抑制Notch1/Jagged1通路可促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞“歸巢”并改善哮喘

王 坤，朱慧志，楊 磊，徐晴雯，任馮春，劉向國

1 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031；2 徽學(xué)研究中心安徽中醫(yī)藥大學(xué)分中心，安徽 合肥 230031；3 安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230012；4 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031；5安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230012；6安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽 合肥230012

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的氣道免疫炎癥性疾?。?-2］，其中輔助T細(xì)胞Th1/Th2“漂移”在哮喘炎癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［3-4］。Th1/Th2間維持動態(tài)平衡是機(jī)體應(yīng)對外界刺激的基本免疫調(diào)節(jié)方式［5］。哮喘作為一種免疫疾病，在過敏原刺激下其發(fā)病以Th1/Th2間平衡向Th2“漂移”，形成炎癥反應(yīng)為主要特征［6］。積極有效地調(diào)控Th1/Th2“漂移”是治療哮喘的重要手段。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是骨髓中的成體干細(xì)胞［7］。既往研究發(fā)現(xiàn)［8-9］，BMSCs驅(qū)動的免疫調(diào)節(jié)可重新調(diào)控Th1/Th2平衡，減少Th2細(xì)胞因子，抑制嗜酸性粒細(xì)胞在肺組織的聚集，降低哮喘炎癥損傷。這一過程的前提是“歸巢”：組織發(fā)生炎癥損傷時(shí)，BMSCs向受損部位遷移。歸巢能在靶向部位發(fā)揮免疫效應(yīng)。BMSCs歸巢對哮喘中的免疫失衡雖有調(diào)節(jié)作用，但具體作用機(jī)制尚不明確。Notch信號通路廣泛參與細(xì)胞發(fā)育、分化及免疫調(diào)節(jié)等功能活動［10］。Notch 受體（Notch1等）和配體（Jagged1等）結(jié)合后，其胞內(nèi)段易位至細(xì)胞核，與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄阻遏物結(jié)合并作用，將其轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，活化下游靶基因的表達(dá)［11］。Notch 通路中的受體Notch1 和配 體Jagged1 是哮喘Th1/Th2 平衡向Th2“漂移”的關(guān)鍵因素。研究表明［12-13］，Jagged1蛋白參與了Th2細(xì)胞的發(fā)育，而Notch1通過促進(jìn)Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的表達(dá)，誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分化。BMSCs歸巢與Notch通路均與哮喘Th1/Th2“漂移”關(guān)系密切，其中可能存在更深入的關(guān)聯(lián)。為進(jìn)一步觀察Notch 通路是否參與哮喘BMSCs歸巢過程，本文擬通過阻斷Notch信號通路研究BMSCs歸巢對哮喘Th2型炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)及歸巢與Notch1/Jagged1通路的關(guān)聯(lián)性。旨在推測Notch信號通路可能參與了Th1/Th2“漂移”和BMSCs歸巢免疫調(diào)節(jié)，從而改善哮喘炎癥反應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級雄性SD 大鼠（20 只，體質(zhì)量180～200 g），用于實(shí)驗(yàn)分組。4周齡清潔級雄性SD大鼠（10只，體質(zhì)量80～100 g）用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及哮喘支氣管上皮細(xì)胞提取。以上大鼠均由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理中心提供。動物倫理由安徽中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批號：AHUCM-rats-2019005）。

1.1.2 主要設(shè)備和試劑 顯微鏡（OLYMPUS）；超聲霧化器（上海魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）；熒光定量PCR儀（Thermo）。流式細(xì)胞儀（貝克曼）。卵清蛋白（OVA）：V級（Sigma）；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（Invitrogen）；角蛋白8（keratin 8）抗體（Abcam）。CD29-異硫氰基熒光素（FITC）、CD45-FITC、CD44-藻紅蛋白（PE）、CD11b/c-PE單克隆抗體（eBioscience）。PCR試劑盒（賽默飛）；趨化因子受體4抗體（Proteintech）；Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（Beyotime）；T-bet、GATA-3、Notch1、Jagged1抗體（Santa Cruz）。

1.2 方法

1.2.1 分組 將20只大鼠用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組（NC）、模型對照組（MC）、BMSCs移植組（BMSCs）、BMSC+Notch抑制劑組，5只/組。

