一種多氯聯(lián)苯膠體金免疫快速檢測(cè)試紙條的研制

萬(wàn)宇平，鄭百芹，賈芳芳，李愛軍，崔海峰，賈招閃，何方洋2，

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2.北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，北京 102206；3.唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北 唐山 063000；4.灤州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 灤州 063799）

多氯聯(lián)苯（polychlorinated biphenyls，PCBs）屬于鹵代芳烴類化合物，可作為樹脂、防火劑、涂料等多種工業(yè)品的添加劑[1-2]，是一種用途很廣的工業(yè)化學(xué)品。而該物質(zhì)屬于致癌物，容易在人體的脂肪組織中積累，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)均有危害作用；同時(shí)對(duì)水體和大氣環(huán)境均可造成污染[1-2]。雖然大多數(shù)國(guó)家已停止了生產(chǎn)和使用多氯聯(lián)苯，但其物理化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，會(huì)長(zhǎng)期存在于地球的生態(tài)系統(tǒng)中[3]。在PCBs的209種同系物中，多氯聯(lián)苯PCB118是毒性較強(qiáng)的一種。因此，檢測(cè)PCB118殘留量是必要的[4]。

目前，檢測(cè)多氯聯(lián)苯的方法有氣相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、光電化學(xué)傳感器法等。其中，藍(lán)夢(mèng)哲[5]建立了魚粉飼料中多氯聯(lián)苯殘留量的氣相色譜分析方法，對(duì)7種指示性多氯聯(lián)苯（PCBs）在3個(gè)添加水平的平均回收率（n=5）為83.1%～109.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.70%～7.28%。陳麗金[6]建立了測(cè)定飼料中多氯聯(lián)苯殘留量的氣相色譜析方法，測(cè)定結(jié)果顯示，18種多氯聯(lián)苯的檢出限為0.004～0.010 mg/kg。張?zhí)矣⒌萚7]建立了使用快速溶劑萃取（accelerated solvent extraction，ASE）技術(shù)提取，毛細(xì)管柱為分離柱，以電子捕獲檢測(cè)器檢測(cè)，用氣相色譜法同時(shí)測(cè)定果蔬中15種有機(jī)氯農(nóng)藥的殘留量，最低檢出限為1.1～20 μg/kg。王文蘭等[8]建立了一種氣相色譜內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定魚肉中7種指示性多氯聯(lián)苯不確定度的分析方法。時(shí)磊等[9]用氣相色譜法測(cè)定了稻谷中18種有機(jī)氯農(nóng)藥和7種多氯聯(lián)苯的含量。侯圣軍等[10]建立了大米中12種有機(jī)氯農(nóng)藥氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器檢測(cè)方法。杜靜等[11-14]也應(yīng)用了氣相色譜法測(cè)定多氯聯(lián)苯殘留量。何芳等[15]為監(jiān)測(cè)小麥中多氯聯(lián)苯污染狀況，應(yīng)用超聲波提取、分散固相萃取凈化、氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-massspectrometer，GC-MS）檢測(cè)，建立了一種簡(jiǎn)單、快速測(cè)定小麥中7種指示性多氯聯(lián)苯（PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB153、PCB138、PCB180）的分析方法。王定森等[16]研究了Aroclor系列多氯聯(lián)苯的組成特點(diǎn)，提出了選取各Aroclor系列多氯聯(lián)苯中5～10個(gè)特征峰，將選取的特征峰面積加和與濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量的方法，作為標(biāo)準(zhǔn)方法的補(bǔ)充說(shuō)明。楊代鳳等[17]建立了氣相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)快速測(cè)定小麥中12種二噁英類多氯聯(lián)苯（dioxin-like polychlorinated biphenyls，DL-PCBs）的分析方法。朱蕓等[18]建立了加速溶劑萃取-氣相色譜質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定34種有機(jī)氯農(nóng)藥（organochlorine pesticides，OCPs）和18種多氯聯(lián)苯類化合物（PCBs）的方法。楊梅[19]研究了固相萃取-氣相色譜串級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用方法測(cè)定食品中多氯聯(lián)苯的方法。宋梓亮等[20]建立了飼料中多氯聯(lián)苯Aroclor 1242系列的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法。潘娟等[21-23]同樣應(yīng)用了氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)多氯聯(lián)苯殘留量進(jìn)行了測(cè)定。王貴珍[24]以單個(gè)多氯聯(lián)苯的適配體為識(shí)別元件，將適配體修飾于不同的納米材料上，構(gòu)建不同的電化學(xué)和光電化學(xué)適配體傳感器實(shí)現(xiàn)對(duì)多氯聯(lián)苯（PCBs）單體PCB77和PCB72的測(cè)定。

