RIP1/RIP3-MLKL 信號通路與慢性心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)

陳永鋒，李小榮，賴薇薇，朱飛宇，譚 鑫，鮮 維，康品方，王洪巨

蚌埠醫(yī)學(xué)院1第一附屬醫(yī)院心血管科，2心腦血管病基礎(chǔ)與臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3醫(yī)學(xué)影像學(xué)院2017 級1 班，安徽蚌埠233000

慢性心力衰竭（HF）是一種全球性疾病，目前世界HF人數(shù)大約增加到2300萬人，并且近一半的患者是射血分?jǐn)?shù)降低的心衰，其5年生存率為25%［1］。冠心病、糖尿病、心臟瓣膜病和心律失常等［2］心血管疾病可引起HF，因其在臨床癥狀上表現(xiàn)相對隱匿，其發(fā)現(xiàn)和診斷存在一定挑戰(zhàn)性。HF的發(fā)病機(jī)制多種多樣，目前研究較為明確的包括腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAS）的激活、心肌重構(gòu)、順應(yīng)性低下、交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)等，此外，現(xiàn)越來越多的證據(jù)表明程序性壞死亦參與心血管疾?。?,4］。

有研究發(fā)現(xiàn)，RIP1/RIP3-MLKL信號途徑在小鼠HF模型中表達(dá)上調(diào)，并用抑制劑或基因敲除技術(shù)阻斷該通路能使HF功能改善［5-7］。目前對該信號通路的研究在人HF疾病中尚未有明確報(bào)道，RIP1/RIP3-MLKL信號通路在HF患者中是否有同樣的表達(dá)需進(jìn)一步研究。因此本研究探索RIP1/RIP3-MLKL通路與HF的分級以及治療之間的關(guān)系，為慢性HF的發(fā)病機(jī)制和防治方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為逆轉(zhuǎn)慢性HF患者的心功能提供治療新靶點(diǎn)。

1 資料和方法

1.1 材料試劑

酶標(biāo)儀（BioTokinstrumentsIns）；RIP1 抗體、RIP3抗體、MLKL抗體和β-actin抗體（abcam）；ELISA檢測試劑盒：HumanRIP1、RIP3、MLKL（上海羽朵）；顯影儀（VIVILBER）。

1.2 研究對象

本研究為前瞻性分析性研究，入選2020年2月～2020年10月在我院接受治療的慢性HF患者（NYHAⅡ～Ⅳ級）。選擇同期本院21例健康對照者（對照組）。慢性HF患者納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)2017年美國心臟病學(xué)會（ACC）聯(lián)合美國心臟協(xié)會（AHA）發(fā)布的HF治療和診斷指南［8］，分組如下：對照組（n=21）、Ⅱ級組（n=20）、Ⅲ級組（n=33）、Ⅳ級組（n=43）。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有急性心肌梗死、心肌病、瓣膜病、先天性心臟病等嚴(yán)重原發(fā)心臟疾患以及合并有急性感染、嚴(yán)重原發(fā)代謝性疾病、風(fēng)濕免疫相關(guān)性疾病或懷疑有惡性消耗性疾病等其他嚴(yán)重疾患的患者被排除在本研究之外。納入者年齡在31～92歲，樣本的使用經(jīng)本院（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院）倫理委員會批準(zhǔn)，并取得所有受試者的知情同意。

1.3 樣本準(zhǔn)備

標(biāo)本準(zhǔn)備：通宵禁食后的早上采集所有患者的外周血置于EDTA抗凝管中，2 h內(nèi)以2000 r/min離心10 min，取離心后的上層血漿，血漿置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 ELISA法檢測對照組和慢性HF患者血漿中RIP1、RIP3、MLKL水平

