一種溶解氧敏感膜熒光發(fā)射效率光譜檢測(cè)系統(tǒng)的研制

乜靈梅，查 濤，夏彬標(biāo)，張 凱，管志強(qiáng)，趙友全*，袁 達(dá)，曹 煊，劉 巖

1.天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院，天津 300072 2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東科學(xué)院)海洋儀器儀表研究所，山東 青島 266061

引 言

水中溶解氧的濃度關(guān)乎水中一切生物的生存狀態(tài)，也反映了水體的污染程度。目前檢測(cè)水中溶解氧濃度的方法主要有碘量法、電極法和熒光猝滅法。其中碘量法作為國標(biāo)法，測(cè)量精度較高，但非常耗時(shí)，且操作繁瑣，不能實(shí)時(shí)在線測(cè)量[1]；Clack電極法是現(xiàn)有儀器常用方法之一[2]，此方法較國標(biāo)法檢測(cè)速度快，但電極易受到待測(cè)溶液中金屬離子、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的污染，且電極極易氧化，需要定期激活和定期更換[3]。相比之下，熒光猝滅法具有高靈敏、非接觸和長壽命的優(yōu)點(diǎn)，無需激活，容易維護(hù)。熒光猝滅法檢測(cè)溶解氧濃度包括兩種方式：基于熒光強(qiáng)度衰減[4]和基于熒光壽命導(dǎo)致的相位變化[5]，無論哪種方式，氧敏感膜的選擇都尤為重要。氧敏感膜的核心是熒光指示劑，被選擇的熒光指示劑要在特異性、靈敏度、穩(wěn)定性[6]等特性上表現(xiàn)突出，這些特性關(guān)乎氧敏感膜的檢測(cè)精度和使用壽命，熒光傳感器在選取最佳激發(fā)波長的光源和最大熒光發(fā)射效率的氧敏感膜時(shí)特性優(yōu)良。

目前，氧敏感膜的質(zhì)量評(píng)估及激發(fā)波長選擇存在以下問題：一般以傳感器探頭出售，不單獨(dú)出售氧敏感膜；氧敏感膜主要來自進(jìn)口，價(jià)格昂貴，使用期限一般定為12個(gè)月，并且未提供激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的參數(shù)；氧敏感膜的構(gòu)成比較復(fù)雜，現(xiàn)有氧敏感膜大多通過物理方法固定熒光指示劑，而這種方法生產(chǎn)的熒光膜受水體浸泡時(shí)使用壽命容易縮短，高亮度的激發(fā)光刺激亦會(huì)因光漂白導(dǎo)致氧敏感膜的壽命降低[7]。

熒光指示劑材料、基質(zhì)結(jié)構(gòu)[8-10]發(fā)生改變，激發(fā)波長和熒光發(fā)射波長也隨之發(fā)生變化，Akram[11]等選擇405 nm作為鉑(Ⅱ)卟啉共聚物指示劑的激發(fā)波長；Shehata[12]等選用430 nm的LED作為激發(fā)光源刺激氧化鈰納米粒子，在530 nm監(jiān)測(cè)發(fā)射熒光。這些激發(fā)波長的選擇方法大多基于吸收光譜[13-15]，然而，氧敏感物質(zhì)吸收光能量躍遷至激發(fā)態(tài)，再由激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)不止發(fā)射熒光，還存在磷光，甚至以無輻射形式回到基態(tài)[16]，此過程短暫不可控，無法預(yù)測(cè)各種形式的比例關(guān)系，因此該方法存在一定缺陷。有學(xué)者選用熒光分光光度計(jì)來確定激發(fā)波長[17]，筆者選用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量，未檢測(cè)到熒光信號(hào)，原因是經(jīng)分光系統(tǒng)發(fā)出的激發(fā)光太弱，熒光未激發(fā)，因此必須要增強(qiáng)激發(fā)光強(qiáng)度。

綜上，本研究基于單波長連續(xù)掃描的原理，采用高強(qiáng)度氙燈光源，構(gòu)建了氧敏感膜發(fā)射光譜和熒光光譜快速檢測(cè)裝置，提出了基于此裝置的熒光發(fā)射效率方法，實(shí)驗(yàn)測(cè)定了來自國內(nèi)外的數(shù)個(gè)氧敏感膜樣品，比較分析了氧敏感膜的發(fā)射效率。本文工作為氧敏感膜的質(zhì)量評(píng)測(cè)、傳感器設(shè)計(jì)選型和優(yōu)化、以及制造工藝材料研究提供必要的測(cè)試數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原理

