水稻三系不育系的分子設(shè)計(jì)改良與應(yīng)用

柳武革，王 豐，李金華，朱滿山，廖亦龍，付崇允，劉迪林，曾學(xué)勤，馬曉智，霍 興，孔 樂(lè)

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/廣東省水稻育種新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省水稻工程實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

“民以食為天，食以稻為先”。水稻是我國(guó)重要的糧食作物之一，其種植面積占糧食作物播種面積的25%左右，稻谷產(chǎn)量占糧食總產(chǎn)的35%以上，全國(guó)近六成以上的人口以稻米為主食，也是廣東省最重要的糧食作物［1］。2021 年中央一號(hào)文件明確提出要提升糧食和重要農(nóng)產(chǎn)品供給保障能力，打好種業(yè)翻身仗。

廣東地處我國(guó)南端，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，氣溫高，降水多，臺(tái)風(fēng)出現(xiàn)頻繁。高溫多濕的氣候?qū)е滤旧a(chǎn)上的病蟲害發(fā)生偏重。稻瘟病是影響廣東省水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害之一，尤其以山區(qū)和早稻發(fā)生嚴(yán)重，造成產(chǎn)量損失通常為10%～20%［2］。此外，白葉枯病也是廣東省水稻生產(chǎn)僅次于稻瘟病的主要病害之一［3］。每年9—10 月臺(tái)風(fēng)肆虐，葉片損傷，白葉枯病菌趁機(jī)侵染，造成病害流行。近年來(lái)，廣東晚稻白葉枯病發(fā)生偏嚴(yán)重。實(shí)踐表明，利用品種本身的抗病性防治病害是最經(jīng)濟(jì)、最簡(jiǎn)便而又立竿見(jiàn)影的技術(shù)措施［4］。

隨著水稻基因組重測(cè)序、功能基因組和基因組大數(shù)據(jù)庫(kù)的深入研究，大量的抗病蟲、耐逆、品質(zhì)等優(yōu)異基因被定位或克隆［5］，通過(guò)分子育種策略導(dǎo)入有利基因創(chuàng)制優(yōu)異材料已經(jīng)付諸實(shí)踐之中。陳志偉等［6］通過(guò)分子設(shè)計(jì)育種培育出攜有Pi-2、Pi-1、Pi-Kh、Xa21、Xa23基因的兩系不育系禾9S；金素娟等［7］通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將Pi-1基因?qū)雰上挡挥礕D-8S 中；柳武革等［8］通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將Pi-1、Pi-2基因?qū)霚孛艉瞬挥礕D-7S 中培育出RGD-7S；張亞?wèn)|等［9］等通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)聚合低直鏈淀粉含量基因Wx-mp、香味基因fgr、稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-b等4 個(gè)基因，選育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗、早熟的水稻新品系南粳58。

近年來(lái)廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所在水稻三系不育系選育方面取得了卓越的成效［10］，優(yōu)質(zhì)三系不育系榮豐A 就是代表性成果之一［11］。利用榮豐A 與不同恢復(fù)系組配出26 個(gè)不同類型的雜交稻組合通過(guò)國(guó)家和省級(jí)審定，在全國(guó)累計(jì)推廣種植493 萬(wàn)多hm2。然而，隨著時(shí)間的推移，部分雜交稻組合已經(jīng)在某些稻區(qū)出現(xiàn)稻瘟病抗性下降的現(xiàn)象。因此，有必要通過(guò)分子育種技術(shù)精準(zhǔn)導(dǎo)入抗病基因，加快選育新的具有持久抗病特性和優(yōu)質(zhì)食味的不育系。

我們從2004 年開(kāi)始，著手對(duì)優(yōu)良三系不育系榮豐A 的保持系榮豐B 進(jìn)行分子設(shè)計(jì)改良，經(jīng)過(guò)17 年的努力，先后育成4 個(gè)不育系通過(guò)技術(shù)鑒定，配組了18 個(gè)雜交稻組合通過(guò)廣東省品種審定。

