苗藥驗(yàn)方四大血對(duì)人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡和焦亡的影響

吳 寧，袁桃花，姬進(jìn)忠，程 瑤，李明義，梁 璽，孫見飛，劉 華，吳昌學(xué)

貴州醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2臨床醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550004

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種慢性、炎癥性的自身免疫系統(tǒng)疾?。?］，在所有關(guān)節(jié)病中致殘率高居首位，主要病理表現(xiàn)是滑膜血管翳及炎癥［2-3］。成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（FLSs）是構(gòu)成滑膜結(jié)構(gòu)的主要細(xì)胞，活化的RAFLSs表現(xiàn)出類似于腫瘤樣特性，在關(guān)節(jié)炎癥部位處于異?；罨鲋碃顟B(tài)［4］，而RA滑膜增生與FLSs凋亡缺失密切相關(guān)［5］，目前臨床上無根治RA的藥物［6-7］。由黑骨藤、見血飛、五花血藤及雞血藤4味藤本藥材組成的苗藥驗(yàn)方“四大血”（SX）是苗藥中通氣散血的天然藥方，也是治療RA的經(jīng)典藥方，但仍處于經(jīng)驗(yàn)用藥階段［8-10］。本課題組前期研究結(jié)果顯示，SX對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠（CIA）有良好的療效，能緩解關(guān)節(jié)腫脹程度、抑制關(guān)節(jié)滑膜組織增生等病理表現(xiàn)［8-10］。研究表明，RA-FLSs的過度增殖、凋亡不足及焦亡等在RA的破壞和持續(xù)炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用［5］，然而SX調(diào)控凋亡和焦亡相關(guān)因子表達(dá)、治療RA的作用機(jī)制研究較少。因此，本研究通過數(shù)據(jù)挖掘并分析與RA相關(guān)的凋亡和焦亡蛋白，并對(duì)重要關(guān)鍵靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接和體外實(shí)驗(yàn)，觀察SX對(duì)RA-FLSs MH7A細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響，探究其對(duì)凋亡和焦亡的作用機(jī)制，為SX臨床開發(fā)及RA治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和藥物 人源第2代RA-FLSs MH7A細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)BLUEFBIO，附ATCC公司提供的短串聯(lián)重復(fù)序列鑒定；苗藥SX由貴州中醫(yī)藥大學(xué)苗醫(yī)藥教研室提供、并經(jīng)田振華副教授鑒定，雷公藤多苷片購(gòu)自遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 高糖培養(yǎng)基（GIBCO），胎牛血清（FBS）、0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）胰酶、磷酸緩沖鹽溶液（PBS；美國(guó)BI），四唑鹽［MTT］細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、2,2'-二辛可寧酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒及二甲基亞砜（DMSO；北京索萊寶），基底膠（美國(guó)BD），Caspase-1 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody（中國(guó)Huabio），B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（BCL2）PolyclonalAntibody（中國(guó)Proteintech），Rabbit-anti-LC3、B淋巴細(xì)胞瘤-2 相關(guān)X（Bax）Rabbit mAb（美國(guó)CST）；CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海Heal Force），酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek），高端分析型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD）。

1.2 方法

1.2.1 RA 疾病及凋亡和焦亡靶蛋白檢索 以“Rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞，通過治療目標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://db.idrblab.net/ttd/）、藥物銀行數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.drugbank.ca/）、疾病相關(guān)的基因與突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.disgenet.org/）檢索RA靶蛋白；分別以“Apoptosis”、“Pyroptosis”為關(guān)鍵詞，限定物種為人，通過京都基因和基因組百科全書（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）檢索，獲得凋亡和焦亡相關(guān)靶蛋白，并去重；利用UniProtKB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/uniprot/）將靶蛋白標(biāo)準(zhǔn)化，獲得UniProt號(hào)［11］。

1.2.2 RA 疾病-凋亡-焦亡靶蛋白PPI 分析 利用VENNY2.1 軟件繪制韋恩（Venn）圖，獲得與RA疾病相關(guān)的凋亡和焦亡靶蛋白，將靶蛋白輸入String Version 10.5 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），限定物種為人，將蛋白關(guān)系評(píng)分設(shè)為0.4，并隱藏出現(xiàn)的游離靶蛋白，下載靶蛋白互作（PPI）關(guān)系圖［11］，利用Cytoscape Version 3.6.1軟件進(jìn)行可視化處理，獲得RA疾病-凋亡-焦亡靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并利用Network Analyzer分析其自由度、介數(shù)等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦岛Y選PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶蛋白，其中自由度越大，靶蛋白在網(wǎng)絡(luò)中越重要［11-12］。

