VEGF 通過激活ERK/MAPK 通路促進三陰性乳腺癌腫瘤干細胞的形成

王 璐，趙 琳，張麗芬，景 鑫，張玉姣，邵 珊，趙新漢，羅敏娜

西安交通大學第一附屬醫(yī)院1腫瘤內科，3血液內科，陜西 西安 710061；2西安交通大學第二附屬醫(yī)院呼吸內科，陜西 西安710004

乳腺癌作為女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率均呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，發(fā)病年齡也趨于年輕化［1,2］。三陰性乳腺癌（TNBC）是一類雌、孕激素受體及人表皮生長因子受體HER-2均為陰性的乳腺癌亞型，約占所有乳腺癌患者的15%～20%［3］。與luminal型乳腺癌相比，三陰性乳腺癌表現(xiàn)出更多腫瘤干細胞特性，腫瘤干細胞被認為可能是維持TNBC高度侵襲性、遠處轉移及復發(fā)的重要原因［4］。由于缺乏有效的治療靶點，三陰性乳腺癌的治療仍是目前亟待解決的臨床難點［5,6］。

血管內皮生長因子（VEGF）是由腫瘤細胞和基質細胞分泌，能夠促進腫瘤新生血管生成。越來越多的研究表明，VEGF可能參與了腫瘤細胞的遷移侵襲、上皮間質轉化及腫瘤干細胞特性等的調控［7-10］，多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)VEGF的分泌及表達量增高與患者預后密切相關［11］。VEGF家族的受體主要有兩大類：經典的酪氨酸激酶受體（包括VEGFR-1、VEGFR-2及VEGFR-3）以及協(xié)同受體Neuropilin-1（NRP-1）。多種腫瘤細胞及組織中有NRP-1的表達，且NRP-1高表達與腫瘤分期、侵襲性及不良預后顯著相關，NRP-1可能廣泛參與了不同腫瘤發(fā)生及發(fā)展的過程［12,13］。

前期研究中發(fā)現(xiàn)，VEGF/NRP-1軸能夠顯著促進三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的體外遷移、侵襲、上皮間質轉化（EMT）及體內成瘤［14］。文獻報道EMT轉化能夠促進腫瘤干細胞形成及“干性”維持［15］。因此，推測VEGF可能參與TNBC腫瘤干細胞生成，推動了腫瘤發(fā)生及復發(fā)轉移。目前VEGF/NRP-1軸是否參與三陰性乳腺癌干細胞的調控有待進一步研究證實，其具體作用機制尚不明確。為了進一步探討VEGF在三陰性乳腺癌干細胞中的作用及其機制，我們首先通過查詢Oncomine數(shù)據(jù)庫、UALCAN數(shù)據(jù)庫及Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫分析了VEGF在乳腺癌組織、癌旁組織及不同分子亞型乳腺癌組織中的表達情況，并進一步通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫探討了VEGF表達與乳腺癌患者預后的關系。體外實驗中，選用具有高度致瘤性和侵襲性的人三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231細胞作為研究模型，探討了VEGF 對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231中腫瘤干細胞富集和發(fā)生的作用，本研究的開展為三陰性乳腺癌患者的治療提供了新思路。

1 材料和方法

1.1 生物信息學分析

通過Oncomine 數(shù)據(jù)庫（https://www.oncomine.org/resource/login.html）［16］,UALCAN 數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu）［17］及Human Protein Atlas（https://www.proteinatlas.org/）［18］在線數(shù)據(jù)庫對VEGF的表達及其與臨床病理指標的相關性進行分析，并利用在線預后分析數(shù)據(jù)庫K-M plotter（http://kmplot.com/analysis/）［19］檢索VEGF與乳腺癌預后的相關性并下載數(shù)據(jù)制圖。

1.2 細胞株

人乳腺癌MDA-MB-231細胞來自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會上海細胞庫，由本實驗室保存。

1.3 主要試劑

胎牛血清購自以色列BI公司，L-15培養(yǎng)基購自江蘇凱基公司，人NRP-l抗體、人VEGF抗體（Abcam，稀釋比例1∶1000），人Nanog抗體（稀釋比例1∶4000）、人c-Myc 抗體（稀釋比例1∶1000）（武漢三鷹生物），人GAPDH抗體（稀釋比例1∶1000，SantaCruz），人ERK1/2抗體（稀釋比例1∶1000，SantaCruz），人p-ERK1/2抗體（稀釋比例1∶1000，SantaCruz），人hVEGF165 因子（Cell Signaling Technology），EFG、bFGF、B27 細胞因子（Sigma），反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa），GAPDH、Nanog、c-Myc、Sox2、Oct4、CD44、

