氟硼二吡咯光敏劑的合成及其抗腫瘤活性研究

欒天驕，曹亞萍，王萌萌，袁澤利

(遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099)

光動(dòng)力治療(Photodynamic therapy，PDT)是基于光化學(xué)反應(yīng)的一種新型治療技術(shù)，已經(jīng)被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床中皮膚、腔體等癌癥的治療，具有創(chuàng)傷小、可重復(fù)治療、毒副作用小、療效確切及與其他治療方案聯(lián)用產(chǎn)生聯(lián)合或協(xié)同效應(yīng)等諸多優(yōu)勢(shì)[1-2]，是當(dāng)前腫瘤治療研究的熱門課題之一[3-6]。PDT主要包括光敏劑、氧氣及光三要素，其中光敏劑是該療法的核心要素。因此，探尋光學(xué)性能優(yōu)良、組成單一、毒性低(暗毒性弱而光毒性強(qiáng))以及治療窗口寬的光敏劑是PDT取得突破的關(guān)鍵[5-8]。

在眾多的光敏劑探尋中，氮雜氟硼二吡咯分子(Aza-BODIPY,BOD)因具有合成簡(jiǎn)單、光學(xué)性能優(yōu)良、產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)而受到研究者們極大關(guān)注[9-10]，當(dāng)前在2和6位進(jìn)行重原子取代效應(yīng)的光敏劑研究取得了可喜的研究進(jìn)展[11-12]。為進(jìn)一步豐富氮雜氟硼二吡咯光敏劑，本文將2和6位用非重原子取代，在meso位用苯甲醇取代制備了一個(gè)氮雜氟硼二吡咯先導(dǎo)化合物(BOD-OH)，并通過分子、細(xì)胞和活體三個(gè)層面考察其光物理性質(zhì)、體內(nèi)外的光動(dòng)力抗腫瘤活性。合成路線如圖1所示：

圖1 BOD-OH的合成路線

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 1,3-二苯基異苯并呋喃(1,3-Diphenylisobenzofuran,DBPF)，對(duì)羥甲基苯甲醛，三氟化硼乙醚，2,4-二甲基-3-乙基-1H-吡咯，三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA),2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(2,3-dicyano-5,6-dichlorobenzoquinone,DDQ)，羅丹明6G，二氫卟吩(Chlorin e6 ,Ce6)及苯丁酸氮芥等均為分析純，購自薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司或百靈威試劑有限公司。其余試劑未作特殊說明均為分析純。

1.2 儀器 Varian 1000 FT-IR紅外光譜儀(美國瓦里安公司)；安捷倫400 MHz-DD2磁共振儀(美國安捷倫公司)；CKX41倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；CM1950冷凍切片機(jī)(德國Leica公司)；全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀(美國Thermo 公司)；TU-1901紫外-可見吸收光譜儀(北京普析公司)；Carry Eclipse熒光分光光度計(jì)(美國瓦里安公司)。

1.3 方法

1.3.1 目標(biāo)光敏劑(BOD-OH)的合成 將0.244 g(2 mmol)對(duì)羥甲基苯甲醛溶解于100 mL二氯甲烷中，通入氬氣15 min后，繼續(xù)加入0.492 g(4 mmol)2,4-二甲基-3-乙基-1H-吡咯，隨后往反應(yīng)液中滴入1-2 滴TFA，于室溫下攪拌12 h后，再加入0.908 g(4 mmol)的DDQ，繼續(xù)攪拌4 h，往反應(yīng)液中再加入1.01 g(10 mmol)三乙胺后繼續(xù)攪拌15 min。將反應(yīng)液置于冰浴下，緩慢滴加2.12 g(15 mmol)三氟化硼乙醚，滴畢，于室溫下繼續(xù)攪拌過夜。用二氯甲烷(100 mL×3)萃取反應(yīng)液，合并有機(jī)相并用無水硫酸鈉干燥后，用二氯甲烷/石油醚(v∶v=1∶7)作洗脫劑過硅膠柱，得橙紅色粉末。