1.2.3 分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證 為了驗(yàn)證SX與凋亡和焦亡的關(guān)聯(lián)，將SX中雞血藤的主要活性成分cajanin、見血飛的主要活性成分oxychelerythrine、五花血藤的主要活性成分（-）-Catechin gallate、黑骨藤的主要活性成分eleutheroside A 與凋亡和焦亡相關(guān)蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。從PubChem（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）平臺(tái)下載藥物活性成分的3D結(jié)構(gòu)，通過PyMOL2.4.0軟件轉(zhuǎn)換為PDB格式，從PDB（http://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載候選靶蛋白的3D結(jié)構(gòu)，然后用PyMOL2.4.0軟件去除水分子和配體后制備蛋白受體。最后，通過AutoDock vina 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)果用自由結(jié)合能評(píng)價(jià)，自由結(jié)合能≤-5kJ/mol，表示化合物和靶之間有良好的結(jié)合相互作用，結(jié)合能越低，對(duì)接模塊越穩(wěn)定，藥物與靶蛋白相互作用的可能性越大，選擇最低自由能模型通過PyMOL2.4.0軟件進(jìn)行可視化分析［13］。

1.2.4 細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng) 液氮罐中取凍存細(xì)胞，轉(zhuǎn)入37 ℃水浴鍋，搖晃、融化細(xì)胞，轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加含10%FBS和1%雙抗DMEM完全培養(yǎng)液3 mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，次日換液；待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%密度時(shí)傳代，即棄原培養(yǎng)基，PBS 2 mL 洗2～3 次，加含0.25% EDTA胰酶500 μL消化，DMEM完全培養(yǎng)液終止消化，轉(zhuǎn)移離心管，1000 r/min離心5 min，棄上清，加培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1∶3比例接種于新培養(yǎng)基，每瓶含培養(yǎng)基3 mL，置培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，取第3～4代生長(zhǎng)良好、密度為80%～90%的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)［14］。

1.2.5 MTT法測(cè)SX對(duì)MH7A細(xì)胞抑制情況 將細(xì)胞以8×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，180 μL/孔，邊緣孔加PBS，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%匯合時(shí)，加不同濃度的SX（5、10、20、40、60、80、100、200、300、600、900 mg/L），每組8個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h，吸棄上清，加DMEM完全培養(yǎng)液90 μL和MTT溶液10 μL，培養(yǎng)4 h；吸掉上清，每孔加藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜溶解液110 μL，置搖床上，80 r/min震蕩10 min，使結(jié)晶物溶解，測(cè)量每孔細(xì)胞的吸光度值A(chǔ)450nm［15］。設(shè)置調(diào)零對(duì)照孔（培養(yǎng)基、MTT、DMSO）和實(shí)驗(yàn)孔（細(xì)胞、培養(yǎng)基、MTT、DMSO及藥物）、空白組（細(xì)胞、培養(yǎng)基、MTT及DMSO），計(jì)算藥物對(duì)MH7A細(xì)胞的抑制率［細(xì)胞抑制率=（A對(duì)照孔-A實(shí)驗(yàn)組）/（A對(duì)照組-A空白孔）×100%］，采用SPSS軟件計(jì)算半數(shù)抑制率（IC50），并根據(jù)IC50值選取給藥濃度。

1.2.6 細(xì)胞分組 細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%密度時(shí)，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、陽(yáng)性雷公藤多甘片（TGT）對(duì)照組（TGT組，5 mg/L TGT）及5、10、20、40 mg/L SX組。

1.2.7 藥物的制備 SX水煎劑按照傳統(tǒng)方法制備。單味苗藥五花血藤、雞血藤、見血飛及黑骨藤按照15∶22∶15∶8的比例配制，共取600 g，參考文獻(xiàn)［8-10］煎制濃度為4 kg/L的試藥（按生藥量計(jì)），質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)為每制150 mL SX水煮液原藥材nangxdlobghat（仰嗟嘎）不低于80 g、hsobhxangt（梭向）不低于150 g、ghabjongxbelsobxok（嘎龔布梭學(xué)）不低于150 g 及vobmongbdlenb（萵蒙棱）不低于220 g；以上制備的中藥水煎液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀制備成中藥粉末，避光密封常溫保存；相應(yīng)濃度藥液用DMEM培養(yǎng)基配制，稱取SX和TGT 10 mg加少量DMSO溶解，PBS定容至10 mL，以0.22 μm孔徑的濾器過濾除菌2遍，得終濃度為1 g/L的母液，不同濃度藥液用DMEM培養(yǎng)基稀釋（DMSO含量<0.0001%）。

