高產(chǎn)酯菌株的篩選及其在醬香型白酒堆積發(fā)酵中的應(yīng)用

李景輝，郭 瑩，，張 穎，李霄霄，盧 君，孟天毅，張翠英，肖冬光

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 天津市工業(yè)微生物重點實驗室 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2.貴州國臺酒業(yè)股份有限公司，貴州 仁懷 564501）

醬香型白酒的發(fā)酵環(huán)境具有高溫、高酸、開放式和復(fù)雜微生物區(qū)系等特點[1]。在釀造過程中，嚴(yán)苛的發(fā)酵環(huán)境對網(wǎng)羅自空氣、生產(chǎn)工具、原料和高溫大曲等來源的微生物進(jìn)行了不斷地馴化和富集，并形成了醬香型酒醅特殊的微生物群落結(jié)構(gòu)及其演化過程[2-4]。不同階段的微生物有序地對酒醅基質(zhì)進(jìn)行分解、利用并產(chǎn)生豐富的釀酒酶系和代謝產(chǎn)物[5]，最終促使白酒中多種風(fēng)味成分產(chǎn)生。其中，酵母菌是酒精和風(fēng)味成分的主要貢獻(xiàn)者[1，6]，產(chǎn)物包括高級醇、有機(jī)酸和酯類物質(zhì)等。20世紀(jì)60年代，東方伊薩酵母菌（Issatchenkia orientalis）首次在文獻(xiàn)中被報道[7]，其是一種具有較強(qiáng)耐受性和產(chǎn)酒精、酯類物質(zhì)能力的酵母菌[8]；彭俊等[9]研究發(fā)現(xiàn)，來自酒醅的東方伊薩酵母菌能夠在高溫42 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)8%的環(huán)境中存活，且在液態(tài)發(fā)酵中的乙醇和乙酸乙酯產(chǎn)量可達(dá)8.2%和385.5 mg/L。

篩選較高耐受性同時高產(chǎn)酒精或風(fēng)味物質(zhì)的酵母菌對于提高白酒的產(chǎn)量、質(zhì)量有重要意義[10]，東方伊薩酵母菌具有這些特質(zhì)。熊小毛等[8]將低產(chǎn)高級醇的東方伊薩酵母菌制成強(qiáng)化曲并用于生產(chǎn)實驗，使得兼香型白酒三輪次原酒中正丙醇的含量下降了27.4%，出酒率提高了22.9%。目前，關(guān)于東方伊薩酵母菌在醬香型白酒堆積培菌中的應(yīng)用還未見報道。

本研究從醬香型酒醅中分離篩選產(chǎn)酒生香能力較強(qiáng)且適合醬香型白酒發(fā)酵環(huán)境的優(yōu)良菌株，通過形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行鑒定，并利用該菌株進(jìn)行醬香型白酒的強(qiáng)化堆積培菌試驗，探究其對風(fēng)味物質(zhì)和微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，為其在醬香型白酒中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和試劑

玉米：市售；醬香型白酒一輪次堆積酒醅、成品大曲粉、醬香型白酒第四輪次糟醅（酸度為2.56 mmol/10 g，淀粉含量為19.64%）：茅臺鎮(zhèn)某酒廠；2-辛醇（色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇（色譜純）：天津市江天化工技術(shù)有限公司；乳酸（色譜純）、乙酸（色譜純）：天津市津科精細(xì)化工研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基[11]：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，pH自然，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

種子液培養(yǎng)基[11]：將玉米水解液的糖度調(diào)節(jié)至12°Bx，添加硫酸銨6 g/L，硫酸鎂1.2 g/L，磷酸氫二鉀2.4 g/L，pH自然，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

高粱汁培養(yǎng)基[11]：將高粱水解液的糖度調(diào)節(jié)至18°Bx，pH自然，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