1 三系不育系的分子改良策略和育種實(shí)踐

為進(jìn)一步提升榮豐A 的抗性和稻米品質(zhì)，我們提出通過(guò)分子設(shè)計(jì)育種策略，將來(lái)源于BL122的2 個(gè)抗稻瘟病基因（Pi-1、Pi-2）、來(lái)源于CBB23 的抗白葉枯病基因（Xa-23）和來(lái)自粵豐B的降低直鏈淀粉含量基因（Wxb），分別導(dǎo)入至其保持系榮豐B 中。采用的方法是先將1～2 個(gè)優(yōu)良基因定向回交導(dǎo)入，然后再雜交聚合，最后再回交轉(zhuǎn)育成不育系的技術(shù)路線（圖1）。通過(guò)多次回交和自交，并結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，將稻瘟病抗病基因Pi-1導(dǎo)入后育成吉豐B，然后與榮豐A 雜交及連續(xù)回交，最終轉(zhuǎn)育成不育系吉豐A；將Pi-1和Pi-2導(dǎo)入榮豐B，育成攜帶Pi-1和Pi-2的安豐B，然后與榮豐A 雜交及回交，最終轉(zhuǎn)育成不育系安豐A。同時(shí)也將白葉枯病抗性基因Xa23和低直鏈淀粉基因Wxb分別導(dǎo)入榮豐B 中，育成攜帶Pi-1、Pi-2和Xa23的保持系榮3B，然后與榮豐A 雜交及連續(xù)回交，最終轉(zhuǎn)育成不育系榮3A；將攜帶Pi-1的吉豐B 和榮豐B-Wxb雜交聚合Pi-1和Wxb育成粵禾B，然后轉(zhuǎn)育成不育系粵禾A。現(xiàn)將4 個(gè)不育系的選育過(guò)程詳述如下：

圖1 三系不育系的分子設(shè)計(jì)改良育種程序Fig.1 Improved breeding procedure of molecular design for CMS lines

1.1 吉豐A 和安豐A 的分子育種過(guò)程

2004 年晚季利用榮豐B 與攜帶廣譜抗瘟基因的材料BL122 雜交，2005 年早季種植F1代，并以其作父本再與榮豐B 回交；2005 年晚季種植BC1F1，利用與Pi-1緊密連鎖的SSR 標(biāo)記RM144［12］、與Pi-2緊密連鎖的SSR 標(biāo)記AP22［13］對(duì)回交群體單株進(jìn)行PCR 檢測(cè)，選擇攜帶有兩個(gè)基因的單株，以其作父本繼續(xù)與榮豐B回交，2006 年早季種植BC2F1代和利用分子標(biāo)記檢測(cè)分析，同樣選擇攜帶有兩個(gè)目的基因的單株繼續(xù)與榮豐B 回交，2006 年晚季種植BC3F1代，結(jié)合分子標(biāo)記檢測(cè)選擇攜帶有兩個(gè)目的基因的單株繼續(xù)與榮豐B 回交，2007 年1 月在海南三亞種植BC4F1代回交群體，經(jīng)分子標(biāo)記檢測(cè)分析，選擇攜帶有兩個(gè)目的基因農(nóng)藝性狀優(yōu)良的單株，成熟后收獲種子。2007 年4 月在廣州種植所選的4個(gè)攜帶有兩個(gè)目的基因的單株BC4F2代群體，插秧后分別對(duì)各單株取樣抽提DNA 并進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)分析，篩選出Pi-1、Pi-2兩個(gè)基因純合的、株葉形態(tài)較好、柱頭白色的優(yōu)良單株6 個(gè)，Pi-1純合且株葉形態(tài)和生育期等性狀與原始榮豐B 最為接近的單株16 個(gè)。

