白果蒲桃組織培養(yǎng)技術(shù)

陳 春

(福建省林業(yè)科技試驗(yàn)中心，福建 南靖 363600)

白果蒲桃(SyzygiumalbumQ.F.Zheng)為桃金娘科蒲桃屬常綠喬木[1-2]，屬極瀕危物種，僅福建省云霄縣下河鎮(zhèn)梅林村發(fā)現(xiàn)1株樹齡約220年的野生大樹[3]，其他地區(qū)未見報(bào)道[4-6]。白果蒲桃樹干紅褐色，嫩梢呈現(xiàn)不同色彩，具有較高的觀賞價(jià)值,可作為觀賞樹及行道樹[7-10]。由于白果蒲桃種群數(shù)量極為稀少，分布范圍狹小且繁育困難，若不加以保護(hù)，將導(dǎo)致物種滅絕[3]。目前，白果蒲桃主要采用扦插繁殖，但幼苗的移栽成活率較低[7]。因此，開展白果蒲桃無菌播種及組織培養(yǎng)試驗(yàn)，擴(kuò)大種群規(guī)模，是當(dāng)前迫在眉睫的工作。

利用無菌播種繁殖白果蒲桃，可克服人工播種時(shí)萌芽率極低的難題[2]，提高種子萌發(fā)率，縮短育苗周期[6]。目前，國內(nèi)外尚無關(guān)于白果蒲桃無菌播種及組織培養(yǎng)的報(bào)道。因此，本研究以白果蒲桃種子為供試材料，通過優(yōu)化組織培養(yǎng)(包括無菌體系建立、種子萌發(fā)誘導(dǎo)、不定芽增殖及生根培養(yǎng)等)，建立白果蒲桃組織培養(yǎng)技術(shù)體系，以期為其優(yōu)良品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為福建省林業(yè)科技試驗(yàn)中心種質(zhì)資源圃采摘的白果蒲桃扦插苗成熟種子。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌體系的建立 2020年1月，選擇種質(zhì)飽滿且成熟度高的白果蒲桃種子,用稀釋過的洗衣粉溶液浸泡15 min，置于自來水下沖洗15 min；再用0.1%滅菌凈溶液浸泡10 min，自來水震蕩沖洗2遍后置于超凈工作臺(tái)。種子用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精溶液消毒1 min，無菌水沖洗3遍；再分別用質(zhì)量比為0.1%的HgCl2消毒20、25、30 、35 min，無菌水沖洗3遍。將剝掉種皮的種子接種到萌發(fā)培養(yǎng)基。每個(gè)培養(yǎng)瓶接種1粒種子，每個(gè)處理接種10瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)15 d后統(tǒng)計(jì)污染率和死亡率。污染率/%=(污染的種子個(gè)數(shù)/接種的種子總數(shù))×100；死亡率/%=(死亡的種子個(gè)數(shù)/接種的種子總數(shù))×100。

1.2.2 種子萌發(fā)培養(yǎng)基的篩選 將消毒后的種子接種到不同的萌發(fā)培養(yǎng)基中。前期預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加0.2 g·L-1活性炭和0.4 g·L-1蛋白胨有利于白果蒲桃種子的萌發(fā)。因此，共設(shè)計(jì)7組不同質(zhì)量濃度活性炭和蛋白胨組合的萌發(fā)培養(yǎng)基。每個(gè)處理接入 10粒種子，重復(fù)3次。培養(yǎng)15～30 d后，對(duì)萌發(fā)的種子進(jìn)行編號(hào)，同時(shí)觀察并記錄種子的萌發(fā)天數(shù)、萌發(fā)率及芽苗生長情況。萌發(fā)率/%=(萌發(fā)的種子個(gè)數(shù)/接種的種子總數(shù))×100。

1.2.3 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 以無菌白果蒲桃實(shí)生苗為材料，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)基組合(表1)。切下無菌種子苗的莖段和頂芽，接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每個(gè)組合接種30個(gè)莖段或頂芽，重復(fù)3次。暗培養(yǎng)5 d后光照培養(yǎng)25 d，觀察不定芽的生長情況并計(jì)算增殖系數(shù)。增殖系數(shù)=不定芽個(gè)數(shù)/接種的莖段或頂芽數(shù)。