1.3.2 光物理性質(zhì)測(cè)定 以甲醇-水(v∶v=1∶1)為溶劑，將BOD-OH配制成1×10-5mol/L待測(cè)液，用TU-1901紫外-可見分光光度計(jì)和Carry Eclipse熒光分光光度計(jì)測(cè)其吸收光譜和熒光光譜(狹縫寬度為2.5 nm，電壓中等)；用DPBF作為單線態(tài)氧捕獲劑，在410 nm處測(cè)定BOD-OH的單線態(tài)氧產(chǎn)生能力。以羅丹明 6G為熒光量子產(chǎn)率的參比物，測(cè)定BOD-OH的熒光量子產(chǎn)率，并按課題組前期方法計(jì)算[13]。

1.3.3 4T1細(xì)胞培養(yǎng)及體外光動(dòng)力效應(yīng) 4T1(小鼠乳腺癌細(xì)胞)腫瘤細(xì)胞復(fù)蘇后，在含有10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃和5% CO2條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)。采用MTT法考察BOD-OH對(duì)4T1細(xì)胞在光照(光動(dòng)力活性)和避光(暗毒性)的生長(zhǎng)抑制活性[13]。步驟為：取上述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1腫瘤細(xì)胞，接種于96孔板中(2.0×104～5×104個(gè)/mL)，置于5% CO2、飽和濕度及37 ℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后，分別加入5、10、20、40、60、80、100和120 μg/L的受試化合物，暗室孵育20 h，用功率為500 mW/cm2溴鎢燈光照，于37℃暗室孵育4 h，于每孔加入10 μL (5 mg/mL)的MTT溶液和90 μL培養(yǎng)基，再于37℃暗室孵育4 h，將孔內(nèi)液體吸棄，每孔加入100 μL DMSO，室溫下振搖5 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)490 nm OD值。細(xì)胞增殖抑制率公式為：抑制率=1-[OD(樣品)-OD(空白)]/[(OD細(xì)胞對(duì)照-OD空白)]×100%。暗毒性考察不需光照，其他條件同上。

1.3.4 腫瘤模型的建立 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為3～4周的雌性Balb/C小鼠，購于斯貝福(北京)生物科技有限公司，動(dòng)物飼養(yǎng)及操作均遵照遵義醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心要求，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，皮下注射100 μL濃度為1×106個(gè)/mL的4T1細(xì)胞，繼續(xù)喂養(yǎng)7～8 d，待腫瘤長(zhǎng)到長(zhǎng)寬約5 mm左右時(shí)即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 體內(nèi)光動(dòng)力治療性能研究 隨機(jī)選取1.3.4中建立的腫瘤小鼠，并隨機(jī)按每組4只分組：以PBS為空白組；以化療藥物苯丁酸氮芥為陰性對(duì)照組；市售光敏劑Ce 6為陽性對(duì)照組；用BOD-OH為實(shí)驗(yàn)組，上述分組均含光照組與暗室組。給藥劑量100 μL，濃度2 μmol/L，給藥方式為瘤內(nèi)注射。

光照組需使用二極管激光燈(532 nm,500 mW/cm2)對(duì)腫瘤部位照射擬定的時(shí)間，每隔4天注射1次化合物并進(jìn)行光照1次，暗室組僅注射化合物而不進(jìn)行光照，每天稱量每組小鼠體重并用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)和寬，總治療時(shí)長(zhǎng)為15 d。15 d后，將各組小鼠處死，取腫瘤稱重。

1.4 數(shù)據(jù)處理 所有的數(shù)據(jù)均用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，用Origin 8軟件作圖。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。并使用單因素方差分析進(jìn)行組間比較。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BOD-OH的合成與結(jié)構(gòu)表征 用乙基占據(jù)的2,4-二甲基-3-乙基-1H-吡咯與對(duì)羥甲基苯甲醛在TFA和DDQ催化下以50%的產(chǎn)率一鍋獲得BOD-OH，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，所得數(shù)據(jù)如下：m.p:245 ℃,1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ 7.46-7.48 (d,J= 8.0 Hz,2H),7.26-7.28 (d,J= 8.1 Hz,2H),4.80 (d,J= 3.0 Hz,2H),2.52 (s,6H),2.26-2.32 (q,J= 7.6 Hz,4H),1.27 (s,6H),0.95-0.99 (t,J= 7.6 Hz,6H)。13C NMR (101 MHz,CDCl3),δ 153.65,141.55,139.92,138.31,134.94,132.72,130.87,130.55,128.40,127.25,64.81,17.03,14.60,12.48,11.75。FT-IR (KBr,4 000-400 cm-1) δ:3 558,2 954,2 917,2 859,1 529,1 469,1 398,1 311,1 247,1 182,1 114,1 056,971,752,694,525。