堆積酒醅：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的成品大曲粉與醬香型白酒第四輪次糟醅混勻。

1.2 儀器與設(shè)備

789013型氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、MSD-5977B型氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國安捷倫科技有限公司；固相微萃取手柄、50 μm CAR/DVB/PDMS纖維萃取頭：美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母菌的分離篩選

酵母菌的分離和純化：取醬香型白酒一輪次堆積酒醅10 g，與90 mL無菌蒸餾水混合并充分振蕩30 min，按10倍梯度稀釋至10-7，吸取梯度稀釋液涂布于YPD培養(yǎng)基，30 ℃下恒溫培養(yǎng)24～72 h，挑取單菌落進(jìn)行劃線純化，保藏于YPD斜面。

種子液的制備：從斜面上挑取1環(huán)酵母菌接種到5 mL種子培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接于45 mL種子培養(yǎng)基中，相同條件繼續(xù)培養(yǎng)16 h。

液態(tài)發(fā)酵：吸取15 mL酵母種子液接種于135 mL高粱汁培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)7 d，設(shè)置3組平行實驗。發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液的酒精度和乙酸乙酯含量。

1.3.2 菌株的鑒定

形態(tài)觀察：參照《伯杰士手冊》對純化后的菌株進(jìn)行菌落和細(xì)胞形態(tài)觀察。

分子生物學(xué)鑒定：提取分離菌株的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板對菌株的26S rDNA基因序列進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增[12]，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托天津金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果提交到美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，Blast）進(jìn)行搜索比對分析，選取同源性較高的模式菌株的26S rDNA基因序列，使用MEGA5.1軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 菌株的耐受性試驗

采用杜氏管法[13]測定酵母菌株對乙醇（體積分?jǐn)?shù)8%～14%）、乙酸（0.1%～0.7%）和乳酸（2%～5%）的耐受能力；采用點平板法[14]測定其耐高溫能力（30～45 ℃）。

1.3.4 堆積培菌試驗

按照0、3%、5%、7%的接種量將酵母種子液分別接種于100 g堆積酒醅中，將加水量補(bǔ)至7%并充分混勻。按接種量從小到大依次將上述酒醅分別命名為酒醅1～4。之后分裝酒醅于三角瓶中，用6層紗布封口，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，設(shè)置3組平行實驗。發(fā)酵結(jié)束后測定酒醅中揮發(fā)性物質(zhì)（乙酸乙酯和乳酸乙酯、其他揮發(fā)性成分）的含量及細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)。

1.3.5 分析方法

酒精度：使用比重法測定[15]。

乙酸乙酯和乳酸乙酯：取50 g酒醅與5 mL無水乙醇、200 mL蒸餾水混勻，蒸餾并收集100 mL餾出液。使用0.22 μm濾膜過濾餾出液并裝入氣相小瓶中，利用氣相色譜法測定乙酸乙酯和乳酸乙酯含量[10]。

風(fēng)味物質(zhì)：采用氣相色譜-質(zhì)譜法[16]測定餾出液中的風(fēng)味成分，通過質(zhì)荷比在質(zhì)譜庫中的匹配度對被測物質(zhì)進(jìn)行定性分析，以2-辛醇（840 mg/L）作為內(nèi)標(biāo)對其進(jìn)行半定量分析。

細(xì)菌群落組成分析：將磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH=8.0）和酒醅樣品充分混合，使用布氏漏斗反復(fù)過濾混合液體，重復(fù)3～5次。在7 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，收集底部菌泥，委托上海派諾森生物科技有限公司進(jìn)行高通量測序和操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析，使用云平臺分析細(xì)菌多樣性指數(shù)及群落組成變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離與篩選

采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法共分離、純化得到20株酵母菌株，對分離、純化后的酵母菌進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵實驗，最終篩選得到7株有較高產(chǎn)酒精和乙酸乙酯能力的酵母菌，結(jié)果見表1。由表1可知，菌株GTY-837產(chǎn)乙酸乙酯能力最高，為361.30 mg/L，產(chǎn)酒能力為8.97%vol均顯著高于其他菌株（P＜0.05）。