2007 年晚季所有這些單株與榮豐A 雜交，2008 年1 月在海南三亞加代種植所有雜交F1及其相應(yīng)父本（保持系），并鏡檢F1的花粉育性，選擇花藥呈水澤狀、敗育徹底的單株作進(jìn)一步的成對(duì)回交；之后不斷進(jìn)行雜交和回交，2011 年晚季在廣州種植BC8F1世代，不育系和保持系表現(xiàn)整齊度好，異交習(xí)性好、繁種產(chǎn)量較高。最終將含有Pi-1基因的不育系定名為吉豐A，含有Pi-1、Pi-2兩個(gè)基因的不育系定名為安豐A。2011 年6月吉豐A 和安豐A 通過(guò)廣東省種子管理總站組織的不育系技術(shù)鑒定。

1.2 粵禾A 的分子育種過(guò)程

2008 年早季利用吉豐B 與直鏈淀粉含量較低、米飯飯味佳的保持系中間材料（榮豐B//天豐/粵豐B）雜交，當(dāng)年晚季種植F1代。2009 年早季單株種植F2代960 株，插秧15 d 后，對(duì)所有單株進(jìn)行Pi-1和Wxb分子標(biāo)記檢測(cè)，選擇兩個(gè)基因純合、農(nóng)藝性狀較好的單株23 個(gè)；同年晚季繼續(xù)種植F3代株系。2010 年早季種植F4代株系，抽穗后選擇抽穗較整齊一致群體中的優(yōu)良單株與安豐A成對(duì)測(cè)交16對(duì)，2010年晚季種植測(cè)交F1代，抽穗后對(duì)每個(gè)單株鏡檢，選擇花藥呈水澤狀、花粉敗育徹底的單株與其對(duì)應(yīng)的F5代株系父本繼續(xù)成對(duì)回交，之后不斷進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育工作。于2016年育成農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的不育系和保持系，定名為粵禾A 和粵禾B，2018 年10 月通過(guò)廣東省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)辦公室組織的不育系鑒定。

1.3 榮3 A 的分子育種過(guò)程

2007 年晚季，以榮豐B6/CBB23 的BC6F2世代抗白葉枯病的優(yōu)良單株為母本，與榮豐B4/BL122 的BC4F2世代Pi-1、Pi-2的兩個(gè)基因純合的優(yōu)良單株為父本，通過(guò)雜交聚合白葉枯病基因Xa23、稻瘟病基因Pi1、Pi2等3 個(gè)基因，2008年早季種植F1世代，晚季種植F2群體，繼續(xù)分子標(biāo)記輔助選擇篩選三基因純合優(yōu)良單株，2009年早季繼續(xù)種植F3代，并進(jìn)一步進(jìn)行白葉枯病接種鑒定和分子標(biāo)記檢測(cè)，確保3 個(gè)基因的純合。

從2009 年晚季開(kāi)始選擇多個(gè)優(yōu)良株系與穗豐A 雜交，2010 年早季種植所有雜交F1及其相應(yīng)父本（保持系），并鏡檢F1的花粉育性，選擇花藥呈水澤狀、敗育徹底的單株作進(jìn)一步的成對(duì)回交；之后不斷進(jìn)行花粉鏡檢和回交轉(zhuǎn)育工作。

2015 年早季不育系和保持系農(nóng)藝性狀穩(wěn)定，初步暫定名為榮3A 和榮3B。2018 年10 月通過(guò)廣東省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)辦公室組織的不育系鑒定。