CD24、VEGF、NRP-1引物均由北京鼎國生物有限公司合成。

1.4 細胞培養(yǎng)

MDA-MB-231細胞培養(yǎng)于L-15細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液均添加100mL/L胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素，細胞均在37 ℃、50 mL/L CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 體外細胞成球培養(yǎng)

實驗分為兩組（hVEGF165處理的實驗組及對照組），將人乳腺癌MDA-MB-231細胞消化后輕柔地反復吹打，得到單細胞懸液，進行細胞計數(shù)，將2000個細胞接種至含EGF（20 ng/mL）、bFGF（20 ng/mL）和B27（50×）的DMEM/F12的無血清培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2體積分數(shù)的飽和濕度條件下培養(yǎng)。10 d后對兩組懸浮成球情況進行觀察，同時收集懸浮的細胞微球體，在光學顯微鏡下分別計數(shù)和拍照記錄實驗組和對照組形成的微球體的數(shù)量和直徑。

1.6 Western blotting檢測蛋白表達量

冷PBS沖洗后，RIPA冰上裂解乳腺癌細胞10 min并收集細胞碎片以12 000 r/min、4 ℃離心15 min。小心吸出上清并與5×蛋白緩沖液混合，金屬浴鍋煮沸10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆?。將蛋白質進行SDS-PAGE膠電泳，后轉移至PVDF膜上。5%脫脂奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜。隔日TBST洗滌3次后二抗室溫孵育1 h，再次清洗3次，顯影檢測。

1.7 熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）檢測mRNA水平的表達

使用FASTA200提取乳腺癌細胞中總RNA，應用Nano-500超微量核酸分析儀檢測其濃度，參照逆轉錄及SYBR試劑說明進行操作，得到cDNA，將相應試劑、目的基因引物和cDNA加入八聯(lián)管中，于定量PCR儀進行擴增，重復40個循環(huán)。相對表達量使用2-ΔΔCT法進行計算，每個樣本按照相同條件進行3次重復實驗，各基因引物見表1。

表1 RT-qPCR引物Tab.1 Primers for RT-qPCR

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS23.0、Graphpad Prism 7.0 及EXCEL 軟件對實驗結果進行統(tǒng)計分析及繪圖。各項實驗均獨立重復3次，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩個獨立樣本均數(shù)間的比較采用t檢驗；ANOVA方差分析比較多組間均數(shù)差異，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 VEGF在乳腺癌中的表達情況及其與腫瘤預后的關系

利用Oncomine和UALCAN在線數(shù)據(jù)庫進行再次驗證，Oncomine數(shù)據(jù)庫分析結果提示，有4個研究（共2753例乳腺癌標本）顯示VEGF基因在乳腺腫瘤組織中呈高表達，1個研究（共675例乳腺癌標本）分析結果為低表達（表2，圖1 A）。與此相對應，UALCAN數(shù)據(jù)庫結果同樣支持上述差異，在1211例乳腺癌標本中，114例為癌旁組織，1097例為乳腺癌組織，與癌旁組織相比，VEGF在乳腺癌組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.0001）。VEGF在不同分子分型的乳腺癌中表達情況不同，在luminal 型中表達最低，而在HER-2陽性型及三陰性乳腺癌中表達量較高，差異具有統(tǒng)計學意義（luminal 型vsHER-2 陽性型，P<0.01；luminal型vs三陰性型P<0.001，圖1B、C）。HPA數(shù)據(jù)庫通過免疫組化驗證了乳腺癌中VEGF在蛋白水平上表達量也顯著升高（圖1D）。通過在線數(shù)據(jù)庫Kaplan-Meier Plotter分析了VEGF表達量與腫瘤預后的關系，結果顯示與VEGF低表達組相比，VEGF高表達患者預后更差，總生存期（OS）、無進展生存期（PFS）、無遠處轉移生存期（DMFS）、復發(fā)后生存期（PPS）均顯著縮短（圖1E）。

表2 VEGF在各個數(shù)據(jù)集中的表達情況Tab.2 Expression of VEGF in different studies

圖1 VEGF在乳腺癌中的表達情況及其預后Fig.1 Expression of VEGF in breast cancer and its association with the patients’prognosis.A:Expression of VEGF in 20 different tumors (ONCOMINE database);B:Expression of VEGF expression in breast cancer (UALCAN database);C:Expression of VEGF in breast cancer of different molecular subtypes (UALCAN database);D:The VEGF protein expression in breast cancer（Human Protein Atlas database）;E:Kaplan-Meier survival analysis of the association of VEGF expression with the prognosis of breast cancer patients. **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.