與上述方法相比，免疫化學(xué)檢測(cè)法對(duì)藥物檢測(cè)具有快速、特異、靈敏、準(zhǔn)確、可以批量監(jiān)測(cè)、樣品處理簡(jiǎn)單、能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作等優(yōu)點(diǎn)[25-26]。而免疫化學(xué)法檢測(cè)多氯聯(lián)苯的前提是具備抗多氯聯(lián)苯的抗體，本研究制備出一種多氯聯(lián)苯單克隆抗體，并應(yīng)用于膠體金免疫層析試紙條，費(fèi)用及檢測(cè)時(shí)限均能夠滿足基層實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)需求，該產(chǎn)品已市場(chǎng)化，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多氯聯(lián)苯PCB118、PCB52、PCB101、PCB28、PCB138、PCB153、PCB180等標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%）：北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。

1.2 儀器與設(shè)備

GT-700膠體金分析儀：北京勤邦生物技術(shù)有限公司；HFJ-10均質(zhì)器、MX-F渦旋儀：湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；JA2003電子天平：上海力辰儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多氯聯(lián)苯半抗原的制備

取多氯聯(lián)苯PCB118326mg，加N，N-二甲基甲酰胺20mL溶解，充分?jǐn)嚢?，加入氫氧化?.56 g，加入50%乙醛酸水溶液0.51 mL，加熱至90 ℃，反應(yīng)8 h，停止反應(yīng)，加1 mol/L鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至6，加水60 mL，加1,2-二氯乙烷100 mL萃取，靜置分層，分去水相，有機(jī)相水洗，干燥，蒸干，上硅膠柱，二氯甲烷/甲醇（10/1，V/V）洗脫分離，得到羧基多氯聯(lián)苯PCB118 0.24 g，回收率60%。氯聯(lián)苯半抗原合成途徑如下：

1.3.2 免疫原的制備

取羧基多氯聯(lián)苯15 mg，加二甲基甲酰胺1 mL溶解，加1-羥基苯并三唑11.4 mg，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺14 mg，室溫反應(yīng)3 h，得到半抗原溶液A液；取牛血清白蛋白50 mg，加0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液溶解，得到B液，將A液滴加到B液中，4 ℃反應(yīng)12 h，0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液透析純化3 d，每天換液3次，得到多氯聯(lián)苯-牛血清白蛋白偶聯(lián)物，即為免疫原，-20 ℃保存，備用。

1.3.3 包被原的制備

取羧基多氯聯(lián)苯9 mg，加二甲基亞砜1 mL溶解，加N-羥基琥珀酰亞胺7.9 mg，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺8.4 mg，室溫反應(yīng)3 h，得到半抗原溶液A液；取卵清蛋白50 mg，后續(xù)步驟同1.3.2，得到包被原。

1.3.4 微孔試劑的制備

取0.01%氯金酸水溶液100 mL加熱至沸騰；一邊攪拌，一邊準(zhǔn)確加入1%檸檬酸三鈉溶液1.5 mL；待氯金酸水溶液變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)煮沸15 min，冷卻后，4 ℃避光保存。在磁力攪拌作用下，用0.2 mol/L Na2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至7.2，加入60 μg多氯聯(lián)苯單克隆抗體/mL膠體金溶液，混勻，靜置10 min，加入10%牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA），使其在膠體金溶液中的體積分?jǐn)?shù)為1%，靜置10 min。離心、洗滌、重懸，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試紙條的檢測(cè)線T線包被有1.3.3制備的包被原，包被量為1.0 μg/cm2；質(zhì)控線C線包被有羊抗鼠抗抗體，包被量為1.0 μg/cm2。

將100 μL多氯聯(lián)苯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物加入微孔板中，置于冷凍干燥機(jī)，冷阱溫度為-50 ℃，預(yù)凍3 h，再真空干燥15 h，得到微孔試劑。

1.3.5 樣本前處理方法

用均質(zhì)器均質(zhì)飼料樣本；稱?。?.0±0.05）g均質(zhì)后的飼料樣本至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入25 mL體積分?jǐn)?shù)50%甲醇，用振蕩器劇烈振蕩5 min，室溫條件下3 000×g離心5min；移取500μL上清液至2 mL聚苯乙烯離心管中，加入500 μL10%氯化鈉水溶液，用振蕩器振蕩1 min，混勻；待用。

1.3.6 檢測(cè)方法

向微孔中加入100 mL待測(cè)樣本，孵育3 min，吸取70 mL滴至試紙條上，反應(yīng)10 min，判讀檢測(cè)結(jié)果，見圖1。

圖1 多氯聯(lián)苯膠體金試紙條結(jié)果判定示意圖Fig.1 Schematic diagram of polychlorinated biphenyl test strip result determination

1.3.7 試紙條檢測(cè)限的測(cè)定

在空白飼料樣本（豆粕、牛濃縮飼料、豬濃縮飼料、豬配合飼料、雞配合飼料、魚飼料、玉米胚芽餅）中分別添加多氯聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)量濃度為0、6 μg/L、8 μg/L、10 μg/L、12 μg/L、14 μg/L，按照1.3.6檢測(cè)三批試紙條，每個(gè)濃度重復(fù)5次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定樣本檢測(cè)限[25-26]。

