直接進樣氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定白酒中的有機氯農(nóng)殘

黃 箭，薛潤萍，魏金萍，張 倩，謝正敏，安明哲

（宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓 644000）

我國是農(nóng)業(yè)大國，是生產(chǎn)和使用農(nóng)藥最多的國家，隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥的廣泛使用，大量農(nóng)藥經(jīng)揮發(fā)、富集等方式殘留于環(huán)境中。在20世紀50～80年代有機氯農(nóng)藥（organochlorine pesticides，OCPs）由于其防治農(nóng)作物病蟲害效果好，被大量使用[1-3]。OCPs由于氯苯結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，在環(huán)境中難于被降解，并且能夠在動物和人體內(nèi)蓄積從而導致各類神經(jīng)、免疫、生殖以及遺傳性疾病[4，5]，雖然我國已對其禁用多年，但近年來世界各地仍然在土壤，水，以及人類的食物當中都能檢測到痕量的農(nóng)藥殘留及其代謝產(chǎn)物[6]。

白酒是以高粱、小麥等糧食為主要原料經(jīng)發(fā)酵、蒸餾而成[7]，雖然經(jīng)過發(fā)酵、蒸餾過程，減少了農(nóng)藥的殘留量，但仍有殘留在酒中的風險，同時白酒成分中大部分是乙醇和水[8]，我國飲用水衛(wèi)生標準[9]中對六六六、滴滴滴、七氯、林丹等有機氯農(nóng)殘進行了相應的限量標準，水中的有機氯農(nóng)藥殘留對白酒的食品安全也存在潛在的風險。我國目前尚未有白酒中農(nóng)藥殘留限量的相關規(guī)定，因此，有必要建立一種快速準確的檢測方法，為白酒中有機氯農(nóng)殘的風險評估提供技術支持。

目前，國內(nèi)外對有機氯農(nóng)殘的檢測的方法有很多，主要有氣相色譜法（gas chromatography，GC）[1，10-11]、氣相色譜質(zhì)譜法（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）[12]和氣相色譜-三重四級桿質(zhì)譜法（gas chromatography-triple quadruple mass spectrometry，GC-MS/MS）[13-14]。針對白酒中農(nóng)殘的檢測方法的報道卻較少，文獻報道的分析方法多采用固相萃取法（solid-phase extraction，SPE）[15-16]，分散固相萃?。╠ispersive solid phase extraction，D-SPE）[17]或者凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）凈化法[18]，由于白酒中的有機氯農(nóng)藥含量低，基質(zhì)本底復雜，且分析前常需要較復雜的前處理方法凈化，再經(jīng)濃縮后上樣分析，操作繁瑣耗時，靈活性不強，且前處理設備和裝置價格也相對較高。本研究嘗試采用直接進樣法來測定白酒中的有機氯農(nóng)殘，重點考察了色譜柱對直接進樣的耐受力[19]，并通過GC-MS/MS對儀器參數(shù)進行優(yōu)化，采用多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）掃描模式對白酒樣品進行分析，避免了使用單離子監(jiān)測（single ion monitoring，SIM）掃描模式引起的相同分子質(zhì)量的不同分子結(jié)構(gòu)的干擾，以期建立一種直接進樣測定白酒中的有機氯農(nóng)藥殘留的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

20余種白酒樣品（包括濃香型、醬香型、清香型、米香型等）：市售。

有機氯農(nóng)藥標準品：α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、五氯硝基苯、七氯、艾氏劑、四氯苯酞、狄氏劑、異狄氏劑、雙對氯苯基三氯乙烷（dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT）（P,P'-滴滴涕）、O,P'-滴滴涕（O,P'-DDT）、1,1-雙（對氯苯基）-2,2-二氯乙烯（1,1-bis(chlorophenyl)-2,2-dichloroethylene，DDE）（P,P'-滴滴伊）、1,1-二氯-2,2-雙（對氯苯基）乙烷（1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethane，DDD）（P,P'-滴滴滴）；質(zhì)量濃度為100 μg/mL的單標準溶液：中國標準物質(zhì)中心；乙酸乙酯（色譜純）：賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 儀器與設備

