腺苷2B受體激動(dòng)劑對(duì)大鼠高原肺水腫的治療作用

羅芩 何慶

(1.西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610031； 2.西南交通大學(xué)附屬醫(yī)院 成都市第三人民醫(yī)院，四川 成都 610031)

急性高原病是指人在進(jìn)入海拔2 500 m以上的高原環(huán)境不能很快適應(yīng)而發(fā)生的一系列不適癥狀，包括急性高山病、高原肺水腫(high-altitude pulmonary edema，HAPE)和高原腦水腫[1]。HAPE往往起病急，病情變化快，救治難度大，嚴(yán)重威脅人的生命健康，因此對(duì)HAPE立即進(jìn)行有效治療十分重要。

腺苷可刺激肺泡離子轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)肺泡內(nèi)液體清除[2]。它有四種不同的G蛋白偶聯(lián)腺苷受體(Ars)，包括A1AR、A2AAR、A2BAR和A3AR，其中，A2BAR高表達(dá)于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞[3]。BAY60-6583是A2BAR的選擇性激動(dòng)劑，對(duì)其親和力遠(yuǎn)高于其他腺苷受體[4]。有研究證明BAY60-6583在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷模型中能抑制肺水腫、減輕肺部炎癥[5]。因此，本研究旨在探究BAY60-6583是否能對(duì)急性HAPE大鼠模型起到治療作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

高原性疾病環(huán)境模擬艙(成都達(dá)碩)，Epoch酶標(biāo)檢測(cè)儀(BioTeK)，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(Bio-rad)，BAY60-6583(Master of Small Molecules)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(優(yōu)爾生)，白介素(IL)-6試劑盒(優(yōu)爾生)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成)，丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成)，環(huán)磷酸腺苷(cAMP)試劑盒(江萊)，兔抗氨酰敏感Na+通道α亞基(epithelial sodium channel-α，ENaC-α)抗體(Stressmarq)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD雄性大鼠(180～220 g)[購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(川)2020030]。

2 方法

2.1 HAPE模型制備

將24只大鼠隨機(jī)分為平原對(duì)照組(Control組)、HAPE模型組(HAPE組)和BAY60-6583干預(yù)組(BAY組)，每組8只。將HAPE組和BAY組大鼠放入高原性疾病環(huán)境模擬艙內(nèi)，以10 m/s的速度升至模擬海拔6 000 m，維持48 h；Control組大鼠常氧飼養(yǎng)48 h。出艙后BAY組腹腔注射BAY60-6583[2 mg/(kg·d)]，Control組和HAPE組腹腔注射等體積溶媒，持續(xù)3 d。

2.2 肺含水量測(cè)定

各組動(dòng)物用10%水合氯醛(0.3 mL/200 g)麻醉后，剖開(kāi)胸腔，取出雙側(cè)肺葉，小心剔除肺外組織，分離左肺上葉，用電子天平稱肺濕重后，置于80 ℃恒溫干燥箱48 h烘干至恒重，稱肺干重。計(jì)算肺含水量[肺含水量=(肺濕重-肺干重)/肺濕重]。其余的肺葉一部分用于病理觀察，一部分-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 肺組織病理觀察

分離右肺上葉，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋，制成片厚約4 μm的HE染色切片，于光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

2.4 血清和肺組織中TNF-α和IL-6含量測(cè)定

在解剖大鼠前采集血液3～5 mL，室溫自然凝固后離心10 min(3 500 r/min)，收集血清。將凍存的右肺下葉室溫冰浴下解凍后稱取適量肺組織，制成10%勻漿液，低溫離心機(jī)3 500 r/min離心15 min，收集上清液。按所選TNF-α和IL-6試劑盒說(shuō)明書測(cè)定血清和肺組織中TNF-α和IL-6的含量。