2 改良不育系的特性

2.1 農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

榮豐A 及系列衍生不育系的農(nóng)藝性狀和抗病性表現(xiàn)如表1 所示。這5 個(gè)不育系的株高變幅為64.8～68.6 cm，每株穗數(shù)變幅7.8～9.3 條，千粒重變幅23.8～24.8 g。田間種植表現(xiàn)株型集散適中，分蘗力較強(qiáng)，劍葉挺直。吉豐A 和粵禾A 葉緣紫色，柱頭和稃尖紫色，安豐A 和榮3A 葉緣淺綠色，柱頭和稃尖無(wú)色?；ㄋ幊仕疂n狀，花粉敗育以典敗為主，開(kāi)花習(xí)性好，異交結(jié)實(shí)率達(dá)60%以上，繁、制種產(chǎn)量高，一般單產(chǎn)可達(dá)200 kg/667m2以上。在生育期方面，吉豐A、安豐A 和粵禾A 等3 個(gè)不育系的播始?xì)v期與榮豐A 相當(dāng)，榮3A 的播始?xì)v期比榮豐A 長(zhǎng)5～7 d。

表1 榮豐A 衍生系列不育系的農(nóng)藝性狀和抗病性表現(xiàn)Table 1 Agronomic traits and disease resistance of Rongfeng A and improved CMS lines derived from it

2.2 抗病性和品質(zhì)表現(xiàn)

吉豐A、安豐A、粵禾A 和榮3A 的稻瘟病人工接種鑒定總抗性頻率為93.3%～100%，比榮豐A 的82.3%明顯提高。結(jié)合田間抗性，4 個(gè)改良不育系的稻瘟病綜合評(píng)價(jià)為高抗，而榮豐A 僅為中抗。此外，榮3A 由于導(dǎo)入了白葉枯病抗性基因，對(duì)白葉枯病也表現(xiàn)高抗。

經(jīng)農(nóng)業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（杭州）檢測(cè)，主要品質(zhì)性狀結(jié)果見(jiàn)表2?；浐藺 導(dǎo)入了低直鏈淀粉含量基因Wxb，測(cè)定的直鏈淀粉含量為13.8%，顯著低于其他4 個(gè)不育系的24.7%～26.9%。同時(shí)粵禾A 的膠稠度顯著提高，米飯的口感大幅度改善。

表2 榮豐A 及衍生系列不育系的稻米品質(zhì)性狀表現(xiàn)Table 2 Rice quality traits of Rongfeng A and improved CMS lines derived from it

3 配組應(yīng)用

3.1 區(qū)試產(chǎn)量表現(xiàn)

截至2021 年，僅本團(tuán)隊(duì)利用吉豐A、安豐A、粵禾A 和榮3A 這4 個(gè)不育系先后選育了18 個(gè)品種通過(guò)廣東省品種審定（表3）。18 個(gè)品種在廣東省區(qū)試中的產(chǎn)量變幅為406.86～541.10 kg/667m2，比對(duì)照增產(chǎn)幅度為-3.55%～14.30%。其中，兩年區(qū)試平均比對(duì)照增產(chǎn)3%以上的品種有13 個(gè)，占比72.22%；平均比對(duì)照增產(chǎn)8%以上的品種有8個(gè)，占比44.44%，表現(xiàn)豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)性較好。這些組合大多數(shù)已經(jīng)在華南稻區(qū)大面積推廣應(yīng)用。

表3 改良不育系所配組合在廣東省區(qū)試中的產(chǎn)量和稻瘟病抗性表現(xiàn)Table 3 Yield and blast resistance of the hybrids derived from improved CMS lines in the regional trials of Guangdong Province

3.2 抗病性表現(xiàn)

18 個(gè)組合先后在不同年份參加了廣東省雜交稻區(qū)試的初試和復(fù)試，每個(gè)組合均進(jìn)行了兩次抗病性鑒定。結(jié)果（表3）表明，18 個(gè)組合36 次人工接種鑒定總抗性頻率的變幅為75.0%～100%，葉瘟發(fā)病1.0～3.1 級(jí)，穗瘟發(fā)病1.0～5.0 級(jí)。綜合評(píng)價(jià)表現(xiàn)為中抗有8 次，占比22.2%，表現(xiàn)抗級(jí)的10 次，占比27.8%，表現(xiàn)高抗的18 次，占比50%。說(shuō)明這些不育系導(dǎo)入稻瘟病抗性基因后，由其組配的雜交稻組合均表現(xiàn)出較好的稻瘟病抗性。此外，榮3 優(yōu)1002 由于母本含有白葉枯病基因Xa23，表現(xiàn)高抗稻瘟病，抗白葉枯病。

