光誘導(dǎo)對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞自噬和凋亡的影響

高園園 李娟 雒玉 李武軍 俞洋

作者單位：1寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2榆林市中醫(yī)醫(yī)院眼科，榆林 719000；3中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第941醫(yī)院質(zhì)量管理科，西寧 810000

光是哺乳動物視覺形成的必要條件，視網(wǎng)膜是含有最高內(nèi)源性光敏劑的組織，可以被光激發(fā)，因此對光損傷高度敏感，過度的光照會對視網(wǎng)膜色素上皮層和感光細(xì)胞造成不同程度的損害[1]，臨床可表現(xiàn)為視力下降甚至致盲[2]。研究發(fā)現(xiàn)過強的光照或長時間的光照會加速光感受器變性，可直接損傷視網(wǎng)膜神經(jīng)元，導(dǎo)致視網(wǎng)膜退行性疾病，如年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）、視網(wǎng)膜色素變性（Retinitis pigmentosa，RP）的發(fā)生、發(fā)展[3，4]。視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）是神經(jīng)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜之間含有黑色素的上皮細(xì)胞層，具有捕捉光信號并完成光電轉(zhuǎn)換，合成生長因子和其他代謝物質(zhì)，參與視色素再生，發(fā)揮血-視網(wǎng)膜屏障作用，維持光感受器的更新和吞噬作用的功能。有研究表明RPE細(xì)胞的蛋白穩(wěn)態(tài)受到干擾，會導(dǎo)致AMD玻璃膜疣的集聚[5]。AMD是引起老年人失明的首要原因[6]。隨著人口老齡化的日趨嚴(yán)重，AMD發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，預(yù)計到2040年，全球AMD的患病率將增到2.88億人[7]。AMD對老年人及其家庭的身心都有重要影響，已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題。盡管AMD的發(fā)病率高，對視力影響嚴(yán)重，但治愈的患者卻極其有限。近年來AMD已成為眼科學(xué)研究的熱點。自噬起源于希臘語，意思是自己吃自己[8]。自噬在40年前首次在視網(wǎng)膜中進(jìn)行描述[9]，自噬對維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)及其重要，在一定條件的刺激下，在自噬溶酶體或自噬囊泡的作用下，自噬通過自噬溶酶體降解清除亞細(xì)胞碎片、受損細(xì)胞器來為細(xì)胞基本生存提供必要的物質(zhì)[10，11]。但是，目前自噬與視網(wǎng)膜光損傷的關(guān)系未明確。有研究表明自噬可引發(fā)細(xì)胞凋亡并導(dǎo)致光感受器死亡[12]；自噬功能障礙誘導(dǎo)RPE細(xì)胞凋亡[13]、視網(wǎng)膜色素變性[14]，也有研究表明抑制自噬可保護(hù)光感受器免受光誘導(dǎo)的損傷[15]。為闡明光損傷中自噬與凋亡的關(guān)系，本研究采用自噬抑制劑——3甲基腺嘌呤（3 methyladenine，3MA）對ARPE-19細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，觀察光照對ARPE-19細(xì)胞的影響，研究RPE細(xì)胞光損傷中自噬及其與凋亡之間的關(guān)系并探討3MA對光誘導(dǎo)下RPE細(xì)胞自噬和凋亡的影響，以尋求治療AMD的有效策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

ARPE-19 細(xì)胞購于中國北納生物公司（編號：BNCC337713）。置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液1次，待細(xì)胞成長密度達(dá)到80%～90%時，消化細(xì)胞，進(jìn)行1∶3傳代，取對數(shù)生長期3～6代細(xì)胞用于實驗。將細(xì)胞懸液，按1×104個/孔細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μl，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實驗。