1.2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定 4周齡大鼠斷頸處死后，取股骨并剪去兩端，吸取胎牛血清+雙抗溶液多次沖出骨髓細(xì)胞后吹打，1000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS 重懸細(xì)胞，以2×106/cm2密度接種，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3～4 d更換1次培養(yǎng)基。原代細(xì)胞融合至80%～90%左右開始傳代培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。取融合達(dá)90%的第4代BMSCs，分別加入熒光標(biāo)記的抗體（Anti-CD29-FITC、Anti-CD44-PE、Anti-CD45-FITC、Anti-CD11b/c-PE），混勻，4 ℃避光孵育30 min，PBS漂洗2遍以去除未結(jié)合的抗體，流式細(xì)胞儀鑒定其表面標(biāo)志物。

1.2.3 CFSE標(biāo)記BMSCs 將熒光染料羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺（CFSE）以DMSO溶解，配成使用液，貯存于4 ℃條件下，避免反復(fù)凍融。移植前將5×106BMSCs細(xì)胞懸浮于2 mL 0.1%BSA/PBS 內(nèi)，加入2 μL CFSE工作液，置37 ℃10 min；4倍體積4 ℃的胎牛血清終止反應(yīng)，室溫5 min；PBS室溫洗滌3次，第2次結(jié)束后37 ℃5 min；將1×106BMSCs細(xì)胞懸浮于1 mL PBS內(nèi)，備用于移植。

1.2.4 哮喘模型建立［14］及細(xì)胞移植 除正常對照組外的各組大鼠，在第0和7天腹腔注射致敏混合液（含1 mg 10%卵清蛋白和100 mg氫氧化鋁凝膠），第14天將大鼠置于密閉容器內(nèi)，予1%卵清蛋白霧化激發(fā)，30 min/次，1次/d，連續(xù)7 d。正常組予生理鹽水替代完成上述操作。BMSCs組及BMSCs+Notch抑制劑組在激發(fā)最后一天經(jīng)尾靜脈將CFSE標(biāo)記的1×106/mL BMSCs懸液植入體內(nèi)，其余2組以PBS替代注射。BMSCs+Notch抑制劑組在激發(fā)前1 h按1 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射抑制劑，隔日1次，連續(xù)7 d。

1.2.5 哮喘支氣管上皮細(xì)胞的分離及鑒定 大鼠麻醉后在無菌環(huán)境下取出氣管，清除肺組織及表面其他軟組織后，灌入1%鏈酶蛋白酶，結(jié)扎上端，4 ℃過夜，置于90 mm培養(yǎng)皿中，剪開氣管,予培養(yǎng)基沖洗，細(xì)胞刷充分刷洗，收集培養(yǎng)皿中的刷洗液，離心洗滌收集細(xì)胞。1000 r/min離心5 min，棄上清，用原代細(xì)胞培養(yǎng)液吹打細(xì)胞后置于無菌培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，備用于實(shí)驗(yàn)。各組分離培養(yǎng)獲得的支氣管上皮細(xì)胞與角蛋白單克隆抗體作用后，經(jīng)細(xì)胞核熒光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢至肺組織觀察 在BMSCs移植后24、72、144 h取大鼠肺組織，將組織剪成1～2 mm3小塊，用消化酶消化，不銹鋼過濾網(wǎng)過濾消化液，調(diào)整各組全肺單個(gè)細(xì)胞懸液濃度，采用流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡分析CFSE-BMSCs（綠色）熒光強(qiáng)度。

1.3.2 支氣管上皮細(xì)胞CXCR4表達(dá)檢測 采用免疫熒光檢測支氣管上皮細(xì)胞CXCR4表達(dá)。將分離培養(yǎng)獲得的支氣管上皮細(xì)胞傳代，待長至80%～90%經(jīng)PBS洗滌、胰酶消化，充分吹打成單細(xì)胞懸液，接種于已置玻片的6孔板。爬片以4%多聚甲醛避光固定，滴加5%BSA均勻覆蓋。經(jīng)CXCR4抗體（1∶100），Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（1∶500）作用后，予以DAPI染色，封片，置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（DAPI紫外激發(fā)波長330～380 nm，發(fā)射波長420 nm，發(fā)藍(lán)光；CY3激發(fā)波長510～560 nm，發(fā)射波長590 nm，發(fā)紅光）。

1.3.3 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 取大鼠右下肺組織，石蠟包埋，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.3.4 哮喘大鼠肺組織Th1/Th2細(xì)胞表達(dá) 檢測各組大鼠肺組織IFN-γ、IL-5、IL-13的蛋白水平，操作方法按照美國Invitrogen的ELISA試劑盒操作步驟，用酶標(biāo)儀測定并計(jì)算各組蛋白含量。

