非洲豬瘟病毒LNA引物PCR檢測方法的建立及優(yōu)化

李 艷，張煜軒，楚品品，蔣智勇，席振軍，蔡汝健，勾紅潮，張昆麗，宋 帥，卞志標，李春玲

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站，廣州 510640）

0 引言

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的家豬和野豬的一種急性、熱性和高度致死性傳染病，病死率可達100%[1]。2018年8月3日，非洲豬瘟疫情在中國沈陽市沈北新區(qū)首次被發(fā)現(xiàn)[2]，隨后在全國各地陸續(xù)爆發(fā)，給中國養(yǎng)豬業(yè)帶來了毀滅性的打擊，造成了前所未有的經(jīng)濟損失[3]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報告疫病，中國將其列為一類動物疫病。目前非洲豬瘟尚無有效疫苗，現(xiàn)階段該病的防控重點仍然是早發(fā)現(xiàn)、早剔除進而有效預防和控制疫情，因此建立ASFV快速、特異的檢測方法對ASF防控具有重要意義。

ASFV是非洲豬瘟病毒科的唯一成員，是一種大型囊膜病毒，基因組由單分子線性、共價閉合的雙鏈DNA組成，大小為170～190 kb，編碼151～167個開放閱讀框[4-5]。ASFV粒子結(jié)構復雜而規(guī)則，包含50多種結(jié)構蛋白，呈現(xiàn)二十面體對稱結(jié)構，病毒粒子直徑約為200 nm[6]。P72蛋白是ASFV的主要結(jié)構蛋白，由基因B646L編碼，該基因高度保守，是目前ASFV檢測中常用的引物設計靶標[7]。

PCR方法是目前ASFV快速診斷中廣泛推薦使用的核酸檢測技術[8]，賈云飛等[9]針對非洲豬瘟病毒p72基因建立了非洲豬瘟病毒SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法，崔貝貝等[10]基于E184L基因建立了非洲豬瘟病毒實時熒光定量PCR檢測方法。熒光定量PCR方法檢測靈敏度高、特異性強，但所用儀器和試劑價格昂貴，成本高，且對操作人員要求嚴格，不利于其在條件一般的實驗室或基層獸醫(yī)臨床檢測中大規(guī)模推廣應用；常規(guī)PCR方法操作簡單、成本低，但其敏感性和特異性有待進一步提高。鎖核酸(locked nucleic acid,LNA)技術通過將堿基進行鎖核酸修飾，可顯著提高核苷酸與DNA模板的結(jié)合能力，含有LNA堿基的引物可顯著提高PCR擴增的特異性和敏感性，Tm值顯著提高。研究報道顯示，在病原檢測[11-13]、病原鑒別檢測[14]及基因突變[15]等方面已廣泛應用LNA技術對引物及探針進行修飾，獲得了良好的檢測效果。Zhang等[13]通過LNA修飾引物，建立了百日咳桿菌的LNA-OTN-q-PCR方法，方法的靈敏度較常規(guī)RT-PCR方法提高了100倍。也有研究者通過鎖核酸修飾探針，建立了人類B型肝炎病毒(HBV)的LNA探針實時熒光定量PCR檢測方法，其靈敏度、穩(wěn)定性及擴增效率均顯著高于TaqMan探針法[16]。目前尚未見非洲豬瘟病毒LNA修飾引物PCR檢測方法的研究報道。

本研究根據(jù)ASFV基因組p72基因設計特異性引物，并將引物堿基進行選擇性LNA修飾，建立了非洲豬瘟病毒的LNA引物PCR檢測方法，為非洲豬瘟防控提供了新的檢測技術。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒均采購自市場上的商品化疫苗，其中，豬瘟病毒活疫苗購自廣東永順生物制藥股份有限公司，豬偽狂犬病毒活疫苗（Bartha-K61株）、豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗購自上海海利生物技術有限公司。

1.1.2 主要試劑 EmeralAmp Max PCR Master(2×)，TB Green Premix Ex TaqⅡ(2×)，DL500 DNA Marker均購自寶生物工程大連有限公司；DNA提取試劑盒購自Magen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據(jù)GenBank公布的非洲豬瘟病毒的基因組序列中保守穩(wěn)定的B646L基因（P72蛋白基因，登錄號：MH713612）序列，設計兩對特異性引物，同時對引物序列中適當?shù)膲A基進行鎖核酸修飾，引物具體序列如表1所示。

表1 引物信息

1.2.2 標準品的制備 陽性重組質(zhì)粒pUC57-ASFV-p72由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。測序結(jié)果與GenBank序列比對無誤后，采用全自動紫外分光光度計測定質(zhì)粒的濃度和純度。