1.2 試劑和儀器

胎牛血清、DMEM/F12均購自以色列Bioind公司；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、全蛋白提取試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；3MA（A8353，美國APEXBIO公司）、LC3A-Specific Antibody、LC3B-Specific抗體、P62/SQSTM1抗體均購自中國武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；Rabbit Anti-Beclin 1 抗體購自中國Proteintech公司。Multiskan酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；FACSAriaⅡ型流式細(xì)胞檢測儀購自美國BD公司；TES-1332A數(shù)位式照度計購自臺北泰仕電子工業(yè)；透射電子顯微鏡（H7800）購自日本日立公司；無目鏡倒置熒光顯微鏡細(xì)胞成像儀（Evos FL Auto2）購自美國Thermo公司；雙光子激光共聚焦顯微鏡（FV1200MPE）購自日本OLYMPUS公司；凝膠成像分析儀（Gel Doc XR）購自美國BIORAD公司。

1.3 細(xì)胞分組

將體外培養(yǎng)人RPE細(xì)胞（ARPE-19）按隨機數(shù)字表法分為12 h對照組、12 h模型組、12 h 3MA組；24 h對照組、24 h模型組、24 h 3MA組。對照組用錫紙包裹避光培養(yǎng)；模型組接受光照刺激，3MA組中加入3 mmol/ml 3MA后接受光照刺激，以自制三基色LED（發(fā)光二極管）冷光燈作為光源，在（16 500±500）lx光照強度下照射細(xì)胞12 h和24 h。

1.4 構(gòu)建人RPE細(xì)胞光損傷模型

將3～6代對數(shù)生長期的人RPE細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，光照在培養(yǎng)箱內(nèi)密閉進(jìn)行，無自然光干擾。以自制三基色LED冷光燈作為光源，懸掛于培養(yǎng)箱內(nèi)頂端，采取直落式照射，照度計監(jiān)測光照強度，使被照細(xì)胞光照強度為（16 500±500）lx，分別照射細(xì)胞12 h和24 h。光照時，細(xì)胞平面的溫度變化控制在36.5～37.5 ℃之間，排除溫度升高引起細(xì)胞光熱損傷的可能。

1.5 透射電子顯微鏡觀察光照對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)影響

取生長狀態(tài)良好的ARPE-19細(xì)胞用于實驗。光照結(jié)束后棄去原培養(yǎng)液，二甲坤酸鈉緩沖液（0.1 mol/L）1.5 ml沖洗細(xì)胞，之后加入1 ml固定液后，轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱靜置20 min，收集細(xì)胞，置于1 000 rpm水平轉(zhuǎn)子離心10 min。棄上清，加入2%戊二醛1 ml，混勻，4 ℃冰箱中靜置固定30 min。離心，棄上清，加入2 ml緩沖液吹打混勻（重復(fù)3 次），4 ℃冰箱靜置30 min。1%鋨酸浸泡1 h，緩沖液沖洗2次，每次15 min。梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂逐級滲透，包埋后，超薄切片，醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛染色后，采用透射電子顯微鏡（Transmission electron microscopy，TEM）觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.6 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率

取生長狀態(tài)良好，且處于對數(shù)生長期的人RPE細(xì)胞用于實驗。光照處理結(jié)束后處理各組細(xì)胞，收集舊培養(yǎng)液，溫PBS洗滌2～3 遍，用0.25%不含EDTA、不含酚紅的胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞吹打混勻，制成單細(xì)胞懸液，移入相應(yīng)離心管中，1 200 rpm，離心5 min，棄上清；冷PBS 2 ml洗滌1次，輕輕混勻成單細(xì)胞懸液，1200 rpm，5 min離心后，棄上清，此步驟重復(fù)2次；將細(xì)胞懸浮于400 μl的Annexin-V結(jié)合液中，避光加入5 μl異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC），4 ℃放置15 min；上機前5 min避光加10 μl碘化丙啶（Propidium iodide，PI），在1 h內(nèi)完成流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 觀察自噬溶酶體形態(tài)并測定自噬溶酶體的生成水平