3.3 農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

改良不育系組配的18 個(gè)組合在廣東省區(qū)試中農(nóng)藝性狀表現(xiàn)列于表4。所有組合的株高變幅為94.1～107.2 cm，有效穗數(shù)變幅16.1 萬(wàn)～19.4 萬(wàn)條/667m2，穗長(zhǎng)變幅20.1～22.6 cm，每穗總粒數(shù)變幅129.5～156.5 粒，每穗實(shí)粒數(shù)變幅109.0～130.0粒，結(jié)實(shí)率變幅78.6%～85.6%，千粒質(zhì)量變幅24.3～30.7 g。這些組合在大田生產(chǎn)種植，表現(xiàn)株葉形態(tài)集散適中，劍葉挺直，莖稈較粗壯，韌性好，后期熟色好，抗倒性強(qiáng)。

表4 改良不育系所配組合在廣東省區(qū)試中的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)Table 4 Agronomic traits of the hybrids derived from improved CMS lines in the regional trials of Guangdong Province

4 討論

一直以來(lái)，稻瘟病在我國(guó)水稻種植區(qū)均有不同程度發(fā)生，給水稻生產(chǎn)造成巨大的產(chǎn)量損失。很多省份在水稻品種的審定環(huán)節(jié)中，對(duì)稻瘟病綜合評(píng)價(jià)表現(xiàn)感或高感的品種實(shí)行一票否決不予審定。最近，國(guó)家農(nóng)作物品種審定委員會(huì)已經(jīng)修訂國(guó)家水稻品種審定標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步提高了不同稻作區(qū)的稻瘟病抗性審定標(biāo)準(zhǔn)。很多高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種經(jīng)常因?yàn)榈疚敛】剐圆贿^(guò)關(guān)，導(dǎo)致無(wú)法通過(guò)審定。因此，育種家必須對(duì)稻瘟病抗性給予足夠的重視。

隨著生物技術(shù)手段的發(fā)展，科學(xué)家已經(jīng)定位至少100 多個(gè)稻瘟病抗性基因，其中有36 個(gè)已經(jīng)克隆［14］，為稻瘟病抗性的分子設(shè)計(jì)育種奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。由于不同稻作區(qū)的稻瘟病生理小種差異很大，復(fù)雜多變，不同抗性基因在不同稻作區(qū)抗性表現(xiàn)也有差異。多個(gè)研究表明，Pi-1和Pi-2基因?qū)?lái)自不同稻作區(qū)的生理小種具有比較好的抗性。Chen 等［15］利用我國(guó)南方稻區(qū)715 個(gè)稻瘟病菌株對(duì)攜帶不同抗性基因的鑒別品種進(jìn)行接種鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶Pi-1品種的抗性頻率為92.45%，攜帶Pi-2品種的抗性頻率為89.65%，同時(shí)攜帶兩個(gè)抗性基因的品種抗性頻率為98.04%。朱小源等［16］采用146 個(gè)來(lái)自廣東不同稻區(qū)的稻瘟病生理小種對(duì)多個(gè)單基因系接種，結(jié)果Pi-1的抗性頻率為80.1%，Pi-2的抗性頻率為48.6%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)抗性基因具有很好的互補(bǔ)性［16-17］，推薦在華南稻區(qū)優(yōu)先考慮使用。

