不同香型再造煙葉濃縮液化學(xué)成分和微生物組差異性研究

黃申，閆美玲，蘆堯，田泱源，毛多斌，蘆昶彤，陳芝飛，馮穎杰

1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司，河南 許昌 461000；3.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，河南 鄭州 450000

0 引言

煙草薄片是卷煙工業(yè)的重要原料，再造煙葉濃縮液(以下稱濃縮液)作為煙草薄片的主體成分，提高其品質(zhì)具有重要價值[1-2]. 目前，對煙草薄片常規(guī)化學(xué)成分及致香成分多有研究報道[3-5]，形成了系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)及檢測方法，然而，對不同香型再造煙葉濃縮液化學(xué)成分差異進(jìn)行的系統(tǒng)研究則相對較少.

近年來，采用高通量測序技術(shù)研究煙草微生物群落結(jié)構(gòu)已有報道. R.E.Tyx等[6]研究了干鼻煙、濕鼻煙等煙草制品中微生物的多樣性和分類豐度，共鑒定出來自放線菌門、厚壁菌門、變形菌門等的33菌屬；B.B.Hu等[7]采用高通量測序方法系統(tǒng)研究了煙葉在烤制過程中微生物種群的變化，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落的組成較簡單且優(yōu)勢種群占比較高，而真菌的多樣性明顯優(yōu)于細(xì)菌，且種群更穩(wěn)定.舒明等[8]對生產(chǎn)過程中的煙葉水提液進(jìn)行了高通量測序，發(fā)現(xiàn)煙葉水提液中細(xì)菌種群組成非常豐富，其優(yōu)勢菌屬是乳桿菌屬(Lactobacillus)和賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus). 陳澤斌等[9-10]研究發(fā)現(xiàn),煙草組織中有豐富的微生物，且芽孢桿菌屬細(xì)菌是其優(yōu)勢種群. H.G.Liu等[11]為研究煙葉濃縮液細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，對煙葉濃縮液進(jìn)行了焦磷酸測序，發(fā)現(xiàn)濃縮液中優(yōu)勢屬為乳桿菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬和假單胞菌屬(Pseudomonas). 王沖等[12]通過18S rDNA和16S rDNA測序發(fā)現(xiàn),再造煙葉濃縮液微生物真菌種群的豐富度和多樣性低于細(xì)菌. 但目前尚未發(fā)現(xiàn)不同香型再造煙葉濃縮液中微生物對比分析的相關(guān)報道.

鑒于此，本文擬對濃香型、中間香型和清香型3種香型再造煙葉濃縮液的化學(xué)成分、中性香味成分及微生物組進(jìn)行研究，通過連續(xù)流動法測定其常規(guī)化學(xué)成分，采用GC-MS法檢測其中性香味成分，并通過高通量測序分析其微生物組，以期揭示不同香型再造煙葉濃縮液化學(xué)成分及微生物組差異.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

材料：濃香型再造煙葉濃縮液(以下簡寫為濃香型濃縮液)、中間香型再造煙葉濃縮液(以下簡寫為中間香型濃縮液)、清香型再造煙葉濃縮液(以下簡寫為清香型濃縮液). 不同香型煙葉原料均由河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司提供，濃縮液制備工藝如下：將不同香型煙末、煙梗，分別和水以固液比1∶4的比例混合，在50 ℃條件下浸提，用擠干機(jī)擠出水萃液，濃縮成干物質(zhì)量為40%、波美度為25 °Bé、密度為1.22 g/cm3的不同香型濃縮液.

主要試劑：二氯甲烷(色譜純)，購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司.

主要儀器：Agilent 6890a/5975c型GC-MS色譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司產(chǎn)；J6-MI型冷凍離心機(jī)，美國Beckman公司產(chǎn)；San+連續(xù)流動分析儀，荷蘭Skalar公司產(chǎn).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 常規(guī)化學(xué)成分檢測常規(guī)化學(xué)成分主要包括氯、水溶性總糖、總植物堿、總氮和鉀，其含量測定按煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(連續(xù)流動法)進(jìn)行測定[13-17].

1.2.2 中性香味成分檢測取濃縮液樣品20.5 mL置于1000 mL的圓底燒瓶中，加入500 mL的水和沸石，同時蒸餾萃取150 min，獲得二氯甲烷萃取液約80 mL，參考黃申等[18]的方法對濃縮液的中性香味成分進(jìn)行提取，并采用GC-MS法進(jìn)行分析.