用D-Hanks梯度稀釋LysoTracker Red原液，配置成2 μmol/ml的工作液；將生長狀態(tài)良好的6孔板中的ARPE-19，去除完全培養(yǎng)基，預(yù)熱的D-Hanks輕柔洗滌2～3 次，避光下每孔中加入配置好的預(yù)熱的LysoTracker Red（2 μmol/ml）染色工作液1 ml，37 ℃黑暗條件下孵育2.5 h；去除LysoTracker Red染色工作液，預(yù)熱的D-Hanks洗滌1～2次，避光加入預(yù)熱的Hochest33258（5 μg/ml）染色工作液，孵育3～5 min，預(yù)熱的D-Hanks洗滌1～2次，加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液；采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察或倒置熒光顯微鏡觀察拍片，Image J圖像處理軟件分析熒光強度。

1.8 Western Blot法檢測Beclin1、LC3、P62、蛋白表達(dá)量

用蛋白裂解液提取各組細(xì)胞蛋白，利用BCA蛋白定量測定試劑盒對蛋白進(jìn)行定量。通過計算機調(diào)整后變性，50 μg上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，用PVDF轉(zhuǎn)膜，加入一抗，5%脫脂奶粉封閉2 h，4 ℃封閉過夜，TBST洗滌10 min，洗3次，加入二抗，37 ℃搖床孵育2 h。暗室中加發(fā)光液并進(jìn)行曝光。X光片顯影和定影后采用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗研究。采用SPSS 21.0或Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗，符合正態(tài)分布者數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊的資料比較采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行秩轉(zhuǎn)換的非參數(shù)檢驗，多個樣本間的多重比較采用SNK-q法檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光照誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞自噬形態(tài)觀察

透射電子顯微鏡對ARPE-19 細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察，如圖1所示，模型組中可見雙膜狀的典型自噬小體、自噬溶酶體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的擴(kuò)張等其他自噬特征。典型自噬小體可以將包括細(xì)胞器在內(nèi)的胞液物質(zhì)隔離在雙膜結(jié)合的小泡中，然后將其作為降解的目標(biāo)（白色箭頭所示），自噬溶酶體由單層膜包繞，其內(nèi)含有細(xì)胞器，大小不一（黑色箭頭所示）。而對照組中少見細(xì)胞自噬小體及自噬溶酶體，少見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的擴(kuò)張。這表明可見光照射可以誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞的自噬。

圖1.透射電子顯微鏡觀察光照前后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化（×5 000）A：對照組；B：模型組。白色箭頭所示為典型自噬小體，黑色箭頭所示為自噬溶酶體Figure 1.Observation of cell ultrastructural effects using transmission electron microscopy (×5 000).A:Control group.B:Model group.The white arrow indicates a typical autophagosome,the black arrow indicates autophagy-lysosome.

2.2 光照誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞自噬溶酶體形態(tài)觀察

LysoTracker Red為溶酶體熒光探針，呈紅色熒光，溶酶體以紅色顆粒狀分布在RPE細(xì)胞中，對照組細(xì)胞呈梭形或長梭形；3MA組中部分細(xì)胞變?yōu)闄E圓形且細(xì)胞間隙變寬；模型組自噬溶酶體熒光亮度增加，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)閳A形或橢圓形，且24 h的紅色顆粒多于12 h自噬溶酶體熒光染色。見圖2。這表明（16 500±500）lx光照強度可誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞的自噬，隨著光照時間的延長自噬增強。

2.3 自噬溶酶體熒光強度分析

使用Hochest33258（5 μg/ml）染色工作液對活的ARPE-19 細(xì)胞核進(jìn)行染色，LysoTracker Red（2 μmol/ml）的工作液對自噬溶酶體進(jìn)行染色，Image J對各組細(xì)胞熒光強度進(jìn)行分析，自噬溶酶體的增多反映ARPE-19 細(xì)胞的自噬增強。如圖3 所示，光誘導(dǎo)12 h后，對照組平均熒光強度為10.78±2.32，模型組平均熒光強度為63.81±0.13，3MA組平均熒光強度為24.63±1.63；光誘導(dǎo)24 h后，對照組平均熒光強度為11.34±1.31，模型組平均熒光強度為71.14±1.32，3MA組平均熒光強度為31.33±1.93。光照12 h和24 h后，3組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=931.53，P<0.001；F=1156.67，P<0.001）。24 h模型組熒光強度高于12 h模型組的熒光強度，表明隨著光照時間延長，ARPE-19細(xì)胞自噬增強。光照12、24 h后，3MA組的熒光強度介于同一時相內(nèi)對照組、模型組的熒光強度之間，這表明3MA可能抑制光誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞自噬溶酶體的生成。

圖2.光照誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞自噬溶酶體的形態(tài)學(xué)變化（×200）Figure 2.The morphological changes in autophagy-lysosome in ARPE-19 cells induced by light (×200).

