(yùn)而生。后者多用于布魯氏菌新種型的鑒定，即可以設(shè)計(jì)特定引物，鑒別是屬于牛、豬、羊還是其它種屬的布病。同時(shí)，RT-PCR技術(shù)是在PCR引物探針上添加熒光標(biāo)記，通過(guò)實(shí)時(shí)捕捉擴(kuò)增時(shí)熒光信號(hào)，解決了布魯氏菌核酸定量問(wèn)題。此技術(shù)避免了普通PCR的電泳流程，減少操作誤差、效率高、實(shí)現(xiàn)了核酸的定量，是目前最精準(zhǔn)的布病檢測(cè)技術(shù)。缺點(diǎn)是成本高、對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、人員、環(huán)境水平要求更高。

1.2.2 核酸探針技術(shù) 主要是依據(jù)核苷酸的嚴(yán)格配對(duì)的原理，設(shè)計(jì)核酸探針用于病例血清雜交檢測(cè)。此技術(shù)靈敏度高、特異性好，檢測(cè)效率高、操作簡(jiǎn)便，對(duì)儀器設(shè)備要求低，探針可以重復(fù)利用、成本較RT-PCR法低，特別適合用于臨床樣本的檢測(cè)和布病流行病學(xué)調(diào)查。例如布魯氏菌16S rRNA全菌雜交技術(shù)在布魯氏菌檢測(cè)中具有很高價(jià)值。但隨著實(shí)驗(yàn)室布病的分子生物學(xué)和血清學(xué)診斷技術(shù)革新，布病的診斷有了更多選擇。

1.2.3 新型可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP技術(shù)） 與PCR技術(shù)類(lèi)似，在反應(yīng)前加入特定指示劑（例如羥基萘酚藍(lán)），通過(guò)特異性擴(kuò)增核酸序列檢測(cè)病原，在一定條件下反應(yīng)，結(jié)果可根據(jù)顏色變化直接肉眼判斷。最新的可視化LAMP技術(shù)的檢測(cè)效率、特異性和靈敏度皆可以與PCR技術(shù)媲美，而且其對(duì)設(shè)備要求不高、操作簡(jiǎn)便、肉眼可判斷陽(yáng)性結(jié)果，非常適合基層實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用和推廣。

2 免疫學(xué)診斷

2.1 虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT技術(shù)）

目前，基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室多運(yùn)用RBPT技術(shù)篩查動(dòng)物布病感染情況。根據(jù)抗原抗體結(jié)合特性，被檢血清內(nèi)若有布病抗體則出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，分為“+”、“++”、“+++”、“++++”不同程度等級(jí)。此試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、試劑盒保存方便、成本低廉，但特異性差，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，肉眼判定誤差大。對(duì)出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的動(dòng)物須進(jìn)一步作補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)CFT或其他輔助診斷試驗(yàn)。

2.2 膠體金免疫層析技術(shù)（GIGA）

此技術(shù)的檢測(cè)靈敏度、特異性與傳統(tǒng)的試管凝集試驗(yàn)比較無(wú)顯著差異，但操作、人員、實(shí)驗(yàn)室條件比后者要求低很多，此外檢測(cè)所需樣品量少、成本低廉，非常適合于布魯氏菌病的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和布病流行病學(xué)調(diào)查。但不如ELISA、CFT等靈敏度高。