1.2.8 Wound-healing檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力 將濃度為3×102/L的MH7A單細(xì)胞懸液，鋪于6孔板，100 μL/孔，加DMEM 完全培養(yǎng)基2 mL，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%融合，用200 μL移液槍槍頭在6孔板底部劃“十”字，PBS洗1～2次，加無血清培養(yǎng)基拍照記錄為0 h劃痕狀態(tài)；加5、10、20、40 mg/L SX及5 mg/L TGT無血清含藥培養(yǎng)基2 mL，設(shè)置空白對(duì)照組（加相同體積的DMEM無血清培養(yǎng)基），分別培養(yǎng)6、12、24 h拍照，放大100倍；實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次［16］，計(jì)算劃痕修復(fù)率［劃痕修復(fù)率（%）=（劃痕寬度0h-劃痕寬度24h）/劃痕寬度0h×100%］。

1.2.9 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 實(shí)驗(yàn)前在冰浴中用不含血清的DMEM培養(yǎng)基以1∶1稀釋基質(zhì)膠，20 μL/孔包被Transwell小室，置于37 ℃培養(yǎng)箱2 h使基質(zhì)膠聚合形成凝膠狀，MH7A細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%，無血清培養(yǎng)基饑餓處理細(xì)胞24 h，消化細(xì)胞；并用5、10、20、40 mg/L SX組及5 mg/L TGT無血清含藥培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，按1×102/L接種于Tanswell的上室，100 μL/孔，并設(shè)空白組（不含藥物）；Transwell下室加含15%FBS的DMEM培養(yǎng)基500 μL/孔，干預(yù)MH7A 24 h，棉簽拭去Transwell小室未侵襲的細(xì)胞，PBS洗2～3遍，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，蒸餾水洗滌3次，晾干后在倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)6～8個(gè)視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)［17］。

1.2.10 ELISA 檢測(cè)凋亡和焦亡相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)藥物作用24 h，收集各組細(xì)胞上清液，參照Elisa試劑盒說明書步驟分別檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-18的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次［9］。

1.2.11 Western blotting檢測(cè)凋亡和焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 細(xì)胞前處理和給藥同“1.2.5”，藥物作用24 h，冰上收集蛋白樣本，BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度；蛋白變性后取20 g上樣電泳，轉(zhuǎn)膜（條件為200 mA和2 h），5%脫脂奶粉封閉過夜，孵育一抗，內(nèi)參（β-Actin）、Bax、Bcl-2、Caspase-1、Fas、FasL抗體的稀釋比和孵育時(shí)間分別1∶1 000 和室溫2 h或4 ℃過夜，1×TBST洗膜5 min/次、洗6次，孵育二抗（1∶1 000、室溫脫色搖床緩慢搖動(dòng)2 h），洗膜（同前），曝光顯影，凝膠成像儀上進(jìn)行蛋白條帶檢測(cè)和灰度分析［18］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差法分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA相關(guān)蛋白的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出滿足條件的RA疾病靶蛋白306個(gè)，凋亡靶蛋白136個(gè)，焦亡靶蛋白180個(gè)（圖1）；其中與RA相關(guān)的凋亡靶蛋白9個(gè)，關(guān)鍵靶蛋白包括腫瘤壞死因子受體超家族成員6（Fas-6）、腫瘤壞死因子配體超家族成員6（FASLG-6）、誘導(dǎo)髓系白血病細(xì)胞分化蛋白Mcl-1（MCL1）、Bcl-2相關(guān)蛋白A1（Bcl-2A1）等；焦亡靶蛋白15個(gè)，關(guān)鍵靶蛋白包括腫瘤壞死因子（TNF）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）、組織蛋白酶B（CTSB）、信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子1（STAT1）等；三者相互關(guān)聯(lián)的靶蛋白4個(gè)，包括白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶-1（CASP-1）、受體相互作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（RIPK1）等（圖1、2，表1）。

表1 RA-凋亡-焦亡相關(guān)靶蛋白網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)Tab.1 Topological parameters of the RA-apoptosis-pyroptosis-related target protein network

圖1 RA-凋亡-焦亡基因映射Venn 圖Fig.1 Venn map of gene mapping of RA-apoptosispyroptosis.Blue represents the target proteins of rheumatoid arthritis,pink represents the target proteins of apoptosis,and green represents the target proteins of pyroptosis;the numbers represent the numbers of the target proteins.