我們從2001 開(kāi)始，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇將Pi-1基因定向?qū)雰上挡挥礕D-8S 中，不同改良株系的抗性頻率為75.76%～100%［7］。之后，又通過(guò)雜交、回交結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，將Pi-1和Pi-2兩個(gè)基因聚合導(dǎo)入溫敏核不育系GD-7S 中，5 個(gè)改良株系的抗性頻率為94.12%～97.06%［8］。其中一個(gè)株系命名為RGD7S，于2012 年10 月通過(guò)廣東省種子管理總站組織的不育系技術(shù)鑒定。利用RGD7S 先后組配了聚兩優(yōu)750 和聚兩優(yōu)747 通過(guò)省級(jí)品種審定，均表現(xiàn)抗稻瘟病。多年的育種實(shí)踐表明，Pi-1和Pi-2基因在南方稻區(qū)具有較為持久的抗性。本研究通過(guò)三系保持系的系統(tǒng)改良，育成了4 個(gè)不育系，其中吉豐A 和粵禾A 只含有Pi-1，安豐A 和榮3A 含有Pi-1和Pi-2基因。利用這4 個(gè)不育系選育的18 個(gè)省級(jí)審定雜交稻組合稻瘟病綜合評(píng)價(jià)均在中抗以上，進(jìn)一步證實(shí)Pi-1和Pi-2基因在雜交稻中的利用價(jià)值。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì)三系保持系和不育系的改良也有一些報(bào)道。劉士平等［12］利用分子標(biāo)記輔助選擇將Pi-1導(dǎo)入保持系珍汕97B 中，獲得了17個(gè)抗性顯著改良的含有目標(biāo)基因的株系。涂世航等［18］將Pi25導(dǎo)入保持系福稻B 中選育出抗稻瘟病不育系CP4A；張禮霞等［19］通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇導(dǎo)入Pigm基因改良粳稻保持系；董瑞霞等［20］通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇將谷梅2 號(hào)的Pi25導(dǎo)入保持系臻達(dá)B，回交轉(zhuǎn)育獲得稻瘟病抗性強(qiáng)的不育系157A。吳婷婷等［21］將廣譜持久抗稻瘟病基因Pi9的導(dǎo)入三系保持系豐源B，育成高抗稻瘟病的豐源A-Pi9-5。伍豪等［22］將抗白葉枯病基因Xa7導(dǎo)入優(yōu)質(zhì)保持系美B 中。

本研究改良的保持系為本團(tuán)隊(duì)自主培育的三系不育系榮豐A 的保持系榮豐B。榮豐A 異交結(jié)實(shí)率高、配合力強(qiáng)，由其組配的雜交稻組合抗倒性好、耐高低溫、不易落粒、后期轉(zhuǎn)色好。為了進(jìn)一步延長(zhǎng)該不育系的使用壽命，我們將抗稻瘟病基因、抗白葉枯病基因、低直鏈淀粉含量基因等一個(gè)或多個(gè)優(yōu)良基因?qū)?，育成? 個(gè)不育系通過(guò)技術(shù)鑒定。通過(guò)全基因組芯片掃描分析，這4 個(gè)不育系與榮豐A 的相似度均在90%以上，農(nóng)藝性狀也比較接近。由它們組配的雜交稻組合也保留了榮豐A 雜交稻組合的優(yōu)點(diǎn)，得到了市場(chǎng)的廣泛認(rèn)可。到目前為止，吉豐優(yōu)華占累計(jì)推廣面積超過(guò)3.33 萬(wàn)hm2，吉豐優(yōu)1002 被認(rèn)定為超級(jí)稻，2019 年開(kāi)始成為國(guó)家和廣東省區(qū)試晚秈感光組的對(duì)照品種，累計(jì)推廣面積超過(guò)13.33 萬(wàn)hm2。

隨著更多調(diào)控水稻產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆、營(yíng)養(yǎng)高效等重要農(nóng)藝性狀的關(guān)鍵基因的解析［11,22］，育種家們將會(huì)進(jìn)一步建立高效精準(zhǔn)的水稻設(shè)計(jì)育種體系，緊密結(jié)合水稻常規(guī)育種和雜種優(yōu)勢(shì)利用技術(shù)，培育出一系列高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)多抗新品種，為解決我國(guó)糧食安全問(wèn)題提供有效策略。