不同氨基酸對(duì)模擬葡萄汁發(fā)酵的影響

侯陽(yáng)陽(yáng)，楊哲皓，張夢(mèng)瑤，劉灑灑，江曉楠，史榮超，楊曉兵

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

葡萄酒發(fā)酵是由釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）主導(dǎo)的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程[1]。氮是發(fā)酵過(guò)程中極其重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，參與蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁和核酸合成，不僅影響酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵速率，還會(huì)產(chǎn)生最終決定葡萄酒感官質(zhì)量的化合物[2-3]。氨基酸與銨鹽是葡萄中的主要含氮化合物，因葡萄品種、砧木、葡萄園管理、環(huán)境條件和生長(zhǎng)季節(jié)不同，在葡萄汁中含氮化合物的質(zhì)量濃度范圍為300～5 000 mg/L（40～700 mg N/L）[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，至少葡萄汁中含氮化合物的質(zhì)量濃度300 mg N/L才能完成葡萄酒發(fā)酵[6]。釀酒葡萄中的氮不足會(huì)導(dǎo)致葡萄酒釀造過(guò)程酵母細(xì)胞數(shù)量過(guò)低，從而引起發(fā)酵緩慢甚至停滯以及微生物污染等問(wèn)題[7]。工業(yè)上，有兩種方式解決氮不足的問(wèn)題：一是外源添加足量氮源；二是引入足量酵母菌，從其他發(fā)酵罐中添加足夠的生物量或接種更高的酵母量[8]。在實(shí)際生產(chǎn)中，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)移生物量存在技術(shù)難度大、污染風(fēng)險(xiǎn)高和細(xì)胞適應(yīng)差等問(wèn)題[9]。增大接種量則使購(gòu)買(mǎi)商業(yè)酵母的成本增加以及傳代次數(shù)減少，后者會(huì)影響次生代謝物的合成，進(jìn)而影響葡萄酒的香氣和口感[8-9]。目前，應(yīng)對(duì)氮不足的常用方法是補(bǔ)充氮源，如硫酸銨或磷酸銨形式的銨鹽[10]。然而，過(guò)量添加銨鹽會(huì)生成致癌物氨基甲酸乙酯（ethylcarbamate，EC），對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生負(fù)面影響[11]。在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中，補(bǔ)充氮源的時(shí)機(jī)有兩個(gè)：在發(fā)酵起始時(shí)，在發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)，在發(fā)酵起始時(shí)補(bǔ)加氮存在增加對(duì)系統(tǒng)瞬時(shí)最大瞬時(shí)能量的需求的缺點(diǎn)[12]。目前在葡萄酒工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中氮源的補(bǔ)加是根據(jù)釀酒師的經(jīng)驗(yàn)來(lái)操作的，因此在基礎(chǔ)發(fā)酵液的氮源也可以基本滿足發(fā)酵的基礎(chǔ)上，考察過(guò)量的氮源補(bǔ)加造成的影響是本研究想要探究的內(nèi)容[13]。

為了探究氨基酸（amino acid，AA）是否適合作為葡萄酒發(fā)酵的補(bǔ)加氮源，本研究以模擬葡萄汁為原料，分別將組氨酸（histidine，His）、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、色氨酸（tryptophan，Trp）、絲氨酸（serine，Ser）、半胱氨酸（cysteine，Cys）、甘氨酸（glycine，Gly）、丙氨酸（alanine，Ala）、纈氨酸（valine，Val）、亮氨酸（leucine，Leu）、谷氨酸（glutamate，Glu）、谷氨酰胺（glutamine，Gln）、脯氨酸（proline，Pro）、精氨酸（arginine，Arg）、天冬氨酸（aspartate，Asp）、天冬酰胺（asparagine，Asn）、蛋氨酸（methionine，Met）、蘇氨酸（threonine，Thr）和賴(lài)氨酸（lysine，Lys）等18種氨基酸分別在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）F15進(jìn)入發(fā)酵穩(wěn)定期時(shí)添加到發(fā)酵基質(zhì)中，從發(fā)酵過(guò)程釀酒酵母的生長(zhǎng)、發(fā)酵速率以及發(fā)酵結(jié)束乙醇、有機(jī)酸和高級(jí)醇含量對(duì)比18種氨基酸作為補(bǔ)加氮源對(duì)葡萄酒發(fā)酵過(guò)程和品質(zhì)的影響，以探究氨基酸作為葡萄酒發(fā)酵氮不足時(shí)補(bǔ)加氮源的可能性，為葡萄酒釀造過(guò)程補(bǔ)加氮源提供參考和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）F15：法國(guó)Laffort公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