2.2 VEGF對三陰性乳腺癌MDA-MB-231成球能力影響

微球體形成實驗結果顯示對照組成球數(shù)量為（66±11.53）/1000細胞，而加入hVEGF165組成球數(shù)量為（142.3±16.86）/1000 細胞，差異具有統(tǒng)計學意義，P=0.0029，且加入hVEGF165組所形成的微球直徑顯著增大（圖2）。加入外源性hVEGF165后三陰性乳腺癌MDAMB-231細胞體外成球數(shù)量顯著增多，微球體直徑顯著增大。

圖2 VEGF對三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231體外成球能力影響Fig.2 Effects of VEGF on sphere formation ability of TNBC MDA-MB-231 cells A,B:Representative images of sphere formation of TNBC MDA-MB-231 cells treated with PBS (control) or exogenous hVEGF165 (final concentration 10ng/mL) on ultra-low attachment plate (Original magnification,A:×40;B:×100).C,D:Quantification of sphere number and diameter of TNBC MDA-MB-231 cells.Sphere-formation area were calculated using Image J Software and the results represent the means from 5 visual fields for each well. **P<0.01, ***P<0.001,****P<0.0001 vs control.

2.3 三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細胞微球體中VEGF、NRP-1及腫瘤干細胞標志物的表達情況

Western Blotting 結果顯示與對照組普通細胞相比，MDA-MB-231微球體細胞中VEGF及其受體NRP-1的表達量顯著升高（圖3A、B，P<0.0001及P<0.001），與此同時，干性相關標志物CD44、Nanog、c-Myc表達增加，而CD24表達降低（圖3A、B，P<0.0001）。采用RTqPCR實驗驗證mRNA水平上干性標志物的變化，結果與Western blotting 一致。與對照組相比，MDA-MB-231微球體細胞中SOX-2、Nanog、c-Myc mRNA水平表達均顯著升高（圖3C，P<0.0001）。

圖3 乳腺癌MDA-MB-231細胞微球體中VEGF、NRP-1及腫瘤干細胞標志物表達情況Fig.3 Expression of VEGF,NRP-1 and tumor stem cell markers in MDA-MB-231 spheres.A:Western blot analysis of VEGF,NRP-1 and tumor stem cell markers in MDA-MB-231 monolayer and sphere cells with GAPDH as the loading control.B:Quantification of Western blot analysis.C:RT-qPCR analysis of the mRNA expressions of VEGF,NRP-1 and tumor stem cell markers in MDA-MB-231 monolayer and sphere cells.***P<0.001,****P<0.0001 vs monolayer cell.

2.4 外源性hVEGF165對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞“干性”的影響

Western blot結果顯示，加入hVEGF165后腫瘤干細胞相關標志物Nanog、CD44、ALDH1、c-Myc表達增加，而CD24表達下降，在加入hVEGF165后60min表達水平達到高峰（圖4A）。

采用RT-qPCR實驗驗證mRNA水平上干性標志物的變化，結果與Western blotting基本一致（圖4B，P<0.05）。

圖4 外源性hVEGF165對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞干性指標的影響Fig.4 Effects of exogenous hVEGF165 on expressions of tumor stem cell markers in TNBC MDA-MB-231 cells.A:Western blot analysis for detecting expressions of tumor stem cell markers in TNBC MDA-MB-231 cells.B:RT-qPCR analysis for detecting mRNA expressions of tumor stem cell markers in TNBC MDA-MB-231 cells.MDA-MB-231 cells treated with hVEGF165 for 60 min vs 0 min,*P<0.05,***P<0.001,****P<0.0001 vs 0 min.

2.5 外源性hVEGF165激活三陰性乳腺癌細胞ERK/MAPK通路

外源性hVEGF165能夠促進乳腺癌MDA-MB-231細胞p-ERK的表達，并且該激活作用具有時間依賴性，在加入外源性hVEGF165后30～60 min p-ERK的表達水平達到高峰，隨后逐漸下降（圖5，P<0.01）。

圖5 外源性hVEGF165對三陰性乳腺癌細胞ERK/MAPK通路的影響Fig.5 Effect of exogenous hVEGF165 on ERK/MAPK pathway in MDA-MB-231cells.A:Western blot analysis of the expressions of p-ERK and ERK1/2 in MDA-MB-231 cells.B:Quantitative analysis of the blots.**P<0.01,****P<0.0001 vs 0 min.