2.2 BOD-OH的光物理性質(zhì) 為證實(shí)合成的BOD-OH具有優(yōu)良的光學(xué)性能，將其以甲醇-水(v∶v=1∶1)配制成1×10-5mol/L待測(cè)液后，用TU-1901紫外-可見分光光度計(jì)和Carry Eclipse熒光分光光度計(jì)測(cè)其吸收光譜和熒光光譜，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2可見，BOD-OH的最大吸收波長(zhǎng)在532 nm處(見圖2A)，熒光發(fā)射波長(zhǎng)為542 nm(見圖2B)，具有較好的摩爾吸光系數(shù)和熒光強(qiáng)度。以羅丹明6G作為熒光量子產(chǎn)率標(biāo)準(zhǔn)參照物，按課題組前期類似的方法[13]經(jīng)計(jì)算得BOD-OH的熒光量子產(chǎn)率為0.78，僅比羅丹明6G小0.01。表明其有與商業(yè)光敏劑相差不大的熒光量子產(chǎn)率，具有良好的光學(xué)性能。

A：吸收光譜；B：熒光光譜。圖2 BOD-OH的光譜測(cè)量結(jié)果

2.3 BOD-OH的單線態(tài)氧產(chǎn)生能力 一個(gè)化合物能否作為光敏劑，除具有良好的光學(xué)性能外，其在光輻射下產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力是決定其光敏性的關(guān)鍵。為考察BOD-OH光輻射產(chǎn)生單線態(tài)氧的性能，以課題組常用的DBPF為單線態(tài)氧捕獲劑[13]，分別考察DBPF和DBPF與BOD-OH混合物在不同的光輻射時(shí)間后，溶液在410 nm處的吸光度變化情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

光輻射條件:532 nm,500 mW/cm2。圖3 不同時(shí)間光輻射BOD-OH分解DBPF

由圖3可以看出，在光輻射5 min內(nèi)，單獨(dú)光輻射DBPF溶液在410 nm處的吸光度未發(fā)生變化，表明光輻射DBPF不能使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。而在BOD-OH與DBPF混合液中，隨著光輻射時(shí)間的增加，DBPF在410 nm的吸光度逐漸減小，這是由于單線態(tài)氧使DBPF發(fā)生分解而結(jié)構(gòu)改變，使其在410 nm處吸光度減小，表明光輻射BOD-OH有單線態(tài)氧的產(chǎn)生。

2.4 BOD-OH的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 鑒于BOD-OH的良好熒光量子產(chǎn)率和光分解產(chǎn)生單線態(tài)氧的性能，接下來考察BOD-OH與4T1細(xì)胞共孵育后的細(xì)胞攝取情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。由圖4可見，隨著孵育時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增大，當(dāng)孵育時(shí)間到6 h后，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度達(dá)最大值。表明BOD-OH能較快地進(jìn)入4T1細(xì)胞，具有較好的細(xì)胞攝取性能，這為BOD在體內(nèi)外進(jìn)行PDT療效實(shí)驗(yàn)提供了指導(dǎo)。

圖4 BOD-OH與4T1細(xì)胞不同孵育時(shí)間下的熒光成像

2.5 BOD-OH的光動(dòng)力細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn) 良好的光敏劑需要其在細(xì)胞層面暗毒性低而光毒性強(qiáng)，為進(jìn)一步證實(shí)BOD-OH的體外光動(dòng)力效能，以苯丁酸氮芥為陰性對(duì)照，用MTT法考察在相同光劑量下BOD-OH及苯丁酸氮芥分別對(duì)4T1細(xì)胞的細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

A：避光；B：光照(光照時(shí)間5 min;光條件：532 nm,500 mW/cm2)；n=3。圖5 苯丁酸氮芥和BOD-OH對(duì)4T1細(xì)胞存活率