葡萄糖：西王藥業(yè)有限公司；果糖：山東西王糖業(yè)有限公司；蘋(píng)果酸：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；酒石酸、琥珀酸、乙酸，組氨酸（His）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、絲氨酸（Ser）、胱氨酸（Cys）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）、脯氨酸（Pro）、精氨酸（Arg）、天冬氨酸（Asp）、天冬酰胺（Asn）、蘇氨酸（Thr）、賴(lài)氨酸（Lys）：上海麥克林生化科技有限公司；乳酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甘氨酸（Gly）：科昊生物工程有限責(zé)任公司；蛋氨酸（Met）：生工生物工程（上海）股份有限公司；乙醇：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：上海科豐實(shí)業(yè)有限公司；2-辛醇：北京百靈威科技有限公司。所有試劑均為分析純。

1.1.3 模擬葡萄汁的制備

實(shí)驗(yàn)在模擬葡萄汁中進(jìn)行，以保證實(shí)驗(yàn)條件的標(biāo)準(zhǔn)性，避免葡萄汁成分發(fā)生改變引起的變化。

模擬葡萄汁培養(yǎng)基：參考BELY M等的[12]配方。氮300 mg N/L，100 g/L葡萄糖，100 g/L果糖，5 g/L蘋(píng)果酸，3 g/L酒石酸和0.5 g/L檸檬酸，無(wú)厭氧因子[13]。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；ZQZY-85CS振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；EVOLU TION 220紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：賽默飛世爾科技有限公司；SBA-40D生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所；LC-2030 PLUS高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司；HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm）：美國(guó)Bio-Rad公司；57348-U 50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、PAL RSI 120 SPME進(jìn)樣器、HP-INNOWax毛細(xì)管柱（60 m×250 μm×0.25 μm）、Agilent 7890B 氣相色譜儀、Agilent 5977B 質(zhì)譜儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母活化

將酵母干粉緩慢加入其10倍質(zhì)量的37 ℃溫水中活化，靜置20 min后緩慢加入模擬葡萄汁培養(yǎng)基中，接種量為200 mg/L。

1.3.2 葡萄酒發(fā)酵

2 L三角瓶裝1.8 L模擬葡萄汁培養(yǎng)基，接種活化的釀酒酵母F15于28 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，每隔6 h測(cè)定生物量（OD600nm值），12 h測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組殘?zhí)恰．?dāng)發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)，以每份150 mL分裝到250 mL三角瓶中，分別添加40 mg N/L、80 mg N/L和200 mg N/L單一氮源，根據(jù)補(bǔ)加氨基酸（amino acid，AA）種類(lèi)及相應(yīng)質(zhì)量濃度，分別簡(jiǎn)寫(xiě)為AA 40、AA 80和AA 200，AA代表相應(yīng)氨基酸氮源，以不添加氮源為對(duì)照（CK）。每隔8 h測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組生物量、CO2釋放量和殘?zhí)?，殘?zhí)牵? g/L，則認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束。將三角瓶轉(zhuǎn)移到4 ℃冰箱中，待其自然澄清，取10 mL上清液，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱下，用于發(fā)酵產(chǎn)物分析。

1.3.3 分析檢測(cè)