表1 白果蒲桃不定芽誘導(dǎo)試驗(yàn)的因子水平表1)Table 1 Factor levels of adventitious buds during induction test

1.2.4 生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 將不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的3～5 cm單芽切下，接種到生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。共設(shè)計(jì)6組生根培養(yǎng)基：(1)1/2MS+0.2 mg·L-1NAA；(2)1/2MS+0.2 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1IBA；(3)1/2MS+0.2 mg·L-1NAA+0.4 mg·L-1IBA；(4)1/2MS+0.2 mg·L-1NAA+0.6 mg·L-1IBA ；(5)1/2MS+0.4 mg·L-1IBA；(6)1/2MS+0.4 mg·L-1NAA+0.4 mg·L-1IBA，以上培養(yǎng)基均添加0.2 g·L-1活性炭、15 g·L-1蔗糖、7.0 g·L-1卡拉膠。每個(gè)培養(yǎng)瓶接入10個(gè)不定芽，每個(gè)培養(yǎng)基接種10瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)生根數(shù)并計(jì)算平均生根率。通過多重比較法，利用方差分析，篩選出最佳組合的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基。平均生根率/%=(生根苗數(shù)/接種的不定芽數(shù))×100。

1.2.5 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫度設(shè)置為22～25 ℃；光照強(qiáng)度為2 000～3 500 lx；光周期為10～12 h·d-1。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

采用GPS數(shù)據(jù)分析軟件和Excel 2015進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HgCl2消毒處理對(duì)白果蒲桃種子無菌體系建立的影響

由表2可知，不同處理間白果蒲桃種子污染率與存活率差異均達(dá)極顯著水平。當(dāng)消毒時(shí)間從20 min延長至30 min時(shí)，污染率從100%降低至7.5%，此時(shí)種子無死亡現(xiàn)象，且存活率最高，達(dá)92.5%；消毒時(shí)間為35 min時(shí)，種子出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，且污染率有所升高，存活率為76.0%，這可能是由于消毒時(shí)間過長導(dǎo)致白果蒲桃種皮損傷嚴(yán)重，剝掉種皮時(shí)會(huì)殘留一部分在種子上，導(dǎo)致污染率有所上升。綜合來看，0.1% HgCl2的最佳消毒時(shí)間為30 min。

表2 HgCl2消毒時(shí)間對(duì)白果蒲桃種子無菌體系建立的影響1)Table 2 Effect of HgCl2 disinfection time on the establishment of aseptic system of S.album seeds

2.2 培養(yǎng)基對(duì)白果蒲桃種子萌發(fā)的影響

由表3可知，添加一定濃度的活性炭和蛋白胨有利于白果蒲桃種子的萌發(fā)。當(dāng)培養(yǎng)基中未添加活性炭時(shí)，種子萌發(fā)的天數(shù)最長，達(dá)45.5 d，萌芽率最低，為78.3%；添加0.2 g·L-1活性炭可縮短種子萌發(fā)天數(shù)，提高萌發(fā)率，此時(shí)種苗葉片舒展，生長健壯，萌發(fā)天數(shù)和萌芽率與無添加時(shí)對(duì)比差異顯著；當(dāng)活性炭濃度為0.5 g·L-1時(shí)，苗莖細(xì)弱，可見活性炭的濃度不宜過高。添加一定濃度的蛋白胨有助于種子的萌發(fā)，當(dāng)?shù)鞍纂藵舛冗_(dá)到0.4 g·L-1時(shí)，萌發(fā)天數(shù)最短，萌芽率最高。

表3 活性炭及蛋白胨濃度對(duì)白果蒲桃種子萌發(fā)的影響1)Table 3 Effects of contents of activated carbon and peptone on germination performance of S.album seed

綜上所述，本試驗(yàn)選擇的最佳種子萌發(fā)培養(yǎng)基為：MS+0.2 g·L-1活性炭+0.4 g·L-1蛋白胨+30 g·L-1蔗糖+5.0 g·L-1瓊脂。該培養(yǎng)基下種子的萌發(fā)天數(shù)為32.4 d，萌發(fā)率達(dá)94.5%，種子苗生長健壯(圖1)。