使用HumanRIP1、RIP3、MLKL 檢測試劑盒，按ELISA廠家檢測說明，測定人血漿RIP1、RIP3、MLKL表達(dá)水平。

1.5 Western blot檢測RIP1/RIP3-MLKL信號通路在對照組和慢性HF患者機(jī)體表達(dá)情況

使用已分裝好的血漿，加入RIPA 后冰上裂解30 min，4 ℃離心機(jī)中15 000 r/min離心30 min，提取血漿總蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量法說明書測各組蛋白濃度，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，95 ℃變性5 min，每組取40 μg蛋白，配置10%SDS-PAGE凝膠，根據(jù)計(jì)算所得體積上樣后電泳（60 V，30 min待marker出現(xiàn)條帶分離后，調(diào)整為120 V，90 min待15 000相對分子質(zhì)量到達(dá)膠下緣是停止電泳）；轉(zhuǎn)膜（200 mA，2 h）至PVDF膜上；5%BSA液室溫封閉2 h（或4 ℃過夜）；一抗室溫孵育4 h（或4 ℃過夜），內(nèi)參選用β-actin［9］；TBST洗滌3次，10 min/次；二抗室溫孵育2 h；TBST洗滌3次，10 min/次；ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.6 臨床隨訪

本課題組對心功能Ⅳ級患者進(jìn)行為期5個(gè)月的隨訪，通過住院、門診或電話途徑，對比患者預(yù)后指標(biāo)LVEF、LVEDD、NT-ProBNP表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用單因素方差分析、SNK、Tamhane's T2檢驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。ImageJ8.0軟件分析Western blot條帶灰度值，Graphpad-prism8.3.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Spearman法分析RIP1/RIP3-MLKL的表達(dá)量與HF 相關(guān)性，pearson 法分析RIP1、RIP3、MLKL與Scr、AST、LVEF、LVEDD、NT-ProBNP的相關(guān)性，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)檢測患者預(yù)后指標(biāo)LVEF、LVEDD、NT-ProBNP的差異性。

2 結(jié)果

2.1 患者一般情況

在對照組、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四組中，各組間年齡、GLU、TG和LDL差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），WBC、HDL、AST、ALT、Scr差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表1）。

表1 各組臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data among the groups

2.2 受試者血漿中RIP1、RIP3和MLKL的含量

在本研究中慢性HF 患者年齡與RIP1、RIP3/MLKL的表達(dá)量無相關(guān)性（P>0.05）。ELISA檢測結(jié)果顯示，與正常組相比，心功能Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級組RIP1、RIP3、MLKL表達(dá)量均增加（PⅡRIP3=0.002，PⅡRIP1=0.001，余P<0.001）；與Ⅱ級組相比，心功能Ⅲ、Ⅳ級組RIP1、RIP3、MLKL表達(dá)量均增加（PⅢRIP1=0.001，余P<0.001）；與Ⅲ級組相比，心功能Ⅳ級組RIP1、MLKL表達(dá)量增加（P<0.001、P=0.044，表2）。

表2 人血漿中RIP1、RIP3和MLKL的表達(dá)水平Tab.2 Comparison of plasma levels of RIP1,RIP3 and MLKL among the 4 groups

2.3 受試者血漿中RIP1、RIP3和MLKL Western blot 檢測結(jié)果

Western blot檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，心功能Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級組RIP1、RIP3、MLKL表達(dá)量均增加（PⅣRIP1=0.003PⅡRIP3=0.009，PⅢRIP3=0.001，PⅣRIP3=0.003，PⅣMLKL=0.003，余P<0.001）；與Ⅱ級組相比，心功能Ⅲ、Ⅳ級組RIP1、RIP3、MLKL 表達(dá)量增加（PⅣRIP1=0.006，PⅢRIP3=0.004，PⅣMLKL=0.006，余P<0.001）；與Ⅲ級組相比，心功能Ⅳ級組RIP1、RIP3、MLKL表達(dá)量增加（PⅣRIP1=0.04，PⅣRIP3=0.002，PⅣMLKL=0.007，表3）。