還原糖含量的測(cè)定：DNS法[14]。

CO2釋放量測(cè)定：充分晃動(dòng)三角瓶，使二氧化碳完全逸出，用電子天平稱(chēng)質(zhì)量。

乙醇含量測(cè)定：將發(fā)酵液用去離子水稀釋到合適濃度，用SBA-40D生物傳感分析儀測(cè)定。

酒石酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸、乳酸和乙酸采用HPLC法測(cè)定[15]。其色譜條件為：HPX-87H 色譜柱（300 mm×7.8 mm），檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器（波長(zhǎng)210 nm），流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4溶液，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫55 ℃；除Met 200實(shí)驗(yàn)組分析時(shí)間40 min外，其余實(shí)驗(yàn)組均為25 min。采用標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間對(duì)比進(jìn)行有機(jī)酸定性，峰面積外標(biāo)法定量。

利用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HSSPME-GC-MS）技術(shù)測(cè)定揮發(fā)性化合物[16]。樣品前處理：20 mL頂空瓶中加入1 mL樣品，1 g氯化鈉，3 mL去離子水，10 μL內(nèi)標(biāo)（2-辛醇，16 mg/L），40 ℃孵育30 min，萃取30 min，250 ℃解吸8 min。

GC條件：使用HP-INNOWax毛細(xì)管柱（60 m×250 μm×0.25 μm），載氣為高純氦氣（He），流速1 mL/min；升溫程序：40 ℃保持3 min，以4 ℃/min升溫到160 ℃，再以7 ℃/min升溫到220 ℃，保持8 min。

MS條件：電子離子（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，傳輸線和離子源溫度分別為280 ℃和230 ℃。掃描范圍29～350 amu。

定性定量方法：運(yùn)用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）17.L對(duì)圖譜進(jìn)行初步檢索及分析，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)比對(duì)解析，確認(rèn)各個(gè)揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)成分。采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析（假定校正因子為1），內(nèi)標(biāo)為2-辛醇（質(zhì)量濃度16 mg/L）；待測(cè)揮發(fā)性物質(zhì)成分定量分析計(jì)算公式如下：

式中：Ci為待測(cè)揮發(fā)性物質(zhì)含量，μg/L；Ai為待測(cè)揮發(fā)性物質(zhì)峰面積；As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)2-辛醇的峰面積；Cs為樣品中2-辛醇的含量，μg；4為樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3個(gè)重復(fù)的平均值。采用Minitab 18軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，采用Tukey檢驗(yàn)法進(jìn)行方差分析。采用Origin 2019軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氨基酸對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響

不同氨基酸條件下（氨基酸是在釀酒酵母發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期即OD600nm值不再增加時(shí)，分別添加40 mg N/L、80 mg N/L和200 mg N/L三種質(zhì)量濃度的單種氨基酸，在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)測(cè)定OD600nm值監(jiān)測(cè)釀酒酵母的生物量變化，用釀酒酵母補(bǔ)加氨基酸后的OD600nm值最大值得到圖1。由圖1可知，Cys 200的生物量顯著低于對(duì)照、Cys 40和Cys 80（P＜0.05）。因?yàn)镃ys會(huì)對(duì)釀酒酵母產(chǎn)生毒性并且毒性具有濃度依賴(lài)性，在釀酒酵母以Cys為硫源生長(zhǎng)的條件下，沒(méi)有或者只有輕微的毒性，而當(dāng)含硫氨基酸作為氮源被降解時(shí)，會(huì)產(chǎn)生毒性很強(qiáng)的亞硫酸抑制釀酒酵母生長(zhǎng)[17]。His、Phe、Trp、Ser、Gly、Val、Leu、Arg、Asp、Asn、Met、Thr和Lys三個(gè)質(zhì)量濃度之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。Ala、Glu、Gln、Pro和Asn的釀酒酵母最大生物量隨氮源質(zhì)量濃度增加而增加，Ala 40與Ala 200，Pro 40與Pro 200之間存在顯著性差異（P＜0.05）。最大生物量顯著性大于對(duì)照組的只有Ala和Val組（P＜0.05）。這與BELTRAN G等[18]得到的生長(zhǎng)期補(bǔ)加氮才增加生物量的結(jié)論并不相同?？梢?jiàn)氨基酸作為補(bǔ)加氮源時(shí)，釀酒酵母的生長(zhǎng)會(huì)增加或降低。根據(jù)釀酒酵母以單一氨基酸為氮源的生長(zhǎng)速率，氨基酸被劃分為“偏好”和“非偏好”兩類(lèi)氮源[19]。比如，一般認(rèn)為Gln和Asn是偏好氮源，Met是非偏好氮源，具體分類(lèi)因酵母而異[20]。因此，在穩(wěn)定期氨基酸作為補(bǔ)加氮源釀酒酵母的生長(zhǎng)變化的現(xiàn)象可能與釀酒酵母氮源利用偏好性有關(guān)[21]。個(gè)別氨基酸（如Cys）的分解產(chǎn)物是否存在抑制作用也會(huì)影響釀酒酵母的而生長(zhǎng)。從氨基酸對(duì)釀酒酵母發(fā)酵生長(zhǎng)的影響來(lái)看，補(bǔ)加200 mg N/L的Ala和Val兩種氨基酸的效果最佳。