2.2 分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證

SX的主要活性成分與凋亡和焦亡相關(guān)蛋白的親和力，結(jié)果顯示SX中雞血藤的主要活性成分cajanin、見血飛的主要活性成分oxychelerythrine、五花血藤的主要活性成分（-）-Catechin gallate、黑骨藤的主要活性成分eleutheroside A 與TNF-α、Fas、FasL、Bcl2、Bax、Caspase-1、IL-1β、IL-18均具有較好的親和力，主要通過氫鍵和疏水作用力相互作用；結(jié)合能用于評(píng)價(jià)對(duì)接分子之間的結(jié)合強(qiáng)度，結(jié)合能≤-5.0 kJ/moL 即表明藥效分子與蛋白對(duì)接效果良好，結(jié)合能越低，受體和配體的親和力越高，化合物與目標(biāo)位點(diǎn)的結(jié)合越穩(wěn)定。對(duì)接結(jié)合能能量值見表2，從表中可知：cajanin、oxychelerythrine、（-）-Catechin gallate、eleutheroside A四個(gè)成分與TNF-α、Fas、FasL、Bcl2、Bax、Caspase-1、IL-1β、IL-18的結(jié)合能均≤-5 kj/moL，“四大血”治療RA的機(jī)制可能與調(diào)控凋亡和焦亡相關(guān)蛋白有關(guān)，選取結(jié)合能較強(qiáng)的靶蛋白與小分子，利用PyMoL軟件可視化處理，結(jié)合模式（圖3），從圖中可看到靶蛋白與分子的具體結(jié)合位點(diǎn)，oxychelerythrine可能通過氫鍵作用于TNF-α的TYR-151等氨基酸殘基；eleutheroside A可能通過氫鍵作用于TNF-α的LYS-98、SER-95、ILE-97 等氨基酸殘基；cajanin可能通過氫鍵作用于Bax的LYS-128等氨基酸殘基，（-）-Catechin gallate可能通過氫鍵作用于Fas的GLY-46、ASN-67、SER-42等氨基酸殘基，通過分析可知在配體與靶標(biāo)蛋白結(jié)合中主要包含氫鍵作用力與疏水作用力，其中起主要作用的是氫鍵作用力，圖中黃色虛線表示氫鍵相互作用力（表2、圖3）。

圖3 結(jié)合能較低的主要化合物與靶點(diǎn)最優(yōu)結(jié)合模式Fig.3 Optimal binding mode of the main compounds with low binding energy to the target.A:TNF-α and oxychelerythrine docking mode.B:TNF-α and eleutheroside A docking mode;C:Bax and cajanin docking mode;D:Fas and (-)-Catechin gallate docking mode.

表2 SX主要活性成分與凋亡、焦亡相關(guān)蛋白對(duì)接結(jié)果Tab.2 Docking results between the main active components of SX and apoptosis-and pyroptosis-related proteins

圖2 RA-凋亡-焦亡相關(guān)靶蛋白PPI分析Fig.2 Analysis of RA-apoptosis-pyroptosis-related target protein interaction.A:Target proteins related with RA and apoptosis.B:Target proteins related with RA-apoptosis-pyroptosis.C:Target proteins related with RA and pyroptosis.The circles represent the target proteins,and the lines represents the interaction between the target proteins.The darker the color and the larger the circle in the figure,the more important the target protein in the network.

2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察

倒置顯微鏡明場(chǎng)下觀察培養(yǎng)瓶中的MH7A細(xì)胞呈漩渦狀生長(zhǎng)，表現(xiàn)為多樣性形態(tài)如梭形、星形、樹突狀等；傳至2～3代后，MH7A細(xì)胞密集生長(zhǎng)，形態(tài)由多樣性逐漸變?yōu)榇笮【坏乃笮?，折旋旋光性?qiáng)，增殖快，對(duì)胰酶敏感，生物活性較為活躍；隨著培養(yǎng)傳代增多（一般為6～8代），細(xì)胞胞體的光亮度逐漸下降，胞質(zhì)中出現(xiàn)顆粒物質(zhì)，生長(zhǎng)緩慢，胰酶消化時(shí)間增強(qiáng)。因此本實(shí)驗(yàn)選2～3代MH7A細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞活力較好（圖4）。

圖4 第3代MH7A細(xì)胞形態(tài)圖Fig.4 Morphology of MH7A cells of F3 generation(Original magnification:×100).