表1 酵母菌產(chǎn)酒及乙酸乙酯能力測定結(jié)果Table 1 Determination results of the liquor and ethyl acetate producing ability of yeast

2.2 菌株GTY-837的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株GTY-837的菌落及細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1可知，菌株GTY-837的菌落呈不規(guī)則圓形，乳白色，隆起，質(zhì)地柔軟，表面覆有絨毛、略有光澤；細(xì)胞形態(tài)為短棒形或長卵形，營出芽生殖。參照《伯杰士手冊》初步鑒定該菌株為畢赤酵母屬（Pichiasp.）或伊薩酵母屬（Issatchenkiasp.）。

圖1 菌株GTY-837的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphology of strain GTY-837

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

基于26S rDNA基因序列構(gòu)建菌株GTY-837的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

圖2 基于26S rDNA基因序列菌株GTY-837的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain GTY-837 based on 26S rDNA gene sequences

由圖2可知，菌株GTY-837與東方伊薩酵母菌（Issatchenkia orientalis）YZ4（EU394711.1：20-581）聚于一支，親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)觀察結(jié)果，將該菌株鑒定為東方伊薩酵母菌（Issatchenkia orientalis）。

2.3 菌株GTY-837的耐受性試驗

菌株GTY-837對乙醇、乙酸、乳酸及高溫的耐受性見表2。由表2可知，菌株GTY-837能夠耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)10%、乙酸0.5%、乳酸4.0%，且在40 ℃高溫下仍能生長。在醬香型白酒的生產(chǎn)過程中，第五輪次堆醅的酒精含量為1%vol～3%vol，發(fā)酵結(jié)束后酸度為2.4～2.6 mmol/10 g（以乙酸計），溫度為32～47 ℃[17]。耐受性試驗結(jié)果說明菌株GTY-837能夠適應(yīng)五輪次堆醅的發(fā)酵環(huán)境，而該菌株同時還具有較強(qiáng)的產(chǎn)酒生香能力，因此能夠用于酸性環(huán)境下的堆積培菌試驗。

表2 菌株GTY-837的耐受性試驗結(jié)果Table 2 Results of tolerance test of strain GTY-837

2.4 堆積培菌實驗

2.4.1 酒醅中乙酸乙酯和乳酸乙酯含量的測定

采用菌株GTY-837進(jìn)行堆積培菌實驗，酒醅中乙酸乙酯和乳酸乙酯含量的測定結(jié)果見圖3。由圖3可知，酒醅2中乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量最高，分別為1 080.21 mg/L和187.42 mg/L，與酒醅1相比提高了4 059.45%和70.99%；酒醅3中，2種酯類的含量明顯降低，酒醅4中2種酯類的含量大幅增加，這可能是由于接種量的改變對酒醅微生物菌群組成產(chǎn)生了不同的影響，如一些產(chǎn)酸菌豐度的增加可能會減弱菌株GTY-837的產(chǎn)酯性能[18]，具體原因有待進(jìn)一步研究。

圖3 酒醅中乙酸乙酯和乳酸乙酯含量測定結(jié)果Fig.3 Determination results of ethyl acetate and ethyl lactate contents in fermented grains

2.4.2 酒醅中風(fēng)味成分分析

酒醅1和酒醅2中的揮發(fā)性成分測定結(jié)果見表3。

表3 酒醅中揮發(fā)性物質(zhì)檢測結(jié)果Table 3 Determination results of volatile components in fermented grains

由表3可知，在酒醅1中共檢測到23種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酯類9種，醇類9種，芳香族3種，呋喃類1種，吡嗪類1種；而酒醅2中共檢測到22種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酯類12種，醇類5種，芳香族1種，呋喃類3種，吡嗪類1種。