由圖5A可以看出，在未光照下兩個(gè)化合物對(duì)4T1細(xì)胞的存活率均在95%以上，表明它們對(duì)受試的4T1細(xì)胞沒有化療作用，也即無暗毒性。相反，在相同光劑量輻射下(見圖5B)，苯丁酸氮芥即使在0.6 μmol/L下光輻射5 min，細(xì)胞存活率仍在88%以上；而BOD-OH在光輻射5 min后，即使在0.1μmol/L濃度下，細(xì)胞存活率即低于50%；而在0.6 μmol/L下的細(xì)胞存活率不足2%，表明BOD-OH對(duì)受試的4T1細(xì)胞具有較強(qiáng)的光動(dòng)力活性。

2.6 BOD-OH的體內(nèi)光動(dòng)力效能 光敏劑往往在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的PDT治療效果，而體內(nèi)DPT治療效果欠佳。這是由于活體組織對(duì)光的吸收等因素影響光敏劑獲得有效的光能量，從而影響PDT治療的活體應(yīng)用。鑒于BOD-OH對(duì)4T1細(xì)胞具有暗毒性弱而光動(dòng)力活性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)一步通過4T1荷瘤小鼠腫瘤模型，考察其體內(nèi)光動(dòng)力抗腫瘤效能。

考慮到活體組織對(duì)光的吸收，為獲得體內(nèi)PDT治療的最佳光輻射時(shí)間，本文先考察了不同光輻射時(shí)間下BOD-OH對(duì)4T1荷瘤小鼠腫瘤模型的PDT性能。實(shí)驗(yàn)以PBS為空白對(duì)照，于瘤內(nèi)給藥(PBS或BOD-OH，給藥劑量為100 μL，BOD-OH濃度為2 μmol/L，每4天給藥1次)后光輻射不同時(shí)間，每天分別測(cè)小鼠的體重和腫瘤尺寸，15 d后處死小鼠，取腫瘤進(jìn)行稱重，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。

A：腫瘤體積變化情況；B：小鼠體重變化情況；C：15 d后的腫瘤質(zhì)量變化情況；光條件：532 nm,500 mW/cm2；n=4。圖6 生理鹽水和BOD-OH對(duì)4T1荷瘤小鼠不同光輻射下的光動(dòng)力效能

由圖6可以看出，控制組生理鹽水無論在避光還是在不同的光照時(shí)間后均對(duì)腫瘤沒有顯著的PDT作用。同樣，在避光條件下，BOD-OH也對(duì)腫瘤沒有顯著的治療作用。相反，BOD-OH在光照后有顯著的治療作用，且隨著光輻射時(shí)間的增加，PDT治療作用增強(qiáng)，但當(dāng)光輻射時(shí)間達(dá)到10 min后，即使再增加光輻射時(shí)間到15 min，也未能提升PDT治療作用，說明BOD-OH在體內(nèi)的PDT抗腫瘤治療以光輻射10 min為最佳時(shí)間。

體內(nèi)最佳光輻射時(shí)間為BOD-OH在同樣條件下與商業(yè)光敏劑進(jìn)行療效對(duì)比研究提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)指導(dǎo)。為此，本文以化療藥物苯丁酸氮芥和商業(yè)光敏劑Ce6(PDT治療)為對(duì)照，固定光照時(shí)間為10 min，于上述同樣條件下，對(duì)4T1荷瘤小鼠腫瘤模型的PDT作用進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果示于圖7。

A：腫瘤體積變化情況；B：小鼠體重變化情況；C：15 d后的腫瘤質(zhì)量變化情況；光條件：532 nm,500 mW/cm2(n=4)。圖7 生理鹽水、苯丁酸氮芥、Ce6及BOD-OH對(duì)4T1荷瘤小鼠的光動(dòng)力效能

由圖7可以看出，控制組生理鹽水無論在避光還是光輻射下均未表現(xiàn)出抗腫瘤作用?；熕幬锉蕉∷岬鎸?duì)腫瘤的抑制率為17.27%，光照后的腫瘤抑制率為16.85%，表明其無PDT腫瘤治療作用。對(duì)于商業(yè)光敏劑Ce6而言，在沒有光輻射下，其表現(xiàn)出了較強(qiáng)的暗毒性(化療作用)，腫瘤抑制率達(dá)39.16%；光輻射后腫瘤抑制率略有提高，腫瘤抑制率為41.16%，表明其具有較弱的PDT腫瘤治療作用。在同樣實(shí)驗(yàn)條件下，本文構(gòu)建的BOD-OH在避光下僅有12.41%的腫瘤抑制率(化療作用)；當(dāng)光輻射后，其腫瘤抑制率高達(dá)83.38%，說明其具有良好的體內(nèi)PDT腫瘤治療作用。