2.5 肺組織和心臟組織中SOD活性和MDA含量測(cè)定

將肺組織和心臟組織分別制成組織勻漿，收集上清液。按照所選SOD和MDA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定肺組織和心臟組織中SOD活性和MDA含量。

2.6 肺組織中cAMP水平測(cè)定

將肺組織和制成組織勻漿，收集上清液。按所選cAMP試劑盒說(shuō)明書測(cè)定肺組織中cAMP水平。

2.7 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)ENaC-α基因相對(duì)表達(dá)量

將凍存的肺組織制成組織勻漿，用RNA提取液提取肺組織中的總RNA，純化后定量RNA濃度。用表1所示的引物進(jìn)行擴(kuò)增，熒光定量PCR儀檢測(cè)ENaC-α和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)mRNA，用GAPDH mRNA表達(dá)情況歸一化數(shù)據(jù)，并以相對(duì)于對(duì)照組的倍數(shù)變化情況來(lái)表示ENaC-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 ENaC-α和GAPDH的引物序列

2.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)ENaC-α蛋白相對(duì)含量

將凍存的肺組織制成組織勻漿，提取蛋白質(zhì)，并用二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，然后用5%脫脂奶粉封閉30 min，將封閉好的聚偏二氟乙烯膜與兔抗ENaC-α多克隆抗體(1∶1 000稀釋)孵育，4 ℃下過(guò)夜；然后與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔二抗(1∶3 000稀釋)在室溫下反應(yīng)30 min。用底物化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)標(biāo)記的條帶，并通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行可視化，用Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肺含水量

如表2所示。與Control組相比，HAPE組大鼠肺含水量明顯增多(P=0.012)；與HAPE組相比，BAY組大鼠的肺含水量明顯降低(P=0.006)；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 肺含水量

3.2 肺組織HE染色

如圖1所示，Control組(圖1A)大鼠肺泡腔內(nèi)無(wú)分泌物，肺泡壁完整，壁薄，無(wú)充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及紅細(xì)胞滲出。HAPE組(圖1B)大鼠肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)滲出物及大量炎癥細(xì)胞、紅細(xì)胞滲出，部分肺間隔增厚；支氣管上皮雜亂，支氣管腔狹窄、變形，大量炎性細(xì)胞聚集。與HAPE組相比，BAY組(圖1C)肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)滲出明顯減輕，肺泡腔內(nèi)未見(jiàn)明顯水腫、滲出、出血，肺泡結(jié)構(gòu)完整；支氣管結(jié)構(gòu)較完整，有少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 肺組織HE染色(400倍)注：A：Control組；B：HAPE組；C：BAY組。

3.3 炎癥因子TNF-α和IL-6水平

如圖2和圖3所示，與Control組相比，HAPE組大鼠血清中TNF-α(P=0.004)及IL-6(P=0.02)水平升高，肺組織中TNF-α(P=0.012)及IL-6(P=0.032)水平升高；與HAPE組相比，BAY組大鼠血清中TNF-α(P=0.022)及IL-6(P=0.024)水平顯著降低，肺組織中TNF-α(P=0.012)及IL-6(P=0.048)水平顯著降低；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 血清中TNF-α及IL-6水平檢測(cè)結(jié)果注：與Control組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與HAPE組相比，#表示P<0.05。

圖3 肺組織中TNF-α及IL-6水平檢測(cè)結(jié)果注：與Control組相比，*表示P<0.05；與HAPE組相比，#表示P<0.05。

3.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD活性和MDA含量

如圖4和圖5所示，與Control組相比，HAPE組大鼠肺組織中SOD活性降低(P=0.012)，MDA含量升高(P=0.002)，心臟組織中SOD活性降低(P=0.026)，MDA含量升高(P=0.025)；與HAPE組相比，BAY組大鼠肺組織中SOD活性升高(P=0.002)，MDA含量降低(P=0.032)，心臟組織中SOD活性升高(P=0.016)，MDA含量降低(P=0.011)；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 肺組織中SOD活性及MDA含量檢測(cè)結(jié)果注：與Control組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與HAPE組相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