2.4 細(xì)胞抑制率

細(xì)胞抑制率結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，給藥處理24 h時(shí)60、80、100、300、600、900 mg/L SX組MH7A細(xì)胞抑制率增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；與空白對(duì)照組比較，給藥處理48、72 h 時(shí)，80、100、300、600、900 mg/L SX組MH7A細(xì)胞抑制率增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01，表3）。24、48、72 h對(duì)應(yīng)的SX對(duì)MH7A細(xì)胞作用的IC50分別為88、42、83 mg/L；24 h 時(shí)，SX 濃度<60 mg/L 時(shí)對(duì)細(xì)胞無抑制作用，因此設(shè)置SX給藥處理24 h的濃度為5、10、20及40 mg/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的濃度依據(jù)（表3）。

表3 各組MH7A細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞抑制率Tab.3 Cell inhibition rate of MH7A cells at different time points of TGT or SX treatment(Mean±SD,%)

2.5 細(xì)胞遷移

藥物作用0、6、12、24 h結(jié)果顯示，同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，MH7A細(xì)胞的劃痕修復(fù)率隨SX濃度增加而減少，同時(shí)點(diǎn)內(nèi)各濃度與空白對(duì)照組相比，不同濃度給藥組及TGT組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖5）。

圖5 各組MH7A細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞遷移Fig.5 Cell migration results of MH7A cells treated for different lengths of time.A:Wound healing assay(×100).B:Quantitative analysis of the migrated cells.*P<0.05 vs blank control group at the same time;#P<0.05 vs TGT group at the same time.

2.6 細(xì)胞侵襲

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給藥24 h，與空白對(duì)照組相比，20 mg/L、40 mg/L SX 組MH7A 細(xì)胞侵襲數(shù)目減少（13.37±0.33vs62.70±6.33，12.71±4.33vs62.70±6.33，P<0.05），5、10 mg/L SX組及TGT組MH7A細(xì)胞侵襲數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（46.70±5.33vs62.74±6.33，38.73±2.33vs62.72±6.33,51.33±0.33vs62.70±6.33，P>0.05，圖6）。

圖6 各組MH7A細(xì)胞的侵襲能力Fig.6 Invasive ability of MH7A cells in each group(Crystal violet staining,×100).A:blank control group.B:TGT group.C:5 mg/L SX group.D:10 mg/L SX group.E:20 mg/L SX group;F:40 mg/L SX group.

2.7 TNF-α、IL-1β、IL-18細(xì)胞因子的表達(dá)

與空白對(duì)照組比較，20 mg/L、40 mg/L SX 組和TGT組MH7A細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-18的表達(dá)水平均下降（P<0.05 或P<0.01），且20 mg/L SX 組MH7A細(xì)胞上清液IL-1β的表達(dá)水平也下降（P<0.05，表4、圖7）。

圖7 各組MH7A細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-18細(xì)胞因子的表達(dá)Fig.7 Expression of TNF-α,IL-1β and IL-18 in MH7A cells in each group.*P<0.05,**P<0.01 vs blank group.

表4 各組MH7A細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-18細(xì)胞因子的表達(dá)Tab.4 Expression of TNF-α,IL-1β and IL-18 in MH7A cells in each group(Mean±SD,n=10)

2.8 細(xì)胞凋亡和焦亡蛋白的表達(dá)

與空白對(duì)照組相比，5、10、40 mg/L SX組MH7A細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)量均增加（P<0.05），5、10 mg/L SX組MH7A細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)量增加（P<0.05），20、40 mg/L SX 組及TGT 組Bcl-2 蛋白表達(dá)量降低（P<0.05），20、40 mg/L SX組Bax/Bcl-2比值增加（P<0.05）；與空白對(duì)照組相比，5、40 mg/L SX 組MH7A 細(xì)胞Caspase-1 蛋白表達(dá)量降低（P<0.05），10 mg/L SX 組Caspase-1蛋白表達(dá)量增加（P<0.05）；與空白對(duì)照組相比，20 mg/L、40 mg/L SX組MH7A細(xì)胞中Fas和FasL蛋白表達(dá)量均增加（P<0.05，圖8）。

圖8 各組MH7A細(xì)胞Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2、caspase-1、FasL、Fas蛋白的表達(dá)Fig.8 Expression of Bax(A,B),Bcl-2(A,C),Bax/Bcl-2(A,D),caspase-1(A,E),FasL(A,F),and Fas(A,G) proteins in MH7A cells in each group.*P<0.05 vs blank group.