3 討論

3.1 BOD-OH的合成、結(jié)構(gòu)表征及光學(xué)性能

3.1.1 BOD-OH的合成 探尋性能優(yōu)良的新光敏劑一直是研究者們熱衷的課題[11-12]，本文基于BODIPY類光敏劑的合成簡(jiǎn)單、光學(xué)性能優(yōu)良、產(chǎn)生單線態(tài)氧等優(yōu)勢(shì)，開展了一個(gè)BODIPY光敏劑的合成。文獻(xiàn)多以重原子取代方式制備BODIPY光敏劑[14-15]，然而，重原子取代后雖能使BODIPY類光敏劑吸收波長(zhǎng)改變，但重原子的引入使單線態(tài)氧的量子產(chǎn)率降低[14-15]。有研究者通過meso位取代BODIPY光敏劑也能提升其光動(dòng)力效能[16]。為此，本文將2,6位用乙基取代，并在meso位含酚取代，設(shè)計(jì)合成了一個(gè)BODIPY先導(dǎo)化合物BOD-OH。

3.1.2 BOD-OH的結(jié)構(gòu)表征 在BOD-OH的1H NMR波譜中，在7.26～7.46 ppm出現(xiàn)了4個(gè)質(zhì)子化學(xué)位移，對(duì)應(yīng)于芳環(huán)的4個(gè)質(zhì)子；在4.80 ppm處為芐醇的亞甲基兩個(gè)質(zhì)子化學(xué)位移；在2.26～2.32 ppm出現(xiàn)了吡咯相連乙基中兩個(gè)亞甲基的4個(gè)質(zhì)子化學(xué)位移；0.85～2.52 ppm出現(xiàn)了3組甲基共18個(gè)質(zhì)子化學(xué)位移，上述質(zhì)子的數(shù)目與預(yù)期結(jié)構(gòu)吻合。在BOD-OH的13C NMR波譜中，于153.65,-127.25 ppm出現(xiàn)了芳環(huán)、吡咯環(huán)碳的信號(hào)；而在64.81～11.75 ppm出現(xiàn)了亞甲基、甲基的碳信號(hào)。在BOD-OH的紅外光譜中，于3 558 cm-1處出現(xiàn)的為羥基特征振動(dòng)吸收峰；在2 954、2 917和2 859為甲基和亞甲基的特征振動(dòng)吸收峰。上述結(jié)構(gòu)表征充分說明成功合成得到預(yù)期的目標(biāo)分子結(jié)構(gòu)。

3.1.3 BOD-OH的光學(xué)性能 將BOD-OH配制成甲醇-水(v:v=1∶1)溶液后，通過吸收光譜和熒光光譜測(cè)定，表明其具有較好的摩爾吸光系數(shù)和強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。以商業(yè)的光敏劑羅丹明6G為參比，測(cè)得BOD-OH的熒光量子產(chǎn)率僅比羅丹明6G熒光量子產(chǎn)率降低了0.1，表明其具有較好的光學(xué)性能，可作為潛在的光敏劑。

3.2 BOH-OH的PDT性能 細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BOD-OH對(duì)受試的4T1細(xì)胞具有避光下的低毒性和光輻射下的強(qiáng)的光毒性，其對(duì)受試的4T1細(xì)胞的IC50達(dá)0.071 μmol/L。說明其在細(xì)胞層面滿足毒性低(暗毒性弱而光毒性強(qiáng))的光敏劑要求。在體內(nèi)的4T1腫瘤模型中，BOD-OH也表現(xiàn)出了較低的毒性和較高的PDT性能。與商業(yè)的光敏劑Ce6相比，Ce6的暗毒性是BOD-OH的3.1倍，而BOD-OH的PDT性能是Ce6的2.1倍。這表明本文構(gòu)建的光敏劑對(duì)受試的4T1腫瘤模型具有更為優(yōu)良的光敏劑PDT性能，值得進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本文所得BOD-OH具有制備簡(jiǎn)便、光學(xué)性能優(yōu)良、組成單一，且在體內(nèi)外均具有暗毒性弱而光毒性強(qiáng)的顯著優(yōu)勢(shì)，為開發(fā)BODIPY類光敏劑提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，值得進(jìn)一步深入研究。