3 討論

三陰性乳腺癌5年生存率僅有70%，是目前臨床治療的難點［23,24］。血管內皮生長因子VEGF是促進腫瘤血管生成的主要調節(jié)因子［31］。研究表明VEGF可以調控腫瘤細胞的遷移侵襲、上皮間質轉化及腫瘤干細胞［7-9］。大量文獻表明，VEGF在乳腺癌中表達增高且與多個臨床病理特征相關，高表達VEGF的患者預后普遍較差［14,32,33］。本研究利用多個在線生物信息數(shù)據(jù)庫對VEGF在乳腺癌中的表達、其表達與臨床病理特征的關系及預后進行了梳理，結果顯示與癌旁組織相比，VEGF 在乳腺癌組織中表達增高，進一步分析發(fā)現(xiàn)，VEGF在不同分子分型的乳腺癌中表達情況不同，在luminal型中表達最低，而在HER-2陽性型及三陰性乳腺癌中表達量較高，差異具有統(tǒng)計學意義。通過在線數(shù)據(jù)庫Kaplan-Meier Plotter分析了VEGF表達量與腫瘤預后的關系，結果顯示VEGF高表達組患者預后更差，OS、PFS、DMFS 及PPS 均顯著縮短。上述結果提示VEGF可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及復發(fā)轉移中發(fā)揮了重要作用。

文獻報道TNBC分子分型多屬于basal-like型，表現(xiàn)出一系列間質細胞的特性，與EMT過程存在密切聯(lián)系。研究表明EMT與腫瘤干細胞的形成和干細胞特性的維持有密切聯(lián)系。腫瘤干細胞是腫瘤組織中一群具有自我更新、無限增殖、多潛能分化特征的細胞［25］。研究表明［26-30］，Lin-ESA+/CD44+/CD24-／low、ALDH1、SOX-2、OCT-4、Nanog、c-Myc是乳腺癌干細胞的重要標志。Zhang等［8］研究顯示乳腺癌細胞微球體中VEGF表達增高且VEGF/NRP-1軸通過Wnt通路發(fā)揮對乳腺癌干細胞的調節(jié)作用。我們前期研究顯示三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231細胞中存在VEGF及其受體NRP-1的高表達，VEGF/NRP-1軸的激活能夠促進TNBC細胞系MDA-MB-231的EMT轉化及裸鼠體內乳腺癌原位移植瘤的生長和轉移［14］。目前，VEGF及其受體是否參與了TNBC中腫瘤干細胞功能的調控，上述調控作用機制尚不明確。為了探索三陰性乳腺癌中VEGF與腫瘤干細胞的關系，我們分別進行了體外成球培養(yǎng)、Western blotting、RT-qPCR等實驗。結果顯示與對照組相比，加入外源性hVEGF165后三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞體外成球數(shù)量顯著增多，微球體直徑顯著增大，差異具有統(tǒng)計學意義，表明外源性hVEGF165加入促進了三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的體外成球能力，提示外源性VEGF 可能促進了三陰性乳腺癌干細胞的形成。我們通過Western blotting、RT-qPCR進一步檢測了MDA-MB-231微球體與普通MDA-MB-231細胞中VEGF、NRP-1 及CD44、CD24、Nanog、SOX-2、c-Myc等腫瘤干細胞相關標志物的表達情況，結果顯示微球體細胞中腫瘤干細胞相關標志物及VEGF/NRP-1的表達同步升高，提示VEGF可能參與了三陰性乳腺癌細胞“干性”的調控。通過體外加入外源性hVEGF165，發(fā)現(xiàn)hVEGF165的加入促進了三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞Nanog、CD44、ALDH1、c-Myc等的表達，且上述作用具有時間依賴性，在加入hVEGF165后60 min表達水平達到高峰。

既往研究表明VEGF 能夠通過受體酪氨酸激酶（RTKs）激活細胞內ERK/MAPK及PI3K/Akt等信號通路，從而發(fā)揮生物學功能［34］。我們研究發(fā)現(xiàn)，加入外源性hVEGF16530～60 min 后MDA-MB-231細胞中p-ERK的表達水平達到高峰，初步證實VEGF能夠激活三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231細胞內ERK/MAPK信號通路，且該作用存在時間依賴性。

綜上所述，我們通過生物信息學分析及體外相關實驗發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中VEGF表達顯著升高，高表達VEGF的乳腺癌患者預后不良。加入外源性的hVEGF165后三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的體外成球能力顯著增強，乳腺癌MDA-MB-231微球體中VEGF、NRP-1及腫瘤干細胞相關標志物CD44、Nanog、c-Myc的表達量顯著升高。外源性的hVEGF165促進了三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231腫瘤干細胞相關標志物CD44、c-Myc、Nanog及ALDH1的表達，并能夠激活MDA-MB-231細胞ERK/MAPK通路，上述作用具有時間依賴性。提示VEGF/NRP-1軸可能參與了三陰性乳腺癌腫瘤干細胞的形成，上述作用的發(fā)揮可能與ERK/MAPK信號通路激活相關。但VEGF如何激活ERK/MAPK信號通路進而調控腫瘤干細胞形成，其具體作用機制仍有待進一步研究。