7890A-7000C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、電子電離（electron ionization，EI）源：安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 有機氯農(nóng)殘混合標液的配制

準確量取質(zhì)量濃度為100 μg/mL的14種單標準溶液各100 μL于10 mL的棕色容量瓶中，加入8 600 μL乙酸乙酯，混勻后得質(zhì)量濃度為1 μg/mL的混合標準儲備液；混合標準工作液的配制：采用逐級稀釋法配制不同濃度的有機氯農(nóng)殘混合標準工作液，用空白基質(zhì)的白酒將有機氯農(nóng)殘混標儲備液稀釋成1 μg/L、2 μg/L、4 μg/L、7 μg/L、10 μg/L的混合標準工作液。

1.3.2 氣相色譜條件

色譜柱：HP-5MS毛細管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；載氣為氦氣（He）（純度≥99.999%），流速1 mL/min；進樣方式：脈沖不分流進樣；進樣量：1 μL；柱溫：起始溫度40 ℃，保持1 min，以30 ℃/min升至180 ℃，保持0.5 min，以2 ℃/min升至200 ℃，保持0.5 min，再以5 ℃/min升至280 ℃保持1 min；進樣口溫度：250 ℃；輔助加熱溫度280 ℃。

1.3.3 質(zhì)譜條件

采用電子電離（EI）源多反應監(jiān)測（MRM）模式，溶劑延遲：5 min，離子源溫度：230 ℃，四級桿1溫度：150 ℃，四級桿2溫度：150 ℃。具體有機氯農(nóng)藥保留時間，離子參數(shù)及碰撞能量見表1。

表1 14種有機氯農(nóng)藥的保留時間及離子參數(shù)Table 1 Retention time and ionic parameters of 14 organochlorine pesticides

續(xù)表

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

本方法采用外標法定量，按梯度添加一定量的有機氯農(nóng)殘的標準品（對照品）于空白溶劑中制成對照樣品，與未知試樣平行地進行樣品處理并檢測。不同濃度的標準品進樣，以峰面積為值繪制成標準曲線，從而推算出未知試樣中被測組分濃度進行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機氯標樣色譜圖

有機氯標樣MRM色譜圖見圖1，結(jié)果表明，各相鄰色譜峰分離情況良好。

圖1 有機氯標樣多反應監(jiān)測色譜圖Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatogram of organochlorine standard sample

2.2 儀器條件優(yōu)化

2.2.1 氣相條件優(yōu)化

有機氯農(nóng)殘是弱極性，高沸點的化合物（絕大多數(shù)200℃以上），研究將進樣口溫度設置為250 ℃便于物質(zhì)汽化，因其沸點較高，出峰時間靠后，故加快了柱溫箱的升溫時間，以30 ℃/min升至180 ℃，這樣將縮短了整個樣品的出峰時間，同時白酒的成分較為復雜，多為中等極性以及強極性的物質(zhì)，研究采用HP-5MS非極性色譜柱，能避免白酒中的多數(shù)復雜成分對有機氯的干擾，在第一個有機氯農(nóng)殘出峰時，柱溫已達180 ℃，此時白酒中的大多數(shù)干擾物都已避開，因為白酒中的成分多為低沸點的化合物，只有少數(shù)沸點較高的化合物可能對直接進樣方法有干擾，如肉豆蔻酸乙酯，其出峰的時間和五氯硝基苯完全重合（見圖2），其可通過質(zhì)譜條件進行進一步優(yōu)化。

圖2 空白基質(zhì)SCAN圖和空白基質(zhì)加標多反應監(jiān)測色譜圖Fig.2 SCAN of blank matrix and multiple reaction monitoring chromatogram of blank matrix adding standards