圖1 不同氨基酸對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of different amino acids on the growth of Saccharomyces cerevisiae

2.2 不同氨基酸對(duì)釀酒酵母發(fā)酵速率的影響

釀酒酵母的發(fā)酵速率可由CO2釋放速率間接表示，補(bǔ)加氮源后平均CO2釋放速率見(jiàn)圖2。

圖2 不同氨基酸對(duì)釀酒酵母CO2釋放速率的影響Fig.2 Effects of different amino acids on CO2 release rate of Saccharomyces cerevisiae

由圖2可知，18種氨基酸按照其對(duì)發(fā)酵速率的影響可以分為三類(lèi)：①隨質(zhì)量濃度增加發(fā)酵速率加快，Phe、Ala、Glu、Gln、Arg、Asp和Asn；②對(duì)發(fā)酵速率的影響與質(zhì)量濃度無(wú)關(guān)，His、Trp、Ser、Gly、Val、Leu、Pro和Met；③隨質(zhì)量濃度增加發(fā)酵速率下降，Cys、Thr和Lys。與對(duì)照相比，Cys 200、Met 40、Met 80、Met 200、Lys 80和Lys 200的平均CO2釋放速率顯著下降（P＜0.05）。Cys 200平均CO2釋放速率下降的原因可能與其生長(zhǎng)受到抑制有關(guān)。Lys抑制葡萄酒發(fā)酵這一現(xiàn)象與DUC C等[22]的研究結(jié)果一致，雖機(jī)理未明，但從本研究中可以看出這與發(fā)酵液中Lys的質(zhì)量濃度有關(guān)，推測(cè)Lys對(duì)釀酒酵母的抑制影響具有濃度依賴(lài)性。Phe 40、Trp 40、Trp 80、Trp 200、Cys 40、Cys 80、Gln 40、Pro 40、Pro 80、Pro 200、Arg 40和Asn 40、Asn 80、Asn 200的平均CO2釋放速率與對(duì)照無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。其余組的平均CO2釋放速率都顯著大于對(duì)照組（P＜0.05），這與SEGUINOT P等[23]得出的穩(wěn)定期補(bǔ)加氮能增加發(fā)酵速率提高糖利用率的結(jié)論一致。從氮源對(duì)釀酒酵母發(fā)酵速率的影響來(lái)看，第二類(lèi)中的Met和第三類(lèi)中的Cys和Lys并不適合作為補(bǔ)加氮源。其余氨基酸比較適合作為補(bǔ)加氮源，并且大部分氨基酸在80 mg N/L和200 mg N/L時(shí)無(wú)顯著性差異（P＞0.05），從經(jīng)濟(jì)角度考慮，80 mg N/L的添加量最為適宜。