2.4 RIP1、RIP3和MLKL與HF的相關(guān)性分析

運(yùn)用Spearman 相關(guān)分析，慢性HF 患者RIP1、RIP3、MLKL的表達(dá)量與心功能分級均呈正相關(guān)（P≤0.001，表3）。

表3 RIP1、RIP3、MLKL與心功能分級的相關(guān)分析Tab.3 Correlation analysis of RIP1,RIP3 and MLKL with cardiac function grades

2.5 RIP1、RIP3和MLKL與Scr、AST、LVEF、LVEDD、NT-ProBNP的相關(guān)性分析

經(jīng)pearson統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行相關(guān)性分析后，HF患者的RIP1/RIP3-MLKL與Scr、AST、LVEDD、NT-ProBNP呈正相關(guān)，與LVEF呈負(fù)相關(guān)（表4）。

表4 RIP1、RIP3和MLKL與Scr、AST、LVEF、LVEDD、NT-ProBNP的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation of RIP1,RIP3 and MLKL levels with Scr,AST,LVEF,LVEDD and NT-ProBNP

2.6 臨床隨訪

本課題組對以上心功能Ⅳ級患者進(jìn)行為期5個(gè)月的隨訪，共隨訪43人，失訪10人，有效例數(shù)33人，在心功能Ⅳ級的33例患者中，按照RIP1/RIP3-MLKL的總表達(dá)量以中位數(shù)為界值將患者分為低高2組（分別對應(yīng)A組16例，B組16例），對比兩組患者預(yù)后指標(biāo)：LVEF、LVEDD、NT-ProBNP表達(dá)情況。隨訪前對比A/B兩組患者NT-ProBNP、LVEF、LVEDD指標(biāo)無差異性（P>0.05），隨訪后A/B兩組患者NT-ProBNP、LVEF指標(biāo)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），LVEDD表達(dá)無差異（P>0.05，表5，6）。

表5 隨訪前A/B兩組患者NT-ProBNP、LVEF、LVEDD表達(dá)情況Tab.5 Expression of NT-proBNP,LVEF and LVEDD in patients with grade IV cardiac function with low(group A)and high RIP1/RIP3-MLKL expressions(group B)before follow-up

3 討論

HF是諸多心血管疾患發(fā)展到后期的臨床終末事件［10-12］，HF的發(fā)病機(jī)制與心室重構(gòu)、心肌細(xì)胞凋亡、增殖和心臟炎癥因子表達(dá)增加有關(guān)［13-16］。最新研究發(fā)現(xiàn)：程序性壞死RIP1/RIP3-MLKL信號通路已證實(shí)在大鼠HF模型中表達(dá)增加，而抑制該通路的激活和表達(dá)明顯改善HF大鼠心功能［5-7］。因此，研究HF患者血漿中RIP1/RIP3-MLKL標(biāo)志物水平變化，以及相關(guān)標(biāo)志物與HF患者預(yù)后關(guān)系，對于尋找治療HF心室重構(gòu)的藥物提供了新方向。

圖1 Western blot檢測RIP1/RIP3-MLKL通路蛋白表達(dá)Fig.1 Western blotting of protein expressions in the RIP1/RIP3/MLKL pathway (n=3).Compared-with.normal-group;##P<0.01,###P<0.001 vs control;**P<0.01,***P<0.001 vs grade II,△P<0.05,△△P<0.01 vs grade III.