1.2.3 LNA引物PCR方法的建立 LNA引物PCR預設反應體系：EmeralAmp Max PCR Master(2×)10 uL，上、下游引物(10 umol/L)各1.0 uL，模板1.0 uL，加雙蒸水至20 uL。PCR預設反應條件：95℃、4 min；94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、40 s，35個循環(huán)；72℃、10 min。退火溫度的優(yōu)化，在LNA引物PCR反應中，設置退火溫度為60～75℃。反應結(jié)束后，取5 uL PCR產(chǎn)物用3.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。引物濃度優(yōu)化，將上、下游引物濃度范圍設置為0.1～0.7 umol/L，以0.1 umol/L遞增，進行PCR擴增。反應結(jié)束后，取5 uL PCR產(chǎn)物用3.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.4 常規(guī)引物PCR方法的反應體系和反應條件 反應體系：EmeralAmp Max PCR Master(2×)10 uL，上、下游引物(10 umol/L)各0.8 uL，模板1 uL，加雙蒸水至20 uL。反應條件：95℃、4 min；94℃、30 s，65℃、30 s，72℃、40 s，35個循環(huán)；72℃、10 min。

1.2.5 熒光定量PCR方法的反應體系及反應條件 采用P1/P2引物，按照反應體系：TB Green Premix Ex TaqⅡ(2×)10 uL，上、下游引物各0.8 uL，模板1 uL，加雙蒸水至20 uL。擴增程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)；溶解曲線：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，進行real-time PCR擴增。

1.2.6 LNA引物PCR方法的靈敏性檢測 將測定濃度和純度后的陽性重組質(zhì)粒pUC57-ASFV-p72分別做10倍的梯度稀釋，選取3×106～3×100copies/uL共7個稀釋度的重組質(zhì)粒作為標準品模板，選取3×105～3×100copies/uL共6個稀釋度的重組質(zhì)粒，使用優(yōu)化后的LNA引物PCR條件，進行LNA引物PCR及常規(guī)PCR擴增，并進行兩者的敏感性比較，試驗重復3次；選取3×106～3×101copies/uL共7個稀釋度的重組質(zhì)粒使用優(yōu)化后的LNA引物PCR條件及常規(guī)引物real-time PCR條件，進行LNA引物PCR及常規(guī)引物real-time PCR，進行兩者的敏感性比較，試驗重復3次。

1.2.7 LNA引物PCR方法的特異性檢測 利用所建立的LNA引物PCR反應體系和反應參數(shù)，以3×105拷貝的陽性重組質(zhì)粒作為標準的陽性對照。豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒基因組作為模板，無菌水作為陰性對照，進行LNA引物PCR，以驗證方法的特異性。

1.2.8 LNA引物PCR方法的應用 用本研究建立的LNA引物PCR方法對72份臨床采集的豬的組織樣品進行檢測，并與OIE提供的實時熒光定量PCR方法進行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 LNA引物PCR反應條件優(yōu)化

退火溫度優(yōu)化結(jié)果顯示，LNA引物退火溫度范圍廣，在60～75℃退火溫度范圍內(nèi)均有較好的擴增，退火溫度為70.3時，擴增效果最佳（圖1A），因此LNA引物PCR反應退火溫度選擇70.3℃。而常規(guī)引物僅在60～68.4℃退火溫度范圍內(nèi)有較好擴增，退火溫度高于68.4℃時，擴增條帶越來越弱（圖1B）。LNA引物濃度優(yōu)化結(jié)果顯示，隨著引物濃度提高，擴增目的條帶越來越亮，當上、下游引物濃度為0.4 μmol/L(0.8 uL)時，擴增條帶最明顯，而后隨著引物濃度升高擴增條帶無明顯變化，因此最佳引物濃度為0.4 μmol/L（圖2）。基于退火溫度和引物濃度優(yōu)化結(jié)果，建立了最佳反應體系如下：EmeralAmp Max PCR Master(2×)10 uL，上、下游引物(10 umol/L)各0.8 uL，模板1 uL，加雙蒸水至20 uL。反應條件：95℃、4 min；94℃、30 s，70.3℃、30 s，72℃、40 s，35個循環(huán)；72℃、10 min。

圖1 不同退火溫度的擴增結(jié)果

圖2 引物濃度的優(yōu)化

2.2 LNA引物PCR的敏感性

敏感性試驗結(jié)果顯示，LNA引物PCR最低檢測限為3×101copies/uL（圖3），常規(guī)引物PCR檢測限為3×103copies/uL（圖4），常規(guī)引物real-time PCR最低檢測限度為3×102copies/uL（圖5），LNA引物PCR較常規(guī)引物PCR敏感性提高100倍，LNA引物PCR比常規(guī)引物real-time PCR敏感性高10倍。

圖3 LNA引物PCR敏感性

圖4 常規(guī)引物PCR敏感性

圖5 Real-time PCR敏感性實驗結(jié)果

2.3 LNA引物PCR的特異性

采用P3/P4引物分別對3×105拷貝的陽性重組質(zhì)粒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒基因組進行LNA引物PCR，結(jié)果只有陽性重組質(zhì)粒能擴增出147 bp的目的片段，其它病毒未擴增出條帶，如圖6所示，試驗表明LNA引物PCR檢測方法具有良好的特異性。