2.3 不同氨基酸對(duì)乙醇含量的影響

乙醇是葡萄酒的主要成分，決定了葡萄酒的粘度（酒體），并起到固定香氣的作用[24]。不同氨基酸對(duì)乙醇含量的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，Ser 40、Ser 80、Ser 200、Cys 40、Cys 80、Cys 200、Gly 40、Gly 80、Ala 40、Ala 200、Val 40、Val 80、Val 200、Leu 40、Leu 80、Leu 200、Glu 40、Glu 80、Glu 200、Asp 40、Asp 80、Asp 200、Thr 40和Lys 40的乙醇含量顯著增加（P＜0.05），氮對(duì)乙醇含量的影響取決于氮的種類(lèi)，這與VILANOVA M等[25-26]的研究一致。這些促進(jìn)乙醇含量增加的氮源基本也是促進(jìn)釀酒酵母發(fā)酵速率的氨源。造成這種現(xiàn)象的原因可能有兩個(gè)：一是發(fā)酵速率增加縮短了發(fā)酵周期，使發(fā)酵過(guò)程中的乙醇揮發(fā)損失減少；二是充足的氮源刺激了蛋白質(zhì)的合成，尤其是糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，增加了乙醇含量[27]。從氨基酸對(duì)乙醇的影響來(lái)看，對(duì)乙醇含量無(wú)顯著性影響的氨基酸（His、Phe、Trp、Gln、Pro、Arg、Asn和Met）顯然更適合作為補(bǔ)加氮源。

圖3 不同氨基酸對(duì)乙醇含量的影響Fig.3 Effects of different amino acids on ethanol contents

2.4 不同氨基酸對(duì)有機(jī)酸含量的影響

不同氨基酸可通過(guò)多種機(jī)制影響有機(jī)酸的代謝，但關(guān)于其機(jī)制的闡述寥寥無(wú)幾[28]。在本研究中，不同氨基酸對(duì)有機(jī)酸含量的影響見(jiàn)圖4。

由圖4A可知，在補(bǔ)加氮源40 mg N/L時(shí)，只有His、Phe、Trp、Arg、Asp和Lys的蘋(píng)果酸含量顯著高于對(duì)照（P＜0.05）；在補(bǔ)加氮源80 mg N/L時(shí)，Ser、Cys、Gln、Asn和Thr的蘋(píng)果酸含量也顯著高于對(duì)照（P＜0.05）；在補(bǔ)加氮源200 mg N/L時(shí)，Gly、Ala、Val和Leu的蘋(píng)果酸含量也顯著高于對(duì)照（P＜0.05）。蘋(píng)果酸含量隨補(bǔ)加的氮源質(zhì)量濃度增加而增加。特別地是，Lys組蘋(píng)果酸含量雖然都顯著高于對(duì)照（P＜0.05），但蘋(píng)果酸含量隨補(bǔ)加氮源質(zhì)量濃度增加而下降。

圖4 不同氨基酸對(duì)有機(jī)酸含量的影響Fig.4 Effects of different amino acids on organic acids contents

琥珀酸是釀酒酵母酒精發(fā)酵過(guò)程形成的主要非揮發(fā)酸，在葡萄酒中最高為3 g/L[29]。由圖4B可知，只有Cys組中琥珀酸顯著增加（P＜0.05），在3.5～4.4 g/L之間。

由圖4C可知，釀酒酵母丙酮酸脫羧酶活性缺陷，不存在有效的乳酸合成途徑，只能產(chǎn)生微量的乳酸。除Cys 200外，其余組乳酸在0～0.3 g/L之間。

在蘋(píng)果酸、琥珀酸和乳酸中存在一個(gè)共同的現(xiàn)象，Cys 80和Cys 200顯著增加了其含量（P＜0.05）?？赡苁荂ys具有較強(qiáng)的還原性，導(dǎo)致代謝通路的氧化還原狀態(tài)發(fā)生了改變，從而促進(jìn)了有機(jī)酸的產(chǎn)生[16]。