氧敏感膜的工作原理如圖1所示，經(jīng)單波長激勵(lì)光刺激后，氧敏感膜指示劑分子吸收能量由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，再由激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)會(huì)輻射波長較長的熒光。熒光遇到溶解氧分子時(shí)，會(huì)產(chǎn)生猝滅效應(yīng)，表現(xiàn)為強(qiáng)度的衰減和壽命的縮短，依據(jù)衰減程度與溶解氧含量的相關(guān)關(guān)系即可測(cè)定溶解氧濃度。基于熒光強(qiáng)度和熒光壽命的溶解氧濃度檢測(cè)方法，滿足Stern-Volmer方程[18]

圖1 熒光產(chǎn)生及猝滅過程

(1)

式(1)中，I0和τ0分別代表溶解氧濃度為0時(shí)的熒光強(qiáng)度和熒光壽命，I和τ分別代表存在溶解氧時(shí)的熒光強(qiáng)度和熒光壽命，kSV是Stern-Volmer常數(shù)，[O2]是溶解氧濃度。

有關(guān)研究表明，I0和τ0值越大，熒光指示劑的敏感性越強(qiáng)[19]。無氧條件下，當(dāng)所有波長的激發(fā)光光強(qiáng)一致時(shí)，效率最優(yōu)的激發(fā)波長，所產(chǎn)熒光光強(qiáng)值最大，所對(duì)應(yīng)熒光壽命最長。熒光發(fā)射效率為熒光膜在某波長下的產(chǎn)生熒光能力，其計(jì)算滿足式(2)

(2)

其中，F(xiàn)ee為某波長下的熒光發(fā)射效率，k為相應(yīng)比例系數(shù)，I1λ為該波長下的激發(fā)光光強(qiáng)，I2λ為該波長下的熒光光強(qiáng)，其中對(duì)λ設(shè)置一定的波長范圍。在整個(gè)光信號(hào)傳輸過程中，光能量存在一定的損耗，并且雙光譜儀積分時(shí)間的不同產(chǎn)生了比例系數(shù)k。

依據(jù)式(3)，比較各個(gè)波長下的熒光下的熒光發(fā)射效率，最佳激發(fā)波長為最大熒光發(fā)射效率所對(duì)應(yīng)的波長。

λ=λ[max(ηλ)]

(3)

1.2 儀器

本文提出了雙光譜儀和多分支光纖的方法來構(gòu)建氧敏感膜的熒光發(fā)射效率。所用儀器包括：Xe Flash Lamp氙燈，功率為100 W，波長范圍覆蓋200～1 100 nm；Ocean Optics USB2000+光纖光譜儀(美國海洋光學(xué)公司)；多分支光纖(定制)；VSMD132/3_025T步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器(北京韋恩斯技術(shù)有限公司)；氧敏感膜包括：采用HACH公司的5811200，YSI公司的EXO系列及國內(nèi)某科技公司的Y9002。系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 熒光發(fā)射效率檢測(cè)裝置

光源發(fā)出的光進(jìn)入單色分光系統(tǒng)進(jìn)行分光；單色分光系統(tǒng)包括：步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器、步進(jìn)電機(jī)和凹面全息光柵，光柵由步進(jìn)電機(jī)在電子細(xì)分驅(qū)動(dòng)器的作用下以一定角度勻速轉(zhuǎn)動(dòng)，控制光柵的轉(zhuǎn)角進(jìn)而得到設(shè)定的出射光波長，進(jìn)而對(duì)氙燈發(fā)出的光進(jìn)行單色分光，以得到任意波長的激發(fā)光；單波長的激發(fā)光會(huì)聚耦合后進(jìn)入多分支光纖，多分支光纖的結(jié)構(gòu)如圖3所示，激發(fā)光由A端口進(jìn)入光纖分兩路B和C，B端傳入光譜儀Ⅰ用于跟蹤原始激發(fā)光強(qiáng)度，C端傳入氧敏感膜傳感系統(tǒng)，照射氧敏感膜后產(chǎn)生的熒光由反射端口D傳輸?shù)焦庾V儀Ⅱ；氧敏感膜傳感系統(tǒng)包括蠕動(dòng)泵，溶解氧循環(huán)水和氧敏感膜，氧敏感膜一面連接透明窗，用于接收激發(fā)光，另一面為透氣膜(僅溶解氧分子穿過)，浸入水中，用于感知溶解氧分子的濃度，外接蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)特定濃度的溶解氧循環(huán)水(使用無水亞硫酸鈉配置)，使測(cè)量過程中氧濃度保持基本穩(wěn)定；此過程同時(shí)得到激發(fā)光譜和熒光光譜；將得到的光譜數(shù)據(jù)保存在PC端并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