3 討論

RA是以慢性炎癥、關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生及血管翳等形成為主要特征的自身免疫性疾?。?-2］，其病情遷延不愈，病變可以累及肺、心、腎等全身不同臟器，以關(guān)節(jié)受累最為突出［2-3］。RA以顯著滑膜細(xì)胞增殖為特征，F(xiàn)LSs是RA滑膜細(xì)胞中最主要的一種，其在軟骨和骨破壞的過程中可導(dǎo)致細(xì)胞因子、趨化因子及基質(zhì)降解分子的過量產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和軟骨降解［2］，在RA中異?；罨腞A-FLSs表現(xiàn)出類似于腫瘤樣特性，可經(jīng)歷“腫瘤樣”增殖、侵襲及遷移，可遷移到未受影響的關(guān)節(jié)，附著在軟骨和骨上，侵入細(xì)胞外基質(zhì)，并抵抗凋亡［18］。因此RA-FLSs的增殖擴(kuò)散有助于RA的形成。目前，臨床上沒有治療RA的特效藥物，常用非甾體類抗炎藥等西藥，其主要以改善病情及控制炎癥反應(yīng)為主，易引起肝腎等臟器功能損壞等副作用，不易長(zhǎng)期服用［4-5］。而中藥民族藥在治療RA方面表現(xiàn)出整體調(diào)節(jié)、多途徑、多環(huán)節(jié)的作用機(jī)制，療效持久，且毒副作用小，已成為治療RA的潛在有效藥物［7］。苗醫(yī)驗(yàn)方SX由4種藤本藥材黑骨藤、五花血藤、見血飛及雞血藤組成，具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，是苗族地區(qū)治療RA的經(jīng)典藥方，但目前仍處于經(jīng)驗(yàn)用藥階段［8-10］。因此，深入研究特色民族藥物在治療RA方面的作用機(jī)制，對(duì)于開展民族藥物的研發(fā)以及指導(dǎo)其臨床運(yùn)用具有重要意義。

我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SX能改善CIA大鼠滑膜關(guān)節(jié)腫脹及畸形，但具體作用機(jī)制不清。本研究通過數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘和分子對(duì)接初步確定SX與凋亡和焦亡的關(guān)聯(lián)。細(xì)胞凋亡包括內(nèi)在固有和外在途徑：外在途徑以Fas信號(hào)通路為代表，F(xiàn)as被激活后與FADD結(jié)合，進(jìn)一步使caspases-3等凋亡執(zhí)行分子被活化，引起細(xì)胞凋亡；內(nèi)在途徑通過各種信號(hào)通路引起B(yǎng)cl-2家族蛋白的變化，最終引起細(xì)胞凋亡［19］。在RA發(fā)病過程中Fas表達(dá)改變，可導(dǎo)致滑膜細(xì)胞的增殖和凋亡失衡，促進(jìn)RA的發(fā)展［20］。Bax和Bcl-2是細(xì)胞凋亡的促凋亡因子和抑凋亡因子，RA-FLSs細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的Bax與Bcl-2表達(dá)水平失衡以及Fas蛋白表達(dá)水平下降等凋亡逃逸現(xiàn)象可進(jìn)一步加重炎癥和骨質(zhì)破壞［21］。細(xì)胞壞死是凋亡以外的一種細(xì)胞死亡，其在RA的發(fā)展中密切相關(guān)，其主要調(diào)控方式之一是細(xì)胞焦亡［22,23］。細(xì)胞焦亡經(jīng)典作用途徑依賴Caspase-1的激活，Caspase-1的活化可促進(jìn)IL-1β和IL-18的成熟，進(jìn)而釋放至細(xì)胞外，招募炎癥細(xì)胞，擴(kuò)大炎性反應(yīng)［24］。研究表明，可通過阻斷細(xì)胞焦亡中某個(gè)環(huán)節(jié)作為新的藥物靶點(diǎn)控制RA病情［25］。在機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞凋亡與焦亡的分子機(jī)制不同，但存在一定聯(lián)系，GSDMD是唯一誘導(dǎo)焦亡的caspase-1底物，在沒有焦亡底物GSDMD的情況下，caspase-1激活caspase-3/7并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而在細(xì)胞凋亡過程中，caspase-3/7通過在與使蛋白質(zhì)失活的炎癥性caspase不同的位點(diǎn)切割GSDMD來特異性地阻斷細(xì)胞焦亡［26］，說明凋亡激活后可以抑制焦亡發(fā)生。而RA-FLSs中細(xì)胞凋亡途徑的激活及抑制焦亡相關(guān)因子的表達(dá)，可降低RA關(guān)節(jié)滑膜炎癥及關(guān)節(jié)的損害，減緩RA病程發(fā)展［21,27］。