酯類：酯類物質(zhì)具有典型的水果香、花香味，是中國白酒的主要呈香成分。與酒醅1相比，酒醅2中乙酸乙酯（蘋果香氣、清香）、L（-）-乳酸乙酯、乙酸苯乙酯和丙酸乙酯的含量大幅增加，其中乙酸乙酯廣泛、大量存在于白酒中，是構(gòu)成酒體風(fēng)味的“第一大酯”。乳酸乙酯、月桂酸乙酯和肉豆蔻酸乙酯的含量明顯減少?？傮w上，酒醅中酯類物質(zhì)的種類和含量顯著增加。

醇類：醇類物質(zhì)是白酒中一類重要的呈香呈味物質(zhì)。與酒醅1相比，酒醅2中異丁醇（青草氣味）、正丁醇、異戊醇（割青草味）和正己醇等雜醇油的含量顯著減少。同時，酒醅2中乙醇含量也明顯減少，分析原因可能主要是菌株GTY-837利用乙醇生成了大量的乙酯類物質(zhì)[20]。

芳香族：酒醅2中苯乙醇（玫瑰香氣）的含量大幅增加且苯甲醛和苯乙醛的含量明顯減少。其中，苯乙醇是白酒中主要的芳香族物質(zhì)之一[21]。

呋喃類：酒醅2中呋喃類物質(zhì)的含量和種類均有增加，這類物質(zhì)屬于羰基化合物，在醬香型白酒中的含量較高。

吡嗪類：在酒醅1、2中均檢測到了2,3,5,6-四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP）（堅果味），酒醅2的TTMP含量較酒醅1有所下降，這可能是菌株GTY-837抑制了芽孢桿菌屬微生物的生長并導(dǎo)致吡嗪類物質(zhì)的含量降低[22]，實際原因需要深入探究。

2.5 堆積培菌對酒醅細(xì)菌群落組成的影響

堆積發(fā)酵結(jié)束時，入窖酒醅中的微生物主要為酵母菌和細(xì)菌。接種菌株GTY-837后酒醅中絕對優(yōu)勢真菌為酵母菌，而細(xì)菌群落的變化未知；另外，由2.4.1可知各酒醅中乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量差異顯著。因此，為了進(jìn)一步探究主要風(fēng)味成分含量發(fā)生變化的原因，對堆積過程細(xì)菌群落組成及其變化進(jìn)行了測序并分析。

2.5.1 細(xì)菌群落測序數(shù)據(jù)分析

酒醅中細(xì)菌菌群的α-多樣性指數(shù)見表4。由表4可知，酒醅樣品中細(xì)菌的有效測序數(shù)為96 459～130 057條，細(xì)菌屬為217～334，Coverage指數(shù)為0.986～0.991，Chao1指數(shù)為1 660～2 586，Shannon指數(shù)為5.96～7.18。酒醅樣品的Coverage指數(shù)接近1，說明測序結(jié)果能反映絕大多數(shù)樣品細(xì)菌群落的信息；酒醅3中細(xì)菌屬最多且Chao1指數(shù)最大，說明細(xì)菌豐富度較高，酒醅2的Shannon指數(shù)最大，說明細(xì)菌多樣性較高。

表4 酒醅樣品中細(xì)菌群落α-多樣性分析結(jié)果Table 4 Results of α-diversity analysis of bacterial community in fermented grains

2.5.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

基于屬水平酒醅樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分析結(jié)果見圖4。由圖4可知，堆積酒醅中有14個細(xì)菌屬的相對豐度＞1%，包括克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、枝芽孢菌屬（Virgibacillus）、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、Tepidimicrobium、Georgenia、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、嗜熱放線菌屬（Thermoactinomyces）、中國芽孢桿菌屬（Sinibacillus）、Caldicoprobacter、蔗糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和喜熱裂孢菌屬（Thermobifida）。

圖4 基于屬水平酒醅樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分析結(jié)果Fig.4 Analysis result of bacterial community composition in fermented grains based on genus level