圖1 白果蒲桃無菌實(shí)生苗Figure 1 S.album seedlings germinated in aseptic system

2.3 培養(yǎng)基對(duì)白果蒲桃不定芽增殖的影響

將白果蒲桃實(shí)生苗切成莖段及莖尖，接種到不定芽誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，20 d左右可觀察到不定芽(圖2)。白果蒲桃不定芽增殖培養(yǎng)正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。各處理的不定芽增殖系數(shù)不同，其中處理2的平均增殖系數(shù)最高，為3.20。正交試驗(yàn)分析表明，白果蒲桃的最佳增殖培養(yǎng)基組合為A2B2C2，即1/2MS+0.8 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+5.0 g·L-1瓊脂。

由表4中R值分析表明，基礎(chǔ)培養(yǎng)基、6-BA、NAA三因子對(duì)白果蒲桃增殖培養(yǎng)的影響力大小依次為：6-BA>基礎(chǔ)培養(yǎng)基>NAA(B>A>C)。方差分析(表5)顯示，3個(gè)因子對(duì)白果蒲桃增殖系數(shù)的影響均達(dá)極顯著水平。

表4 白果蒲桃不定芽增殖培養(yǎng)正交試驗(yàn)結(jié)果1)Table 4 Orthogonal test on proliferation culture of S.album adventitious bud

表5 白果蒲桃不定芽增殖培養(yǎng)正交試驗(yàn)方差分析表1)Table 5 Analysis of variance on orthogonal test on proliferation culture of S.album adventitious bud

2.4 培養(yǎng)基對(duì)白果蒲桃不定芽生根的影響

選擇高3～5 cm且?guī)в?片以上葉子的白果蒲桃不定芽。切下不定芽并接種到生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20 d左右可觀察到基部長出白色根原基(圖3)。培養(yǎng)35 d后將生根苗移出培養(yǎng)室煉苗。由表6可知，IBA和NAA對(duì)白果蒲桃不定根的形成均有促進(jìn)作用。當(dāng)NAA濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，隨著IBA濃度增加，平均根數(shù)和生根率呈先提高后降低趨勢；IBA濃度為0.4 mg·L-1時(shí)，平均根數(shù)最多，生根率最高，與其他3個(gè)濃度水平差異顯著。因此，白果蒲桃不定芽最佳生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1/2MS+0.4 mg·L-1IBA+0.2 mg·L-1NAA+0.2 g·L-1活性炭+15 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1卡拉膠時(shí)，此時(shí)平均根數(shù)為3.5根，平均生根率達(dá)70.9%。

圖3 白果蒲桃不定根的誘導(dǎo)培養(yǎng)Figure 3 Induction and culture of adventitious roots of S.album

表6 IBA和NAA濃度對(duì)白果蒲桃不定芽生根的影響1)Table 6 Effects of IBA and NAA on rooting of S.album adventitious buds

3 討論與小結(jié)

通過林下落地種子自然播種或人工土播，白果蒲桃種子發(fā)芽率均極低[3,10]，吳地泉[3]開展了白果蒲桃幼苗移栽試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其移栽成活率極低。而本研究采用無菌播種方式，種子萌發(fā)率達(dá)94.5%，萌發(fā)天數(shù)為32.4 d，克服了人工播種萌芽率極低的難題。白果蒲桃人工播種萌芽率低可能與其種子萌發(fā)時(shí)種皮脫落，胚乳易受外界細(xì)菌或真菌侵襲而導(dǎo)致敗育有關(guān)，而通過組培播種可獲得無菌種子，提高萌芽率。

本試驗(yàn)首次以白果蒲桃的種子作為外植體，開展白果蒲桃組織培養(yǎng)技術(shù)研究，發(fā)現(xiàn)其最佳增殖培養(yǎng)基為：1/2MS+0.8 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+5.0 g·L-1瓊脂；不定芽最佳生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1/2MS+0.4 mg·L-1IBA+0.2 mg·L-1NAA+0.2 g·L-1活性炭+15 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1卡拉膠，平均根數(shù)為3.5，平均生根率達(dá)70.9%。今后將對(duì)無性系進(jìn)行移栽種植并篩選出優(yōu)良無性系，為園林綠化提供優(yōu)質(zhì)白果蒲桃種苗。