圖3 定制光纖

1.3 方法

打開光源10 min，使其處于穩(wěn)定狀態(tài)。步進(jìn)電機(jī)控制單色儀的光柵旋轉(zhuǎn)，觀察光譜儀光譜圖顯示，尋找初始出現(xiàn)單波長光譜時(shí)的旋轉(zhuǎn)步數(shù)，以此步數(shù)為基準(zhǔn)，每20步進(jìn)行激發(fā)光波長采樣，記錄60組波長數(shù)據(jù)后，進(jìn)行單色儀復(fù)位操作。設(shè)置光譜儀的積分時(shí)間為50 ms, 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程遮光處理。進(jìn)行10次采樣平均，探究旋轉(zhuǎn)步數(shù)與激發(fā)波長之間的數(shù)據(jù)關(guān)系。

為驗(yàn)證求得的熒光特性在任何光強(qiáng)下都具有代表性，本文采用高亮聚光LED作為分光光源，538 nm波長下的單色光作為代表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究。對(duì)光源進(jìn)行電壓變化以控制光源強(qiáng)度，電壓的控制范圍：3.8～5 V, 每隔0.1 V進(jìn)行激勵(lì)光和熒光光強(qiáng)采樣，并進(jìn)行10次采樣平均，記錄數(shù)據(jù)。

采用大功率氙燈和自制單色系統(tǒng)后，D端光譜儀可以觀察到明顯的熒光信號(hào)。因A端接收到的光源光強(qiáng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于D端接收到的熒光，本文通過設(shè)置A端光譜積分時(shí)間為10 ms，而D端光譜積分時(shí)間拉長到1 s，從而很方便地實(shí)現(xiàn)了同時(shí)觀察激發(fā)光光譜和發(fā)射熒光光譜，并在此條件下對(duì)氧敏感膜樣品進(jìn)行了測(cè)量。實(shí)驗(yàn)過程中采樣間隔為2 s，防止采樣數(shù)據(jù)之間出現(xiàn)混疊。記錄350～560 nm的激發(fā)光光強(qiáng)及相應(yīng)熒光光強(qiáng)，將其存儲(chǔ)在PC端并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理, 根據(jù)式(2)求得熒光發(fā)射效率。

2 結(jié)果和討論

2.1 步長和波長

光源的全波段光譜如圖4所示，在350～650 nm信號(hào)較強(qiáng)且不均，利用光譜儀Ⅰ對(duì)光源采集光譜來對(duì)光柵轉(zhuǎn)動(dòng)的驅(qū)動(dòng)脈沖進(jìn)行標(biāo)定。

圖4 光源光譜圖

經(jīng)實(shí)驗(yàn)得到單色光波長與步進(jìn)電機(jī)步長的數(shù)據(jù)關(guān)系滿足圖5，步進(jìn)電機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)步數(shù)與出射光波長之間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.998 5。結(jié)果表明激發(fā)單色光可以通過系統(tǒng)設(shè)定并進(jìn)行掃描。

圖5 轉(zhuǎn)動(dòng)步數(shù)與激發(fā)波長之間的關(guān)系

泵入無氧水，轉(zhuǎn)動(dòng)光柵，掃描波長范圍為350～650 nm，發(fā)現(xiàn)敏感膜的熒光波長基本維持在650 nm，而大于560 nm的激發(fā)波長幾乎不產(chǎn)生熒光。因此設(shè)定掃描的波長范圍為350～560 nm，圖6顯示了此范圍內(nèi)光譜儀Ⅱ采集的光譜數(shù)據(jù)，可見所有熒光發(fā)射峰值波長在650 nm，說明熒光波長與熒光指示劑的材料特性有關(guān)，而與激發(fā)波長選擇無關(guān)。