1.3.8 試紙條特異性的測(cè)定

分別配制100 μg/L的PCB52、PCB101、PCB28、PCB138、PCB153、PCB180等藥物，用試紙條重復(fù)檢測(cè)3次，檢測(cè)試紙條的特異性。

1.3.9 試紙條準(zhǔn)確性的測(cè)定

試紙條的準(zhǔn)確性通常以假陽(yáng)性率和假陰性率表示，假陽(yáng)性率應(yīng)小于5%，假陰性率應(yīng)為0。用試紙條檢測(cè)樣品中是否殘留多氯聯(lián)苯，通過(guò)儀器確證的50份陰性飼料樣品（質(zhì)量濃度＜10 μg/kg）和50份陽(yáng)性飼料樣品（質(zhì)量濃度＞10 μg/kg），計(jì)算假陽(yáng)性率和假陰性率。

1.3.10 試紙條穩(wěn)定性的測(cè)定

用試紙條檢測(cè)20份陰性飼料樣品（質(zhì)量濃度＜10μg/kg）和20份陽(yáng)性飼料樣品（質(zhì)量濃度＞10 μg/kg），上述樣品均經(jīng)過(guò)儀器確證，試紙條于2～8 ℃冷藏保存，保存時(shí)間分別為1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月、6個(gè)月、7個(gè)月、8個(gè)月、9個(gè)月、10個(gè)月、11個(gè)月、12個(gè)月、13個(gè)月，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2次，判定試紙條的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本檢測(cè)限

分別配制多氯聯(lián)苯質(zhì)量濃度為0、6μg/L、8μg/L、10μg/L、12 μg/L、14 μg/L的豆粕、牛濃縮飼料、豬濃縮飼料、豬配合飼料、雞配合飼料、魚飼料、玉米胚芽餅等飼料樣品，按照

1.3.6 步驟進(jìn)行檢測(cè)，確定檢測(cè)限[25-26]，試驗(yàn)結(jié)果見表1。結(jié)果表明，當(dāng)飼料樣品中多氯聯(lián)苯質(zhì)量濃度為0、6 μg/L、8 μg/L時(shí)，試紙條顯示陰性，即未能檢測(cè)到樣品中含有多氯聯(lián)苯；當(dāng)飼料樣品中多氯聯(lián)苯質(zhì)量濃度≥10 μg/L時(shí)，試紙條顯示陽(yáng)性，即能夠檢測(cè)到樣品中含有多氯聯(lián)苯，則該試紙條的檢測(cè)限定為10 μg/kg。

表1 多氯聯(lián)苯快速檢測(cè)試紙條的檢測(cè)限Table 1 Detection limit of the polychlorinated biphenyl test strip for rapid detection

2.2 特異性測(cè)定結(jié)果

該試紙條檢測(cè)100 μg/L 的PCB52、PCB101、PCB28、PCB138、PCB153、PCB180等藥物的特異性測(cè)定結(jié)果見表2。結(jié)果表明，檢測(cè)結(jié)果均呈陰性，即該試紙條與上述藥物無(wú)交叉反應(yīng)，特異性較好。

表2 特異性測(cè)定結(jié)果Table 2 Result of specificity tests

2.3 準(zhǔn)確性測(cè)定結(jié)果

用試紙條檢測(cè)50份陰性和50份陽(yáng)性豆粕、牛濃縮飼料、豬濃縮飼料、豬配合飼料、雞配合飼料、魚飼料、玉米胚芽餅等飼料樣品，檢測(cè)結(jié)果見表3。結(jié)果表明，未出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，即試紙條準(zhǔn)確性較高。

表3 準(zhǔn)確性測(cè)定結(jié)果Table 3 Result of accuracy tests

續(xù)表

2.4 穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

針對(duì)豆粕、牛濃縮飼料、豬濃縮飼料、豬配合飼料、雞配合飼料、魚飼料、玉米胚芽餅等飼料樣本，試紙條進(jìn)行了假陽(yáng)性率和假陰性率的測(cè)試，結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果Table 4 Result of stability tests

結(jié)果表明，12個(gè)月內(nèi)，穩(wěn)定性指標(biāo)均符合要求，說(shuō)明穩(wěn)定性能夠維持12個(gè)月。從第13個(gè)月起，試紙條會(huì)出現(xiàn)少量失效、假陽(yáng)性等現(xiàn)象，即超過(guò)12個(gè)月，試紙條質(zhì)量已不穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本研究制備出多氯聯(lián)苯半抗原，使之與牛血清白蛋白/卵清蛋白偶聯(lián)，分別得到多氯聯(lián)苯免疫原和多氯聯(lián)苯包被原，從而制備出多氯聯(lián)苯膠體金免疫層析試紙條。測(cè)定了多氯聯(lián)苯膠體金試紙條的產(chǎn)品檢測(cè)限，并對(duì)其特異性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性等指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)試，均符合《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求。另外，多氯聯(lián)苯膠體金試紙條的檢測(cè)限為10 μg/kg，檢測(cè)時(shí)間僅為15 min，靈敏度高且用時(shí)短，即具有免疫快速檢測(cè)產(chǎn)品的特點(diǎn)。