TNF-α既與凋亡有關(guān)，又與焦亡有關(guān)，是RA滑膜炎產(chǎn)生和持續(xù)的關(guān)鍵因子，在RA的局部滑膜炎癥、血管翳的生成和組織損傷中都發(fā)揮著重要作用［28］。通常，TNF-α通過一系列過程后可誘發(fā)凋亡效應(yīng)蛋白Caspase-3的激活，引起鄰近細(xì)胞吞噬，完成凋亡過程［29］。然而在RA中，TNF-α持續(xù)激活RA成纖維樣滑膜細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞微環(huán)境改變，最終反而使成纖維樣滑膜細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)而持續(xù)存活［30-31］。另一方面，有研究結(jié)果顯示，RA患者FLS中NLRP3炎癥小體的預(yù)活化依賴于TNF-α，且在NLRP3炎癥小體常用的體外激活劑Nigericin介異的NLRP3炎癥小體活化中，TNF-α預(yù)活化的細(xì)胞Caspase-1 p20的表達(dá)呈TNF-a濃度依賴性增加，IL-1β的分泌水平也顯著升高［32］,說明TNF-α也與焦亡密切相關(guān)。

本研究通過數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘獲得RA相關(guān)凋亡蛋白9個(gè)，焦亡蛋白15個(gè)，三者相互關(guān)聯(lián)蛋白4個(gè)，包括IL-6、IL-1β、CASP1等。分子對(duì)接結(jié)果顯示SX主要活性成分與TNF-α、Fas、Bax等蛋白均有較好的親和力；故選取凋亡關(guān)鍵蛋白Bax、Bcl-2、Fas、FasL和焦亡蛋白Caspase-1、焦亡細(xì)胞因子IL-1β和IL-18，及炎癥因子TNF-α進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果表明，SX能抑制MH7A細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，降低了TNF-α、IL-1β、IL18細(xì)胞因子的表達(dá)，上調(diào)Bax、Fas、FasL蛋白的表達(dá)量、降低Bcl-2及Caspase-1蛋白表達(dá)量，說明SX可以促進(jìn)凋亡，抑制焦亡，減緩炎癥反應(yīng)。我們推測(cè)SX處理后，TNF-α的釋放減少，一方面直接減緩MH7A細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和間接減少M(fèi)H7A細(xì)胞焦亡發(fā)生而減緩其炎癥反應(yīng)，另一方面導(dǎo)致MH7A細(xì)胞抗凋亡能力減弱，進(jìn)一步促進(jìn)凋亡，凋亡激活后，可以切割焦亡底物，阻斷了MH7A細(xì)胞焦亡發(fā)生，而焦亡抑制后，炎癥因子釋放減少，炎癥反應(yīng)進(jìn)一步得到減緩。此外，凋亡的發(fā)生可能還導(dǎo)致MH7A細(xì)胞遷移、侵襲等能力下降，進(jìn)而阻斷RA-FLSs的增殖擴(kuò)散，減緩RA。

綜上所述，SX可抑制RA-FLSs MH7A細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，促進(jìn)RA-FLSs MH7A細(xì)胞凋亡并抑制其焦亡，減輕炎癥反應(yīng)。其分子機(jī)制可能與降低TNF-α、IL-1β、IL18細(xì)胞因子的表達(dá)水平，促進(jìn)Bax、Fas、FasL，抑制Bcl-2和Caspase-1蛋白表達(dá)有關(guān)。該結(jié)果為SX臨床治療RA提供新依據(jù)，但SX通過調(diào)控細(xì)胞凋亡及焦亡相關(guān)信號(hào)通路或蛋白的表達(dá)來治療RA的具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。