圖6 特異性試驗結(jié)果

2.4 LNA引物PCR方法的應用

應用本研究建立的LNA引物PCR方法對臨床樣品進行檢測，同時用OIE推薦的實時熒光定量PCR方法進行驗證[17]。結(jié)果顯示，72份樣品均未擴增出目的條帶，檢測結(jié)果為陰性，與OIE推薦的實時熒光定量PCR法檢測結(jié)果一致，符合率為100%（表2）。

表2 LNA引物PCR和OIE推薦real-time PCR方法檢測結(jié)果比對

3 討論

中國是世界第一養(yǎng)豬大國，任何危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的新發(fā)疾病都必須引起高度重視。非洲豬瘟作為目前嚴重危害中國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的新發(fā)疾病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來前所未有的經(jīng)濟損失和防控挑戰(zhàn)[18]，目前該病尚無有效疫苗，防控主要依靠早期診斷，精準剔除，因此針對病的診斷技術研究是科研工作者目前的研究方向之一。

目前已有多種非洲豬瘟病毒核酸檢測方法的研究報道，主要有熒光定量PCR[19-20]、數(shù)字PCR[21-22]、實時熒光LAMP[23-24]及納米孔測序[25]等，這些檢測方法雖然檢測效果理想，但普遍存在設備昂貴、成本高、操作繁瑣等實際問題，較難在基層大規(guī)模推廣應用。

PCR檢測方法是OIE官方推薦的ASFV檢測方法，也是最適合基層及實驗條件一般的實驗室采用的ASFV檢測方法，但該方法在檢測ASFVp72基因Ⅱ型毒株的實驗樣品時，敏感性較低[26]，這將嚴重影響ASFV檢測的準確性，進而延誤非洲豬瘟疫情的防控。PCR檢測中引物的設計至關重要，直接影響檢測效果，有研究者通過重新設計引物建立了新的非洲豬瘟病毒的PCR檢測方法，方法的檢測靈敏度達60個拷貝數(shù)[27]。研究顯示對引物序列進行堿基修飾，可增加引物序列和靶基因序列的親和力，從而有效提高PCR方法的檢測效果。

LNA是一種雙環(huán)狀核酸衍生物，核糖的2'-O位和4'-C位通過縮水作用形成氧亞甲基橋并連接成鎖狀結(jié)構，該結(jié)構鎖定了呋喃糖C3內(nèi)型的N構型，降低了核糖結(jié)構柔韌性，同時增加了磷酸鹽骨架的穩(wěn)定性，使PCR反應中其與DNA、RNA結(jié)合成的雙鏈的穩(wěn)定性和親和力更高[28]。最新研究報道顯示，該技術在乙型肝炎病毒基因突變[29]及狐貍、水貂成分快速檢測[30]中展現(xiàn)了較高的檢測靈敏度和特異性。近幾年筆者持續(xù)開展了LNA技術在豬病病原檢測中的應用，前期應用LNA技術進行探針修飾建立了豬偽狂犬病毒的LNA探針熒光定量PCR方法，方法的特異性和敏感性均較好[31]。目前尚未見非洲豬瘟病毒PCR檢測中引物進行LNA修飾的研究報道。本研究基于鎖核酸修飾堿基技術對ASFV檢測引物堿基進行了適當?shù)腖NA修飾，建立了ASFV的LNA引物PCR檢測方法。引物濃度和退火溫度在PCR反應中發(fā)揮關鍵作用，最適引物濃度和退火溫度可顯著提高PCR檢測的準確性和靈敏度。本研究對實驗過程中的引物濃度和退火溫度進行了優(yōu)化，確定了最佳引物濃度為0.4 μmol/L，最佳退火溫度為70.3℃。本研究建立的LNA引物PCR具有較高的靈敏度，最低檢測限為3×101copies/uL，比常規(guī)引物PCR方法的靈敏性提高100倍，比常規(guī)引物realtime PCR檢測靈敏度提高10倍。本研究建立的LNA引物PCR方法具有良好的特異性，對豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒等病原均無目的條帶擴增，常規(guī)引物PCR在擴增過程中存在非特異性擴增現(xiàn)象，但LNA修飾后的引物在ASFV的擴增中無任何非特異性條帶出現(xiàn)，特異性良好。實驗結(jié)果表明，在非洲豬瘟PCR檢測中應用LNA進行引物堿基修飾可顯著提高PCR檢測方法的特異性和靈敏度該，本研究建立的LNA引物PCR方法可用于臨床非洲豬瘟病毒檢測，將在ASFV流行病學調(diào)查、監(jiān)測及防控中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

本研究利用鎖核酸進行引物修飾，通過優(yōu)化退火溫度及引物濃度，得到了非洲豬瘟病毒鎖核酸引物PCR反應體系最佳退火溫度為70.3℃，最佳引物濃度上、下游引物濃度分別為0.4 μmol/L，首次建立了非洲豬瘟病毒鎖核酸修飾引物PCR檢測方法。該方法的檢測靈敏度可達3×101copies/uL，遠遠高于常規(guī)引物PCR檢測靈敏度(3×103copies/uL)。方法特異性良好，與CSFV、PCV-2、PRV等病原無交叉反應。本研究為非洲豬瘟病毒臨床檢測提供了一種簡單、高效且便于推廣使用的新型檢測方法。