程序性壞死，也稱壞死性凋亡，主要由受體相互作用的蛋白激酶RIP1、RIP3和混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白MLKL介導(dǎo)。當(dāng)程序性壞死被誘導(dǎo)激活時(shí)，MLKL LVEDD:Left ventricular end-diastolic dimension;NT-ProBNP:Recombinant N-Terminal probrain Natriuretic Peptide;LVEF:Left ventricular ejection fraction.信號因子被RIP3磷酸化并寡聚，然后蛋白易位至細(xì)胞質(zhì)膜以執(zhí)行程序性壞死［17］。而RIP1/RIP3作為程序性壞死中的關(guān)鍵信號分子，其形成的復(fù)合體啟動下游信號MLKL轉(zhuǎn)導(dǎo)并發(fā)生自磷酸化觸發(fā)壞死性凋亡［18-21］?，F(xiàn)研究已證實(shí)，RIP1/RIP3-MLKL信號通路在動物及人類多種疾病中有表達(dá)，在調(diào)節(jié)各種生理過程中起關(guān)鍵作用［22-27］。因此本研究探討該信號通路在HF患者中的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)與正常組相比，Ⅱ組、Ⅲ組及Ⅳ組外周血RIP1、RIP3、MLKL濃度含量均增加，而與Ⅱ組比較，Ⅲ、Ⅳ組測值濃度均有升高，在Ⅲ組和Ⅳ組比較中，RIP3因子表達(dá)濃度含量雖有上調(diào)，但差異無顯著性，提示在Ⅲ級以上該因子可能存在穩(wěn)定的高水平表達(dá)，而RIP1和MLKL表達(dá)升高差異有顯著性，WB中各蛋白表達(dá)量與上述趨勢符合。此外結(jié)合Spearman相關(guān)分析，健康對照者及Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級HF 患者的心功能等級與RIP1/RIP3、MLKL 的表達(dá)趨勢呈正相關(guān)，提示RIP1/RIP3-MLKL表達(dá)增加促進(jìn)HF疾病的發(fā)生發(fā)展。Zhou等發(fā)現(xiàn)在大鼠HF模型中心肌組織RIP1/RIP3-MLKL表達(dá)與HF疾病程度呈正相關(guān)［23,28］，本研究在外周血中得到同樣的結(jié)果。因此，抑制該通路的表達(dá)可能是慢性HF的新治療策略。

表6 隨訪后A/B兩組患者NT-ProBNP、LVEF、LVEDD表達(dá)情況Tab.6 Expression of NT-proBNP,LVEF and LVEDD in patients in groups A and B after follow-up

隨著研究的深入，對于疾病的預(yù)后認(rèn)知越發(fā)全面，Chan等研究者發(fā)現(xiàn)肌酐、NT-ProBNP、轉(zhuǎn)氨酶等指標(biāo)是心衰預(yù)后不佳的重要危險(xiǎn)因素［29］。本研究pearson相關(guān)分析提示HF患者的RIP1/RIP3-MLKL表達(dá)量與Scr、AST、LVEDD、NT-ProBNP呈正相關(guān)，與LVEF呈負(fù)相關(guān)。為此，根據(jù)RIP1/RIP3-MLKL水平評估HF患者臨床預(yù)后尚未有定論。本研究針對心功能Ⅳ級患者進(jìn)行為期5 個(gè)月的臨床隨訪，發(fā)現(xiàn)隨訪前A/B 兩組患者LVEF、LVEDD、NT-ProBNP的指標(biāo)無差異，而5個(gè)月后隨訪結(jié)果提示兩組患者LVEF、NT-ProBNP指標(biāo)有顯著性差異，LVEDD改變雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但B較A組有上升趨勢，而在心功能Ⅳ級隨訪的患者中，有5人死亡全因心源性，其中2人屬于A組，3人屬于B組，表明RIP1/RIP3-MLKL 表達(dá)量高的B 組預(yù)后更差，提示RIP1/RIP3-MLKL表達(dá)量可能與HF預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，RIP1-RIP3-MLKL信號通路在HF患者中表達(dá)明顯增加，與HF嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。臨床隨訪發(fā)現(xiàn)慢性HF的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后可能與程序性壞死通路RIP1/RIP3-MLKL的激活與表達(dá)有關(guān)，這為臨床HF的診斷治療提供新的思路和見解。