2.2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)有機氯農(nóng)殘的特性，首先對高濃度的有機氯農(nóng)殘標樣進行全掃描，確定了各物質(zhì)的保留時間后，逐個分析其質(zhì)譜圖，選擇響應較強，干擾較小的母離子進行子離子掃描，設置對應的電離能，在不同的電離情況下確定各個化合物響應最佳的碎片離子以及電離能量。由于直接進樣，白酒中部分成分會對待測物有干擾，通過MRM的采集方法的特性，即使保留時間重合，也能根據(jù)不同物質(zhì)的特征離子進行分離，實驗為了得到更高的靈敏度，對質(zhì)譜的增益進行了一定的調(diào)節(jié)，增益因子可以增加儀器的響應，樣品濃度較低可通過增大增益因子來增強響應，對部分低響應的有機氯的增益因子進行了調(diào)節(jié)，在保證目標組分完全檢測到的情況下，盡可能提高儀器的檢出限，同時將各目標組分盡可能單獨設置一個掃描通道，即可避開白酒中的復雜基質(zhì)對農(nóng)藥殘留的干擾，優(yōu)化條件下樣品經(jīng)直接進樣結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，14種有機氯農(nóng)藥均能得到較好的分離。

圖3 空白基質(zhì)與空白基質(zhì)加標色譜圖Fig.3 Chromatogram of blank matrix and blank matrix adding standards

2.3 回歸方程、線性范圍和檢出限

取標準系列溶液按上述條件進行進樣分析，分別以每種標樣的峰面積（Y）為縱坐標和質(zhì)量濃度（X，μg/L）為橫坐標繪制標準曲線，利用1 μg/L的添加濃度水平為依據(jù)，特征離子質(zhì)量色譜峰性噪比（singnalto noise ratio，SNR）=3計算檢出限（limit of detection，LOD），SNR=10計算定量限（limit of quantitation，LOQ），結(jié)果見表2。結(jié)果表明，在1～10 μg/L范圍內(nèi)，待測物線性良好，相關系數(shù)R2均在0.99以上。

表2 標準曲線、相關系數(shù)、線性范圍及檢出限和定量限Table 2 Standard curve,correlation coefficient,linear range,detection limit and quantitation limit

2.4 方法精密度及回收率試驗

分別向空白酒樣中添加0.002 mg/L、0.005 mg/L和0.008 mg/L的有機氯農(nóng)藥混合標樣，進行加標回收試驗，每個濃度水平平行測定6次。利用保留時間和特征離子的豐度比定性，采用峰面積外標法定量，計算回收率及相對標準偏差，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，在3個濃度水平上，有機氯農(nóng)藥的平均回收率80.88%～115.28%，相對標準偏差在2.7%～11.1%之間，符合農(nóng)藥多殘留分析要求。

表3 14種有機氯農(nóng)藥的回收率及精密度試驗Table 3 Recovery and precision tests of 14 organochlorine pesticides

2.5 前處理方法的比較

對于白酒中的農(nóng)藥殘留檢測方法，王蓉等[15]建立了白酒中8種有機氯農(nóng)藥殘留檢測的GC-MS法，該法用Florisil固相萃取柱對樣品進行前處理，該法在0.05 mg/L和0.5 mg/L兩個添加水平下的回收率在81.0%～106.3%之間，方法的最低檢出限在0.4～1.2 μg/L之間；姜利等[18]建立了GC-MS/MS測定白酒中滴滴涕和六六六殘留的分析方法，樣品經(jīng)旋蒸去除酒精，經(jīng)二氯甲烷＋丙酮（4∶1，V/V）進行萃取，有機相通過凝膠滲透色譜進行凈化和濃縮，該方法的檢出限為0.2～1.0 μg/L。