2.4 3MA干預(yù)對光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞凋亡率的影響

光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞12 h，3MA組細(xì)胞凋亡率明顯高于模型組和對照組。光誘導(dǎo)ARPE-19 細(xì)胞24 h，3MA組細(xì)胞凋亡率高于對照組且低于模型組。光誘導(dǎo)12 h和24 h后，3組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=294.51，P<0.001；F=102.17，P<0.001）。這表明，光照12 h，3MA可能促進(jìn)光誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞的凋亡，光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞24 h，3MA可能抑制細(xì)胞的凋亡。見圖4。

圖3.自噬溶酶體熒光強度分析（×20）A：自噬溶酶體熒光強度分析；B：自噬溶酶體熒光強度比較。a，與光照12 h對照組相比，P<0.05；b，與光照12 h模型組相比，P<0.05；c，與光照24 h對照組相比，P<0.05；d，與光照24 h模型組相比，P<0.05。3MA，3甲基腺嘌呤Figure 3.Fluorescence intensity analysis of autophagy-lysosome (×20).A:Fluorescence intensity analysis of autophagolysosome.B:Comparison of fluorescence intensity of autophagic lysosomes.a,compared to the control group after 12 h of illumination,P<0.05;b,compared to the model group after 12 h of illumination,P<0.05;c,compared to the control group under 24 h of illumination,P<0.05;d,compared to the model group with 24 h of illumination,P<0.05.3MA,3-methyladenine.

2.5 3MA對光誘導(dǎo)ARPE-19 細(xì)胞Beclin1、LC3、P62蛋白表達(dá)的影響

在光照12、24 h的組內(nèi)比較中，與對照組相比，模型組Beclin1 蛋白表達(dá)增高（均P<0.001）、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增高（均P<0.001），P62蛋白呈低表達(dá)（均P<0.001）。這表明，與對照組相比，模型組自噬明顯被激活即光照誘導(dǎo)自噬并增加自噬通量。而光誘導(dǎo)12 h及24 h采用3MA干預(yù)后，與模型組相比，3MA 組P62 蛋白表達(dá)量明顯升高（均P<0.001），3MA組Beclin 1 的表達(dá)量下降（均P<0.001）及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值降低（均P<0.001）。這表明3MA干預(yù)可降低光誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞自噬通量。見圖5。

3 討論

圖4.3MA干預(yù)對光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞凋亡率的影響A：ARPE-19細(xì)胞凋亡率；B：ARPE-19細(xì)胞凋亡率比較。a，與光照12 h對照組相比，P<0.05；b，與光照12 h模型組相比，P<0.05；c，與光照24 h對照組相比，P<0.05；d，與光照24 h模型組相比，P<0.05；e，與光照12 h 3MA組相比，P<0.05。3MA，3甲基腺嘌呤Figure 4.Effect of 3MA intervention on light-induced apoptosis rate of ARPE-19 cells.A:The apoptosis rate of ARPE-19 cells.B:Comparison of apoptosis rate of ARPE-19 cells.a,compared to the control group after 12 h of illumination,P<0.05;b,compared to the model group under 12 h of illumination,P<0.05;c,compared to the control group under 24 h of illumination,P<0.05;d,compared to the model group with 24 h of illumination,P<0.05;e,compared to the 3MA group with 12 h,P<0.05.3MA,3-methyladenine.