圖5 心臟組織中SOD活力及MDA含量檢測(cè)結(jié)果注：與Control組相比，*表示P<0.05；與HAPE組相比，#表示P<0.05。

3.5 肺組織中cAMP水平

如圖6所示，與Control組相比，HAPE組大鼠肺組織中cAMP水平較低，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.264)；與HAPE組相比，BAY組大鼠肺組織中cAMP水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)。

3.6 肺組織中ENaC-α mRNA相對(duì)表達(dá)量

如圖7所示，與Control組相比，HAPE組大鼠肺組織ENaC-α mRNA相對(duì)表達(dá)量降低(P=0.042)；與HAPE組相比，BAY組大鼠肺組織ENaC-α mRNA相對(duì)表達(dá)量升高(P=0.033)；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖7 肺組織中ENaC-α基因相對(duì)表達(dá)量注：與Control組相比，*表示P<0.05；與HAPE組相比，#表示P<0.05。

3.7 肺組織中ENaC-α蛋白表達(dá)量

如圖8所示，與Control組相比，HAPE組大鼠肺組織ENaC-α的蛋白含量降低(P=0.045)；與HAPE組相比，BAY組大鼠肺組織ENaC-α蛋白含量升高(P=0.032)；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖8 肺組織中ENaC-α蛋白含量注：與Control組相比，*表示P<0.05；與HAPE組相比，#表示P<0.05。

4 討論

本研究首次證明了A2BAR激動(dòng)劑BAY60-6583能減輕HAPE大鼠模型的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激情況，能增加肺組織中的ENaC-α含量從而增加肺泡液的清除，減輕肺水腫。

有研究發(fā)現(xiàn)HAPE患者體內(nèi)炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄mRNA增多，這些mRNA通過(guò)調(diào)節(jié)縫隙連接的表達(dá)和內(nèi)皮的激活，形成了內(nèi)皮通透性和液體滲漏的正前饋環(huán)；研究還發(fā)現(xiàn)HAPE患者體內(nèi)TNF-α和IL-6含量增加，增加了肺血?dú)馄琳系耐ㄍ感訹6]。雖然炎癥并不是HAPE形成的原因，但由缺氧誘導(dǎo)的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞破裂、內(nèi)源性損傷物質(zhì)和活性氧的釋放均可觸發(fā)炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)又會(huì)反過(guò)來(lái)加重HAPE的肺損傷。而A2BAR在急性肺損傷中具有抗炎作用，可減弱肺中性粒細(xì)胞的聚集和肺內(nèi)細(xì)胞因子水平，維持內(nèi)皮屏障，從而減少白蛋白滲漏，提高生存率[7-9]。在本研究中，HAPE組大鼠血清和肺組織中炎癥因子(TNF-α和IL-6)含量均明顯高于Control組，而B(niǎo)AY組大鼠血清和肺組織中炎癥因子水平明顯低于HAPE組，說(shuō)明BAY60-6583可減輕HAPE大鼠的炎癥反應(yīng)。

HAPE的發(fā)生與高原急性缺氧所致的氧化應(yīng)激作用有著密切的關(guān)系。高原缺氧能使機(jī)體產(chǎn)生過(guò)量的氧自由基，使脂質(zhì)過(guò)氧化作用明顯增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能紊亂。SOD活性和MDA含量均可反映機(jī)體的氧化應(yīng)激程度，SOD活性越低、MDA含量越高，說(shuō)明機(jī)體受到氧自由基攻擊越多，氧化應(yīng)激程度越高。肺臟作為直接感知氧濃度變化的器官，對(duì)氧化應(yīng)激較為敏感[10]。在本研究中，與Control組相比，HAPE組大鼠肺組織和心臟組織中SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高；而與HAPE組相比，BAY組大鼠心肺組織的SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低。說(shuō)明BAY60-6583能通過(guò)刺激A2BAR來(lái)減輕HAPE大鼠的氧化應(yīng)激。