1.2.3 濃縮液16SrDNA和ITSrDNA序列測序取濃縮液樣品于10 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，收集菌體細(xì)胞沉淀后送上海生工生物工程股份有限公司測序，流程如下.

1)Illumina測序：Illumina MiseqTM/HiseqTM測得的圖像經(jīng)堿基識別分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列.

2)數(shù)據(jù)預(yù)處理：使用cutadapt去除Miseq測序時添加的引物接頭；根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系使用PEAR將成對reads拼接成一條序列；從拼接后數(shù)據(jù)中分割出各樣本數(shù)據(jù)并校正序列方向；使用PRINSEQ切除reads尾部低質(zhì)量值堿基.

3)OTU聚類：提取各樣本優(yōu)化序列中的非重復(fù)序列(不含單序列)；16S使用Blast比對GTDB數(shù)據(jù)庫；ITS使用Blast比對UNITE數(shù)據(jù)庫，按照97%相似性對非重復(fù)序列進(jìn)行OTU聚類，在分類學(xué)水平上統(tǒng)計各樣本的群落組成；基于OTU聚類分析結(jié)果，對OTU進(jìn)行多樣性指數(shù)分析，包括PCA分析、物種分布韋恩圖分析、相對豐度分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 常規(guī)化學(xué)成分分析

不同香型濃縮液常規(guī)化學(xué)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)如表1所示. 由表1可知，清香型、中間香型和濃香型濃縮液水溶性總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同，其中清香型最高，為9.6%，中間香型次之，濃香型最低，為9.2%. 濃香型的總植物堿、氯、總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，分別為1.2%、0.7%、1.6%，中間香型和清香型較低，分別為1.1%、0.6%、1.5%，這與已有研究結(jié)果[4-6]大致相同. 濃香型和清香型濃縮液鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為2.8%，中間香型為2.7%. 總體看來，不同香型濃縮液常規(guī)化學(xué)成分間的差異符合不同香型煙葉化學(xué)成分的差異，這種差異是由于原料的差別導(dǎo)致的.

表1 不同香型濃縮液常規(guī)化學(xué)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Mass fraction of conventional chemical components in different flavor concentrates %

2.2 中性香味成分分析

采用歸一化法對清香型、中間香型和濃香型濃縮液離子流進(jìn)行分析，得到不同香型濃縮液中性香味成分結(jié)果(見表2). 由表2可知，中間香型濃縮液的香味成分種類最多，濃香型次之，清香型最少；2-乙?；秽珒H在濃香型濃縮液中檢出，但質(zhì)量濃度較少，為0.418 μg/mL；法尼基丙酮僅在清香型濃縮液中檢出且質(zhì)量濃度較高，為11.395 μg/mL.清香型濃縮液中α-大馬酮和二氫獼猴桃內(nèi)酯質(zhì)量濃度較高，分別為5.279 μg/mL和3.218 μg/mL，中間香型和濃香型較少；巨豆三烯酮和金合歡醇質(zhì)量濃度差異最顯著，清香型濃縮液中分別為22.476 μg/mL和0.777 μg/mL，中間香型濃縮液分別為13.776 μg/mL和0.349 μg/mL，濃香型濃縮液中的分別為11.135 μg/mL和0.364 μg/mL，這兩種香味物質(zhì)在清香型濃縮液中的質(zhì)量濃度是其他香型濃縮液的近2倍；濃香型濃縮液中芳樟醇和2-乙?；量┵|(zhì)量濃度最高，分別為0.285 μg/mL和2.745 μg/mL，中間香型次之，清香型最低，這與已有研究結(jié)果[3]大致相同.

表2 不同香型濃縮液中性香味成分表Table 2 Neutral aroma components of different flavor concentrates

2.3 微生物組分析

2.3.1Illumina測序分析將濃香型、中間香型和清香型濃縮液3種樣品的Illumina測序原始數(shù)據(jù)上傳到NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)，其SRA號分別為SRR14936429、SRR14993896和SRR14936360，經(jīng)過denovo注釋獲得了不同香型濃縮液中微生物的有效序列數(shù)(見表3).由表3可知，3種濃縮液細(xì)菌微生物序列數(shù)呈現(xiàn)差異，其中清香型濃縮液中細(xì)菌微生物有效序列數(shù)最多，為94 533，濃香型次之，中間香型最少；真菌序列數(shù)呈現(xiàn)差異顯著，其中中間香型中真菌微生物有效序列數(shù)最多，為108 666，清香型次之，濃香型最少.