對比發(fā)現(xiàn)，固相萃取雖然對農(nóng)殘進行了富集，但同時其也浪費了大量的有機溶劑、時間及人工成本，小柱的成本較高，活化、洗脫的試劑對環(huán)境也造成了相應的污染，而直接進樣在避免復雜基質(zhì)的干擾下，減少了樣品的預處理過程，操作簡單、省時省力，節(jié)約成本。本研究采用直接進樣測定白酒中的14種有機氯農(nóng)殘，該法在0.002 mg/L、0.005 mg/L和0.008 mg/L水平下進行加標回收試驗有機氯農(nóng)藥的平均回收率80.88%～115.28%，方法的檢出限為0.01～0.11 μg/L之間低于國標的食品中農(nóng)藥最大殘留限量要求[20]。

2.6 基質(zhì)效應

基質(zhì)效應的存在會對目標組分的信號產(chǎn)生增強或者抑制效應，基質(zhì)效應（ME=B/A，A為純?nèi)軇┲修r(nóng)藥的響應值，B為樣品基質(zhì)中添加的相同含量農(nóng)藥的響應值），比值在0.9和1.1之間，表示基質(zhì)效應可以忽略，大于1.2為基質(zhì)效應增強，小于0.9為基質(zhì)效應減弱[21-23]。我國白酒共有12種香型，其中濃香型、醬香型、清香型、米香型為四大基本香型，獨立存在于各白酒之中，其余8種香型是在這四種基本香型的基礎上衍生而來[24-25]，因此本方法選用了四種基本香型的白酒空白代表（即濃香型、醬香型、米香型、清香型）作為基質(zhì)配制標樣，同時和純?nèi)軇┮宜嵋阴ヅ錁俗鲗Ρ?，結(jié)果見圖4。

圖4 異狄氏劑在不同香型白酒中的基質(zhì)效應Fig.4 Matrix effects of endrin in different flavor of Baijiu

結(jié)果表明，α-六六六、七氯、艾氏劑的基質(zhì)效應可以忽略，異狄氏劑在清香型白酒中的基質(zhì)效應可以忽略，在濃香型、醬香型、米香型白酒中的基質(zhì)效應為增強，其它有機氯農(nóng)殘在四種不同香型白酒的基質(zhì)中均為基質(zhì)增強效應。盡管白酒的復雜基質(zhì)對有機氯農(nóng)殘的響應有較大的影響，但并不影響方法對白酒中有機氯的篩查，為徹底消除基質(zhì)效應，在對不同香型的白酒進行定量測定時，應該用相應香型的白酒進行基質(zhì)配標準曲線。

2.7 樣品檢測分析

運用本方法對市售20余種白酒進行樣品分析，均未檢出目標分析物，這可能和白酒的釀造工藝相關。韓永濤[26]研究了從原糧到白酒的過程中各農(nóng)藥的遷移規(guī)律，結(jié)果表明供試農(nóng)藥的殘留水平隨著白酒釀造進程而不斷降低，潤糝過程對農(nóng)藥殘留的去除效果與農(nóng)藥本身的蒸汽壓有關，蒸汽壓越高，去除效果越明顯，蒸糝過程持續(xù)高溫使農(nóng)藥殘留降低22%～83%，發(fā)酵過程對農(nóng)藥的降解率在36%～76%之間，這說明白酒釀造工藝能顯著降低白酒中農(nóng)藥殘留水平。

3 結(jié)論

建立了GC-MS直接進樣檢測白酒中14種有機氯的檢測方法，在擬定的實驗條件下，14種有機氯農(nóng)殘得到了較好的分離，分析方法的檢測限、回收率和靈敏度均滿足痕量農(nóng)殘分析技術要求。本方法的檢出限為0.01～0.11 μg/L，其檢出限遠低于其在食品中的殘留限量，回收率和靈敏度也滿足痕量農(nóng)藥殘留分析技術要求，該方法的建立對白酒農(nóng)藥殘留方法的制定及白酒中農(nóng)藥殘留風險性評估具有十分重要的意義。