肺泡液清除是肺泡上皮，特別是Ⅱ型肺泡上皮的主要功能。在Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞上有許多通道參與肺泡液清除，包括頂端的ENaC、基底側(cè)的Na+-K+-ATP酶和水通道蛋白等[11-12]。經(jīng)ENaC的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)是Ⅱ型肺泡上皮Na+和液體運(yùn)輸?shù)闹饕?qū)動(dòng)和限速步驟[12-15]。肺ENaC可受到多種因子的調(diào)節(jié)，許多藥物均能刺激cAMP產(chǎn)生進(jìn)而通過(guò)蛋白激酶A途徑和交換被cAMP信號(hào)直接激活的蛋白來(lái)增強(qiáng)肺泡液清除[16-17]。A2BAR能與Gs蛋白相互作用激活觸發(fā)腺苷酸環(huán)化酶使cAMP升高[18]。由于A2BAR在肺泡上皮細(xì)胞高表達(dá)，而cAMP是Na+通過(guò)肺泡上皮轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，本研究假設(shè)肺泡上皮A2BAR有助于肺泡液平衡，從而可治療HAPE。

ENaC由三個(gè)亞基構(gòu)成，分別為α、β、γ亞基，在Ⅱ型肺泡上皮中，表達(dá)量最多且承擔(dān)最多離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能的是ENaC-α，遠(yuǎn)高于其他兩個(gè)亞基。本研究使用了A2BAR激動(dòng)劑BAY60-6583來(lái)研究其通過(guò)cAMP對(duì)ENaC-α和肺含水量的影響，進(jìn)而研究其對(duì)HAPE大鼠肺水腫的清除能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組相比，HAPE組大鼠肺組織中cAMP含量降低，ENaC-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白含量均明顯降低，肺含水量明顯升高；而與HAPE組相比，BAY組大鼠肺組織中cAMP含量明顯升高，ENaC-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白含量均明顯升高，肺含水量明顯降低。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明BAY60-6583能通過(guò)激活A(yù)2BAR來(lái)增加cAMP的含量，進(jìn)而增加ENaC-α的mRNA和蛋白含量，從而減少肺組織含水量，清除肺水腫，對(duì)HAPE大鼠起到治療作用。

除肺泡上皮外，其他細(xì)胞上的A2BAR對(duì)缺氧也有保護(hù)作用。在高原環(huán)境下，紅細(xì)胞上的A2BAR被激活，誘導(dǎo)產(chǎn)生2，3-雙磷酸甘油酸并觸發(fā)釋放O2，以防止組織缺氧和肺血管滲漏[19]。另一研究表明，CD73依賴的血漿腺苷信號(hào)升高可通過(guò)A2BAR來(lái)調(diào)節(jié)紅細(xì)胞的平衡核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體，增強(qiáng)缺氧反應(yīng)以更快地適應(yīng)海拔升高[20]。這說(shuō)明A2BAR除了可治療高原低壓低氧引起的肺水腫外，還能通過(guò)其他的機(jī)制加快機(jī)體的高原適應(yīng)，在預(yù)防高原性疾病(如急性高山病、HAPE和高原腦水腫)方面可能也有很大的潛力。

綜上所述，本研究提示BAY60-6583可通過(guò)激活A(yù)2BAR減少HAPE的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，增加肺組織內(nèi)cAMP含量進(jìn)而上調(diào)肺組織中ENaC-α的表達(dá)，促進(jìn)肺泡液的清除，從而治療HAPE。但除了能治療HAPE外，A2BAR還能增強(qiáng)缺氧反應(yīng)以使機(jī)體更快適應(yīng)升高的海拔，或可能預(yù)防高原性疾病。鑒于目前能預(yù)防和治療高原性疾病的藥物并不多，A2BAR在這兩方面的潛在價(jià)值值得深入研究。