圖6 不同激發(fā)波長下的熒光光譜

激發(fā)光光強(qiáng)度隨波長而變，由氙燈光源的光譜特性決定，任意兩個(gè)波長，激發(fā)光的強(qiáng)度不等，但是得到的熒光強(qiáng)度相同，說明發(fā)光較弱反而激發(fā)能力強(qiáng)，即熒光發(fā)射效率(Fee)高。氙燈光源本身的光譜分布，導(dǎo)致不能以熒光強(qiáng)度進(jìn)行敏感膜熒光發(fā)射能力評(píng)價(jià)，為消除激發(fā)波長的能量差異，本文歸一化激發(fā)波長，使得各波長的強(qiáng)度相等，以此修正對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度和激發(fā)光強(qiáng)度的比率為該波長的熒光發(fā)射效率，熒光發(fā)射效率最大所對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長為最佳激發(fā)波長。

2.2 激發(fā)光強(qiáng)與熒光光強(qiáng)

本文提出的熒光發(fā)射效率光譜檢測(cè)系統(tǒng)是基于雙光譜儀進(jìn)行設(shè)計(jì)的，目的是避免采集熒光信號(hào)時(shí)激發(fā)光強(qiáng)的飽和現(xiàn)象。圖7顯示了單光譜儀檢測(cè)時(shí)積分時(shí)間為10 ms和積分時(shí)間為1 s的激發(fā)-熒光光譜，激發(fā)光峰值波長為405 nm，熒光峰值波長為650 nm。圖中顯示：積分時(shí)間小，熒光信號(hào)太弱，以至于無法檢測(cè)到；積分時(shí)間大，激發(fā)光強(qiáng)出現(xiàn)飽和，單個(gè)光譜儀無法同時(shí)兼顧激發(fā)光和熒光的測(cè)量。本文提出用雙光譜儀雙積分時(shí)間方法可以實(shí)現(xiàn)二者的同時(shí)測(cè)量，這是本文系統(tǒng)設(shè)計(jì)的創(chuàng)新之一。

圖7 (a)10 ms激發(fā)-熒光光譜；(b)1 s激發(fā)-熒光光譜

由于D1兩個(gè)光譜儀的積分時(shí)間不同，型號(hào)不同，D1得到的是激發(fā)光的強(qiáng)度，D2得到的是反射的熒光強(qiáng)度，不可以直接用于計(jì)算熒光發(fā)射效率，依據(jù)式(2)中發(fā)射效率為二者強(qiáng)度比值乘以一個(gè)系數(shù)k，積分時(shí)間差異表現(xiàn)為系數(shù)k的值。

設(shè)定激發(fā)波長為538 nm，調(diào)整激發(fā)光的強(qiáng)度，分別得到D1和D2的光譜，不同光強(qiáng)下的熒光強(qiáng)度變化如圖8所示，由圖可見，熒光與激發(fā)光強(qiáng)存在明顯的線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.995，表明當(dāng)激發(fā)光強(qiáng)改變時(shí)，熒光強(qiáng)度成比例增加。由此表明，光譜儀的積分時(shí)間不影響熒光效率的計(jì)算，將熒光發(fā)射效率作為評(píng)估氧敏感膜的一個(gè)重要參數(shù)是可行的。

圖8 激發(fā)光強(qiáng)與熒光光強(qiáng)關(guān)系

2.3 熒光效率

實(shí)驗(yàn)首先選用三張進(jìn)口的同一廠家、同一型號(hào)的氧敏感膜進(jìn)行測(cè)試，對(duì)應(yīng)圖9中的1#—3#敏感膜，與其配套的傳感器選擇的發(fā)光管實(shí)測(cè)中心波長為470 nm。

圖9 溶解氧熒光膜

通過本文提出的熒光系統(tǒng)得到全波段的激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜，按式(2)計(jì)算得到熒光發(fā)射效率，圖10顯示的是3#氧敏感膜的熒光發(fā)射效率，可以看到光譜圖上有多個(gè)峰值，分別位于在400.5，434.5，498，506和543 nm，這5個(gè)峰值所對(duì)應(yīng)的熒光效率極差為1.271%，最大效率出現(xiàn)在435.5 nm。470 nm處出現(xiàn)了峰值，但效率值約為最大效率的1/2。說明：該傳感器未選取最佳激發(fā)波長，可以優(yōu)選效率更高的400 nm或者436 nm。作者推測(cè)其選取470 nm波長的原因是該波長的LED光源易得并且其發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)較高。