表3 不同香型濃縮液中微生物有效序列數(shù)Table 3 Number of effective sequence strips in different flavor concentrates

2.3.2OTU聚類分析對OTU代表序列采用GTDB數(shù)據(jù)庫和UNITE數(shù)據(jù)庫進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見表4.由表4可知，3種香型濃縮液中共測得芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬、伯克氏菌屬(Burkholderia)、苯基桿菌屬(Phenylobacterium)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、土地芽胞桿菌屬(Terribacillus)6個細(xì)菌屬類，酵母菌屬(Issatchenkia)，假絲酵母菌屬(Candida)，季也蒙酵母屬(Meyerozyma)、鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillaceae)、紅酵母屬(Rhodotorula)、短梗霉屬(Aureobasidium)、須腹菌屬(Rhizopogon)等11個真菌屬類. 3個樣品所共有的菌屬有8個，主要有2個優(yōu)勢屬類，分別是芽孢桿菌屬和乳酸桿菌屬. 結(jié)果表明，清香型濃縮液中的細(xì)菌多樣性最大，中間香型次之，濃香型最?。粷庀阈蜐饪s液中的真菌多樣性最大，中間香型次之，清香型最小.

表4 不同香型濃縮液OTU聚類結(jié)果Table 4 Results of OTU cluster of different flavor concentrates

2.3.3PCA物種相似度分析為分析不同香型濃縮液微生物群落組成之間的差異和距離，運(yùn)用方差分析，將樣品菌屬的差異反映在二維坐標(biāo)圖上(坐標(biāo)軸為能最大限度反映樣品間差異的兩個特征值)濃縮液中細(xì)菌微生物和真菌微生物PCA分析圖，如圖1所示. 樣品的菌屬多樣性越相似，圖中距離越近.由圖1a)可知，清香型與中間香型距離較近，而與濃香型之間距離較遠(yuǎn)，說明清香型與中間香型濃縮液之間細(xì)菌多樣性相似度較大，而與濃香型濃縮液之間細(xì)菌多樣性相似性較??；由圖1b)可知，清香型和濃香型距離較近，而與中間香型濃縮液之間距離較遠(yuǎn)，說明清香型和濃香型真菌多樣性相似度較大，而與中間香型濃縮液之間相似性較小.

圖1 濃縮液中細(xì)菌微生物和 真菌微生物PCA分析圖Fig.1 PCA diagram of bacterial and fungal in the concentrates

2.3.4 物種分布韋恩圖分析為統(tǒng)計不同香型濃縮液中共有的和獨(dú)有的OUT微生物群落，分析OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況，繪制物種分布韋恩圖(見圖2). 由圖2a)可知，3種濃縮液共有細(xì)菌菌屬為67種，清香型和中間香型共有47種，清香型和濃香型共有1種，中間香型獨(dú)有細(xì)菌菌屬最多，為59種，清香型次之，為21種，濃香型最少，為3種；由圖2b)可知，3種濃縮液共有真菌菌屬9種，中間香型和濃香型共有54種，中間香型和清香型共有7種，未檢到清香型和濃香型共有真菌菌屬，濃香型獨(dú)有真菌菌屬最多，為104種，中間香型次之，為28種，清香型最少，為1種.

圖2 濃縮液中細(xì)菌微生物和 真菌微生物OTU分布韋恩圖Fig.2 Venn diagram of bacterial and fungal OTU distribution in the concentrates