圖5.3MA對光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響A：Western blot條帶；B：P62蛋白表達(dá)量；C：LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相對蛋白表達(dá)量；D：Beclin1蛋白表達(dá)量。1：12 h對照組；2：24 h對照組；3：12 h 3MA組；4：24 h 3MA組；5：12 h模型組；6：24 h模型組。a，與光照12 h對照組相比，P<0.05；b，與光照12 h模型組相比，P<0.05；c，與光照24 h對照組相比，P<0.05；d，與光照24 h模型組相比，P<0.05；e，與光照12 h 3MA組相比，P<0.05。3MA，3甲基腺嘌呤。n=3Figure 5.Effect of 3MA on the expression of autophagy-related proteins in photo-induced ARPE-19 cells.A:Western blot strip.B:P62 protein expression.C:LC3Ⅱ/LC3Ⅰ relative protein expression.D:Beclin1 protein expression.1:12 h control group;2:24 h control group;3:12 h 3MA group;4:24 h 3MA group;5:12 h model group;6:24 h model group.a,compared to the control group after 12 h of illumination,P<0.05;b,compared to the model group under 12 h of illumination,P<0.05;c,compared to the control group under 24 h of illumination,P<0.05;d,compared to the model group with 24 h of illumination,P<0.05;e,compared to the 3MA group with 12 h,P<0.05.3MA,3-methyladenine.n=3.

AMD是一種年齡相關(guān)性疾病，通常可引起視網(wǎng)膜黃斑區(qū)光感受器、RPE細(xì)胞退行性改變和新生血管生成。黃斑富含視錐細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)視覺的高分辨率及色覺辨別。隨著疾病的進(jìn)展，RPE細(xì)胞發(fā)生變性，繼而導(dǎo)致感光器的功能障礙和AMD相關(guān)的視力障礙[16]，因此 AMD可以引起嚴(yán)重的視覺障礙甚至永久失明[17]。

自噬的特征是將部分細(xì)胞質(zhì)隔離在稱為自噬小體的雙膜囊泡中，隨后與溶酶體融合，形成自噬溶酶體[18]。自噬有助于維持正常組織穩(wěn)態(tài)平衡和代謝適應(yīng)性，是不可或缺的生物學(xué)過程，但是超過一定的能力也會帶來嚴(yán)重的后果[19]。自噬有助于清除RPE細(xì)胞中的脂質(zhì)過氧化物[20]。

視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞及光感受器細(xì)胞中，自噬極其活躍，自噬功能的損害可導(dǎo)致RPE細(xì)胞早期退化變性[21]。RPE的生理功能將自噬與視網(wǎng)膜衰老性疾病及光損傷導(dǎo)致的視網(wǎng)膜退行性疾病如AMD緊密關(guān)聯(lián)。RPE細(xì)胞的退行性改變是AMD發(fā)病的主要特點[22]，過度的光照會加速RPE細(xì)胞死亡，加劇AMD的進(jìn)程。本研究結(jié)果表明，光照12 h的ARPE-19細(xì)胞自噬水平可以抵抗光損傷，而光照24 h后，自噬會在光誘導(dǎo)下?lián)p傷RPE細(xì)胞，抑制自噬對光損傷的RPE細(xì)胞具有保護(hù)作用，這與其他研究結(jié)果[15，23]一致。這可能是早期AMD的潛在治療策略。

Beclin 1 是自噬小體形成過程中的重要因素，形成復(fù)合體正向調(diào)控自噬[24]。LC3是最經(jīng)典的自噬分子標(biāo)記物[25]，能靶向定位于自噬體膜，當(dāng)自噬被激活時，胞漿內(nèi)的LC3-Ⅰ被轉(zhuǎn)化為膜結(jié)合形式的LC3-Ⅱ，通常認(rèn)為LC3-Ⅱ的增加或LC3Ⅱ/Ⅰ增高標(biāo)志著自噬體的形成[26]，反映了細(xì)胞的自噬水平增強。p62 連于LC3 的底物，被整合到自噬體中，然后與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，當(dāng)自噬激活時處于自噬囊泡中的P62 及細(xì)胞器被降解，P62 水平降低[27]，反之，當(dāng)自噬被抑制時，P62水平增高。