圖10 氧敏感膜熒光效率光譜

同型號(hào)氧敏感膜的熒光效率比較如圖11所示。由熒光效率峰值比較可以看出三者存在一定的相似性，熒光效率的波峰和波谷基本一致。不同之處在于峰值位置和峰值大小，很容易發(fā)現(xiàn)全波段內(nèi)3#氧敏感膜的熒光效率高于1#和2#，推斷出3#氧敏感膜的質(zhì)量?jī)?yōu)于其他氧敏感膜。

圖11 1#—3#氧敏感膜熒光效率比較

表1對(duì)于給定峰值波長的發(fā)光效率進(jìn)行比較，可以看出1#—3#氧敏感膜存在較大的差異，在500和505 nm處，1#和2#接近，3#要遠(yuǎn)高于前者，最大發(fā)射峰值波長分別為：1#為401 nm，2#為543 nm，3#為435 nm。同型號(hào)氧敏感膜的質(zhì)量存在差異的原因如下：(1)同型號(hào)不同批次，(2)熒光劑分布不均，(3)材料的光敏特性差異。

表1 同型號(hào)氧敏感膜在不同激發(fā)波長下熒光發(fā)射效率

對(duì)不同型號(hào)氧敏感膜的熒光發(fā)射效率進(jìn)行了相應(yīng)比較。結(jié)果見圖12，顯示了圖9中3#—5#三種不同廠家的氧敏感膜的熒光發(fā)射效率，明顯發(fā)現(xiàn)三張氧敏感膜在質(zhì)量上的優(yōu)劣，3#氧敏感膜>4#氧敏感膜>5#氧敏感膜。結(jié)合表2，3#敏感膜與4#敏感膜效率相差將近1個(gè)數(shù)量級(jí)，與5#敏感膜效率相差將近兩個(gè)數(shù)量級(jí)。在激發(fā)波長選擇上，3#，4#和5#敏感膜最優(yōu)波長分別為435，500和435 nm。鑒于5#敏感膜的各波長熒光發(fā)射效率均太低，判斷其已經(jīng)不可使用，5#敏感膜為從傳感器上的拆機(jī)件，應(yīng)當(dāng)立即更換。

圖12 3#—5#氧敏感膜熒光效率比較

表2 不同型號(hào)氧敏感膜在不同激發(fā)波長下的熒光發(fā)射效率

3 結(jié) 論

針對(duì)溶解氧敏感膜熒光發(fā)射效率的測(cè)量難題，提出了一種雙光譜儀和多分支光纖的測(cè)試系統(tǒng)方法，通過提高光源功率，增大了激發(fā)敏感膜的發(fā)射光強(qiáng)度。文中采用步進(jìn)電機(jī)和凹面全息光柵構(gòu)建了激發(fā)波長掃描系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了激發(fā)熒光波長的全波段掃描；采用雙光譜儀系統(tǒng)同時(shí)檢測(cè)得到了激發(fā)光和熒光的光譜，提出了敏感膜熒光發(fā)射效率測(cè)量的方法，成功地建立了溶解氧敏感膜的熒光效率測(cè)試系統(tǒng)。

基于溶解氧傳感器拆機(jī)件和國內(nèi)外產(chǎn)品的實(shí)驗(yàn)測(cè)試，發(fā)現(xiàn)敏感膜的熒光波長位于650 nm，熒光發(fā)射效率隨激發(fā)波長而變，高發(fā)射效率的激發(fā)波長主要分布在400，430和510 nm等幾個(gè)區(qū)，現(xiàn)有傳感器內(nèi)部光源的波長并非最大激發(fā)波長。本文所述熒光發(fā)射效率的測(cè)量很好地分辨了不同熒光敏感膜的樣品，定量地給出了產(chǎn)品敏感效率，客觀評(píng)價(jià)了樣品發(fā)射熒光的能力，為優(yōu)選激發(fā)波長、優(yōu)選傳感器元件和敏感膜本身材料、工藝的研究奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。