2.3.5 相對豐度分析為研究不同香型濃縮液的微生物豐度，確定優(yōu)勢菌屬，進(jìn)行相對豐度分析，結(jié)果見圖3. 由圖3a)可知，濃香型、中間香型和清香型3種濃縮液主要有兩個優(yōu)勢細(xì)菌屬類：芽孢桿菌屬和乳桿菌屬.其中，中間香型相對豐度最高，占比77.59%，清香型次之，占比73.62%，濃香型最低，占比57.61%；乳桿菌屬在濃香型中相對豐度最高，占比41.76%，清香型次之，占比23.1%，中間香型最低，占比16.76%；其他菌屬相對豐度很低. 由圖3b)可知，3種濃縮液中真菌微生物相對豐度呈現(xiàn)顯著差異，濃香型的優(yōu)勢菌屬類為多型漢遜酵母菌屬(Ogataea)和酵母菌屬，相對豐度分別為48.25%和15.38%；中間香型的優(yōu)勢菌屬類為德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)和假絲酵母菌屬，相對豐度分別為48.81%和49.08%；清香型的優(yōu)勢菌屬類為德巴利氏酵母屬，相對豐度為99.79%. 對濃縮液中微生物群落結(jié)構(gòu)分析已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，其優(yōu)勢細(xì)菌菌屬為乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、鏈球菌屬(Streptococcus)和假單胞菌屬，優(yōu)勢真菌菌屬為釀酒酵母屬(Kazachstania)和假絲酵母菌屬[8,11-12]，這與本文研究結(jié)果大致相同. 綜上所述，濃香型、中間香型和清香型濃縮液樣品中有相當(dāng)數(shù)量的共有微生物種群，其中細(xì)菌微生物種群大致相同，真菌微生物種群差異較大.

從屬水平上分析樣品微生物群落組成，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬和乳桿菌屬均屬于厚壁菌門，多型漢遜酵母菌屬和德巴利氏酵母屬均屬于子囊菌門，其中乳酸桿菌能夠利用糖產(chǎn)生乳酸，芽孢桿菌能產(chǎn)生芽孢，酵母菌發(fā)酵醇化濃縮液，它們都可以適應(yīng)濃縮液高糖、高滲透壓的環(huán)境，且在不同香型濃縮液中的分布各不相同.3種樣品中，水溶性總糖含量較高的濃縮液乳酸桿菌相對豐度較低，芽孢桿菌相對豐度較高，說明乳酸桿菌屬細(xì)菌和芽孢桿菌屬細(xì)菌對不同香型煙葉濃縮液環(huán)境表現(xiàn)出不同的耐受力. 可能的原因是乳酸桿菌屬細(xì)菌利用糖產(chǎn)生乳酸，受代謝產(chǎn)物的抑制數(shù)量較少，相反，芽孢桿菌屬細(xì)菌能夠通過形成芽孢成功地適應(yīng)環(huán)境，因此在清香型和中間香型濃縮液中呈現(xiàn)明顯的數(shù)量優(yōu)勢. 3種不同香型濃縮液中水溶性糖含量越高，濃縮液中芽孢桿菌相對豐度越高，巨豆三烯酮、2-乙?；秽吭礁? 這可能是由于濃縮液中芽孢桿菌越多，微生物利用再造煙葉濃縮液中類胡蘿卜素、還原糖、氨基酸產(chǎn)生香味物質(zhì)的數(shù)量越多、品質(zhì)越好，因此清香型中性香味成分的數(shù)量和質(zhì)量呈現(xiàn)明顯優(yōu)勢. 已有研究[19-20]也發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬微生物具有類似的功能.

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用連續(xù)流動法對不同香型濃縮液常規(guī)化學(xué)成分含量進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)清香型濃縮液中水溶性總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，濃香型濃縮液中總植物堿、氯和總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，中間香型濃縮液中常規(guī)化學(xué)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)大多在兩者之間. 利用GC-MS法對不同香型濃縮液中性香味成分進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)清香型濃縮液α-大馬酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、巨豆三烯酮和金合歡醇的質(zhì)量濃度較高，濃香型中芳樟醇和乙?；量┵|(zhì)量濃度較高，中間香型中性香味成分種類最多，質(zhì)量濃度大多在清香型與濃香型之間. 利用高通量測序?qū)Σ煌阈蜐饪s液中細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)清香型濃縮液中細(xì)菌物種多樣性最大，濃香型真菌物種多樣性最大；3種樣品的優(yōu)勢細(xì)菌菌屬均為芽孢桿菌屬和乳酸桿菌屬，濃香型的優(yōu)勢真菌菌屬類為多型漢遜酵母菌屬和酵母菌屬，中間香型和清香型為德巴利氏酵母屬.該研究能夠?yàn)槲覈煌阈惋L(fēng)格再造煙葉濃縮液的生物處理及利用研究提供理論參考.