2.3 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）

此試驗(yàn)是基于抗原抗體特異性結(jié)合形成復(fù)合物的原理，抗體分子構(gòu)象改變與補(bǔ)體結(jié)合，補(bǔ)體非游離狀態(tài)存在，加入紅細(xì)胞和溶血素后不溶血。如果待測(cè)血清中不存在特異性抗體，則補(bǔ)體不與抗體結(jié)合處于游離狀態(tài)，發(fā)生溶血。因此可以根據(jù)溶血現(xiàn)象的發(fā)生與否來(lái)判斷受檢血清中是否存在布魯氏菌的特異性抗體。CFT是國(guó)際上公認(rèn)的特異性高的布病血清學(xué)診斷技術(shù)，應(yīng)用面廣。但缺點(diǎn)是溶血素等試劑的制備困難、實(shí)驗(yàn)操作繁瑣、在臨床上推廣難，而且由于補(bǔ)體的生物干擾性，此法不適于豬布魯氏菌病的檢測(cè)，具有一定的局限性。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，通過(guò)顯色程度實(shí)現(xiàn)抗原抗體定量。此法檢測(cè)布病與CFT準(zhǔn)確率和靈敏度相當(dāng)，操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，通常用于動(dòng)物群體檢疫的大規(guī)模篩選。

目前ELISA法檢測(cè)布病有iELISA（間接性）和cELISA（競(jìng)爭(zhēng)性）兩種，其檢測(cè)效果取決于抗原的選擇和制備。目前ELISA法所用的抗原主要還是光滑型脂多糖(S-LPS)，但這造成了cELISA法對(duì)粗糙型布魯氏菌無(wú)法被準(zhǔn)確診斷，而iELISA法又無(wú)法避免其他陰性菌感染引起的交叉反應(yīng)。后來(lái)，隨著基因工程的發(fā)展，Pallab Chaudhuri等科學(xué)家用重組蛋白OMP28（是一類(lèi)布魯氏菌的外膜蛋白）作為抗原用于牛、羊布病的iELISA診斷法中，解決了sLPS-ELISA無(wú)法診斷粗糙型的局限性；同時(shí)，由于OMP28蛋白的抗體因免疫類(lèi)型不同而體內(nèi)表達(dá)的時(shí)期不同，可用于區(qū)分布病的自然感染和疫苗免疫，故作為L(zhǎng)PS-ELISA的補(bǔ)充試驗(yàn)使用。但目前，只有牛的布魯氏菌病ELISA檢測(cè)方法是國(guó)際貿(mào)易中指定的，其他種的ELISA檢測(cè)方法仍然是研究的熱點(diǎn)。

2.5 熒光偏振試驗(yàn)（FPA）

FPA法是利用抗原抗體相結(jié)合原理進(jìn)行的分子同源性分析方法。它依據(jù)溶液中分子大小不同旋轉(zhuǎn)速率不同的性質(zhì)，使用熒光色標(biāo)記分子，經(jīng)偏光分析儀檢測(cè)得出結(jié)果。若被測(cè)樣品中抗體抗原相結(jié)合，分子旋轉(zhuǎn)速率下降。此法檢測(cè)布病效率高，反應(yīng)時(shí)間2min左右，免去了ELISA法中的洗板和孵育時(shí)間，成本較低，合適在實(shí)驗(yàn)室和養(yǎng)殖場(chǎng)等地進(jìn)行。

3 總結(jié)

國(guó)內(nèi)外對(duì)布病的檢測(cè)和診斷方法多種多樣，但都存在著不同的局限性。因此，布病的確診都需要幾種方法相結(jié)合來(lái)補(bǔ)充數(shù)據(jù)支撐。下面為幾個(gè)基層布病常用診斷方法的比較（見(jiàn)表1）。

表1 基層診斷布病常用方法比較

目前，開(kāi)發(fā)特異性高、靈敏性強(qiáng)、成本合理、能區(qū)分自然感染和疫苗免疫等性的實(shí)驗(yàn)室診斷方法依然是布病診斷研究的重難點(diǎn)。國(guó)家通過(guò)建立適于省、市、縣級(jí)等多級(jí)疫病防控系統(tǒng)監(jiān)測(cè)布病情況，實(shí)驗(yàn)室使用的標(biāo)準(zhǔn)化布氏菌檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)研究，建立流行菌株數(shù)據(jù)庫(kù)，確定爆發(fā)流行范圍，為尋找傳染源和傳播鏈提供技術(shù)和數(shù)據(jù)支撐。