由圖4可知，酒醅樣品中5個共有細(xì)菌屬的相對豐度較高，分別為克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、枝芽孢菌屬（Virgibacillus）和海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）。其中，克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）的相對豐度為11.18%～32.94%，分別在酒醅1、2和4中的相對豐度最大；鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）的相對豐度為10.38%～29.45%，是酒醅3中的絕對優(yōu)勢菌屬；另外，芽孢桿菌屬（Bacillus）的相對豐度為8.72%～13.82%，枝芽孢菌屬（Virgibacillus）的相對豐度為8.26%～17.24%，海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）的相對豐度為5.54%～10.95%。

克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）是一種嗜熱菌屬[23]，主要存在于高溫大曲和堆積發(fā)酵酒醅[24]中，有報道稱克羅彭斯特菌屬在入窖發(fā)酵階段處于高豐度但低活性或休眠狀態(tài)[25]。

鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）是一類環(huán)境功能微生物，有一定耐高溫性[26]和較強(qiáng)的代謝糖類并生成有機(jī)酸類的能力[27-28]。鞘氨醇單胞菌屬在酒醅3中相對豐度最高，過高的酸度可能是抑制菌株GTY-837產(chǎn)酯并導(dǎo)致酒醅中酯類物質(zhì)含量劇減的主要原因。

芽孢桿菌屬（Bacillus）微生物普遍存在于大曲和堆積酒醅中，是“醬味”的主要貢獻(xiàn)菌屬，在產(chǎn)酶、糖化和生香的過程中扮演著重要的角色[29]，且能代謝產(chǎn)生乙偶姻并通過一系列化學(xué)反應(yīng)最終生成吡嗪類物質(zhì)[30]，酒醅2中四甲基吡嗪含量減少可能是由芽孢桿菌屬豐度降低造成的。

枝芽孢菌屬（Virgibacillus）在酒醅4中相對豐度最高，這是一類嗜鹽微生物且多分布在鹽場，能夠代謝產(chǎn)生植物素[31]；海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillu）分布在珊瑚礁[32]、含鹽土壤[33]和生產(chǎn)設(shè)備表面[34]等環(huán)境中，可以產(chǎn)生多種蛋白酶類[35]。

3 結(jié)論

本研究從醬香型酒醅中篩選得到了一株有較高產(chǎn)酒、生香能力的菌株GTY-837，經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為東方伊薩酵母菌（Issatchenkia orientalis）；通過耐受性試驗發(fā)現(xiàn)該菌株可以耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)10%、乙酸0.5%、乳酸4.0%，并能在40 ℃的高溫下生長，能適應(yīng)醬香型白酒五輪次堆積發(fā)酵環(huán)境；接種菌株GTY-837進(jìn)行堆積培菌實驗，發(fā)現(xiàn)菌株GTY-837接種量為3%時，酒醅中乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量與空白相比分別提高了4 059.45%和70.99%，同時，其他酯類、芳香族和呋喃類物質(zhì)的含量也明顯增加，但TTMP含量降低，分析原因可能是菌株GTY-837抑制了芽孢桿菌屬（Bacillus）的生長所致。當(dāng)菌株GTY-837接種量為5%時，酒醅中高產(chǎn)酸菌屬-鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）的相對豐度明顯提高，這可能是抑制菌株GTY-837代謝產(chǎn)乳酸乙酯和乙酸乙酯的主要原因。綜上，菌株GTY-837具有優(yōu)良的發(fā)酵性能，在堆積培菌過程中能夠顯著提升酒醅中酯類物質(zhì)的種類和含量，在實際生產(chǎn)中是否能達(dá)到理想的效果還需進(jìn)行發(fā)酵驗證。此外，接種菌株GTY-837會減少酒醅的TTMP含量，可考慮同時接種東方伊薩酵母菌和功能性芽孢桿菌以強(qiáng)化堆積培菌過程，實現(xiàn)醬香型酒醅風(fēng)味成分的平衡。