乙酸是葡萄酒中主要的揮發(fā)酸。由圖4D可知，除Lys 200外，其余組的乙酸含量在0.2～0.7 g/L之間，在乙酸積累的最佳質(zhì)量濃度范圍內(nèi)[30]。Lys 200的乙酸的質(zhì)量濃度達(dá)到了0.9 g/L，是對(duì)照的2.6倍。雖然并沒(méi)有超出國(guó)標(biāo)GB 15037—2006《葡萄酒》規(guī)定的上限1.2 g/L，但可能正是因?yàn)橐宜岷砍鲎罴奄|(zhì)量濃度范圍對(duì)釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生了抑制作用，導(dǎo)致Lys 200的發(fā)酵速率受到抑制[31]。在葡萄酒釀造過(guò)程中，乙酸主要是由乙醛脫氫酶催化乙醛生成，造成Lys 200乙酸過(guò)多積累的原因可能是乙醛脫氫酶活性增加[32]。葡萄酒的品質(zhì)與糖酸比直接相關(guān)，酸含量過(guò)高會(huì)使葡萄酒過(guò)于酸和尖銳。由此可見(jiàn)，Cys和Lys并不適合作為補(bǔ)加氮源。就蘋(píng)果酸而言，補(bǔ)加較高質(zhì)量濃度的氮源也是不可取的。因此，從氨基酸對(duì)有機(jī)酸的含量的影響來(lái)看，除了Cys和Lys以外的氨基酸比較適合作為補(bǔ)加氮源，40 mg N/L的添加量最為適宜。

2.5 不同氨基酸對(duì)高級(jí)醇含量的影響

高級(jí)醇也被成為雜醇，是發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的碳原子數(shù)＞2的揮發(fā)性醇[33]。對(duì)葡萄酒香氣有重要影響，總量低于300 mg/L時(shí)，可增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性，超過(guò)400 mg/L會(huì)使葡萄酒的香氣變得粗糙[34]。不同氨基酸對(duì)高級(jí)醇含量的影響見(jiàn)表1。由表1可知，本研究共檢出5種高級(jí)醇，結(jié)果表明補(bǔ)加發(fā)酵香氣物質(zhì)合成的前體氨基酸Phe、Gly、Ala、Val、Leu和Met時(shí)，能顯著提高酒中高級(jí)醇的含量（P＜0.05），而且含量與補(bǔ)加量呈正相關(guān)，這與王亞欽等[35]研究結(jié)果一致。Met組產(chǎn)生的較多3-甲硫基丙醇可繼續(xù)氧化或者與其他化合物形成含硫揮發(fā)物，對(duì)葡萄酒的感官品質(zhì)造成不良影響。其余的四種高級(jí)醇都對(duì)葡萄酒的香氣復(fù)雜性有積極影響。從氨基酸對(duì)高級(jí)醇含量的影響來(lái)看，Phe、Gly、Ala、Val和Leu比較適合作為補(bǔ)加氮源，并且80 mg N/L的添加量最為適宜。

表1 不同氨基酸對(duì)高級(jí)醇含量的影響Table 1 Effects of different amino acids on higher alcohol contents

續(xù)表

3 結(jié)論

本研究在釀酒酵母葡萄酒發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)分別補(bǔ)加18種氨基酸，對(duì)不同氨基酸作為補(bǔ)加氮源對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)和發(fā)酵速率以及最終的乙醇、有機(jī)酸和高級(jí)醇含量的影響進(jìn)行了探究。結(jié)果表明，丙氨酸族氨基酸（Ala、Val和Leu）作為補(bǔ)加氮源時(shí)，釀酒酵母發(fā)酵速率增加，乙醇含量增加了1%，有機(jī)酸含量變化較小。此外，Ala和Val顯著增加了釀酒酵母的生物量以及異丁醇的含量（P＜0.05），Leu顯著增加了異戊醇的含量（P＜0.05），增加了葡萄酒的香氣復(fù)雜性。含硫氨基酸（Cys和Met）會(huì)抑制釀酒酵母的發(fā)酵速率。Cys 200不僅顯著抑制釀酒酵母的生長(zhǎng)（P＜0.05），對(duì)有機(jī)酸的代謝也產(chǎn)生較大干擾，其有機(jī)酸總量是對(duì)照的2倍，破壞了葡萄酒的糖酸平衡。而Met產(chǎn)生了較多的3-甲硫基丙醇，對(duì)葡萄酒感官品質(zhì)存在潛在負(fù)面影響。Lys 200抑制釀酒酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵速率，產(chǎn)生了過(guò)高的乙酸。因此，丙氨酸族的Ala和Val比較適合作為葡萄酒釀造過(guò)程的補(bǔ)加氮源，含硫氨基酸和Lys不適合作補(bǔ)加氮源。