我們使用透射電子顯微鏡對自噬小體及自噬溶酶體進(jìn)行定性分析，使用激光共聚焦對LysoTracker染色的溶酶體進(jìn)行形態(tài)觀察，同時倒置熒光顯微鏡定量測定了自噬溶酶體的生成率，（16 500±500）lx光照射24 h后，定性分析發(fā)現(xiàn)了典型的自噬小體及自噬溶酶體，且激光共聚焦顯微鏡觀察到染色后呈紅色的自噬溶酶體明顯增多；定量分析表明光照射12 h和24 h后，模型組ARPE-19細(xì)胞的紅色熒光強度較對照細(xì)胞明顯增強，且3MA干預(yù)后細(xì)胞的熒光強度較模型組明顯降低。這些結(jié)果表明，光照射可以誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞的自噬且3MA降低了其自噬水平。

3MA 是一種經(jīng)典的自噬抑制劑，通過抑制CLASSⅢPI3K型磷脂酞肌醇激酶的活性，從而抑制自噬體的形成和自噬溶酶體對蛋白的降解功能[28]。有研究報道3MA抑制自噬可增加硝苯地平誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并下調(diào)Beclin1表達(dá)，起到防治肝炎、肝臟纖維化[15]的作用；3MA通過阻止自噬小體的形成來抑制自噬[29]，本研究使用自噬抑制劑3MA處理細(xì)胞，降低了光照刺激下（12 h和24 h）ARPE-19細(xì)胞的自噬溶酶體熒光強度。本研究的Western Blot顯示，光照12 h和24 h，模型組自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3Ⅱ的表達(dá)量均增高且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增高，P62 蛋白呈低表達(dá)。而采用3MA干預(yù)后，與對照組相比，光誘導(dǎo)12 h和24 h條件下，自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3 Ⅱ的表達(dá)量均下降且LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的比值降低，P62蛋白的表達(dá)量增高。這表明模型組自噬明顯被激活即光照誘導(dǎo)自噬并增加自噬通量，而3MA干預(yù)后抑制了細(xì)胞的自噬。

凋亡可以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，是一種程序性的細(xì)胞死亡。有研究表明，凋亡在多種疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮著不可或缺的作用，包括涉及視網(wǎng)膜變性的疾病，如AMD[30]。結(jié)合凋亡及Western Blot檢測結(jié)果，我們得出如下結(jié)論：給予ARPE-19細(xì)胞光照強度為（16 500±500）lx的可見光照射，細(xì)胞的自噬水平隨著光照時間的不同而變化，在光照12 h時，細(xì)胞的自噬水平可以對抗光損傷維持細(xì)胞的代謝，所以3MA干預(yù)后細(xì)胞凋亡率較模型組增高；光照刺激24 h后，細(xì)胞自噬水平超過其正常調(diào)節(jié)的范圍，因此3MA組細(xì)胞凋亡率低于模型組。我們猜測細(xì)胞的自噬水平不足會誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，長時間的自噬也會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[31]，使用自噬抑制劑3MA抑制光損傷誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞過度自噬，降低細(xì)胞凋亡率。

綜上所述，本研究探討了RPE細(xì)胞光損傷中自噬與凋亡之間的關(guān)系，并探討3MA對光誘導(dǎo)下RPE細(xì)胞自噬和凋亡的影響，旨在為預(yù)防AMD發(fā)生、降低罹患風(fēng)險以及開發(fā)治療AMD的天然藥物提供新的研發(fā)思路。本研究不足之處是只選取了2 個時間點來觀察細(xì)胞自噬與凋亡情況，其動態(tài)性需要進(jìn)一步的研究。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明高園園：實施研究，收集數(shù)據(jù)及資料的分析和解釋；撰寫論文；根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行修改。李娟：實驗研究，采集數(shù)據(jù)。雒玉：資料的分析和解釋。李武軍：分析解釋數(shù)據(jù)，修改論文。俞洋：參與選題、設(shè)計、資料的分析和解釋，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論，根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行核修