1.3.5 肺組織Notch1/Jagged1通路相關(guān)基因表達(dá) 提取大鼠肺組織總mRNA，Notch1、Jagged1引物設(shè)計(jì)由上海生工合成（Notch1、Jagged1引物序列見表1）。反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄第一鏈互補(bǔ)DNA（cDNA），PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳，UVP凝膠顯像儀掃描，圖像分析。以β-actin作為內(nèi)源參照，使用2-ΔΔCT方法計(jì)算Notch1、Jagged1 mRNA的相對表達(dá)量。

表1 Notch1、Jagged1引物序列Tab.1 Primer sequences of Notch1 and Jagged1

1.3.6 肺組織T-bet、GATA-3、Notch1、Jagged1蛋白表達(dá)將肺組織在冷的組織裂解緩沖液中均勻化、溶解，提取肺組織總蛋白。將樣品放入標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品緩沖液中煮沸，用10%三甘氨酸凝膠進(jìn)行蛋白電泳，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜膜。將膜依次加入T-bet、GATA-3、Notch1、Jagged1一抗（稀釋濃度分別為1∶1000、1∶1000，1∶800、1∶1000）、二抗（山羊抗兔IgG，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，A0516）孵育，稀釋濃度為1∶5000，按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程對膜進(jìn)行顯影。使用發(fā)光試劑盒檢測試劑對這些條帶進(jìn)行曝光、顯影。Image J量化各個(gè)條帶的強(qiáng)度，并以相對于內(nèi)參β-actin的百分比表示T-bet、GATA-3、Notch1、Jagged1蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞觀察及鑒定

初次接種2 h后開始貼壁，細(xì)胞呈類圓形，密集分布，排列無序。原代培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞開始增殖，形態(tài)呈錘形或梭形。第3代未分化間充質(zhì)干細(xì)胞，形態(tài)均一呈成纖維細(xì)胞樣，漩渦狀分布，排列整齊有序。流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)，BMSCs表面標(biāo)志物CD29、CD44呈陽性，表達(dá)量分別為97.4%、96.5%。CD45、CD11b呈陰性，表達(dá)量分別為1.62%、1.08%（圖1）。支氣管上皮細(xì)胞鑒定：經(jīng)DAPI染色后細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，支氣管上皮細(xì)胞特異性目的蛋白keratin 8的抗體表達(dá)于胞漿，呈紅色熒光，鑒定為支氣管上皮細(xì)胞（圖2）。

圖1 BMSCs表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD45、CD11b表達(dá)Fig.1 Expression of BMSC surface markers CD29,CD44,CD45 and CD11b.

圖2 支氣管上皮細(xì)胞鑒定Fig.2 Identification of bronchial epithelial cells (Immunofluorescence staining,original magnification:×200).A:The nuclei of bronchial epithelial cells were blue after DAPI staining;B:The cytoplasm showed red fluorescence;C:Merged image.

2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢至肺組織觀察

通過將CFSE標(biāo)記BMSCs移植至哮喘大鼠體內(nèi)，追蹤C(jī)FSE表達(dá)量來反映BMSCs在肺組織中的歸巢程度。流式細(xì)胞術(shù)觀察肺組織CFSE表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，BMSCs體內(nèi)移植后，24 h CFSE表達(dá)量為（4.89±1.65）%，72 h CFSE表達(dá)量為（14.78±4.65）%，144 h CFSE表達(dá)量為（3.07±1.06）%，CFSE在肺組織表達(dá)量隨著時(shí)間推移逐漸升高，在72 h 達(dá)到高峰，后逐漸降低，證明移植后BMSCs可向肺組織歸巢，表明同源異體BMSCs經(jīng)尾靜脈注射入哮喘大鼠體內(nèi)后可向肺組織遷移（圖3）。

圖3 CFSE標(biāo)記的BMSCs在哮喘大鼠肺組織中表達(dá)Fig.3 Expression of CFSE-labeled BMSCs in lung tissues of asthmatic rats.A:Homing amount of CFSE+cells at 24 h.B:Homing amount of CFSE+cells at 72 h.C:Homing amount of CFSE+cells at 144 h.D:Comparison of CFSE expression across the time points.**P<0.01 vs 24 h;▲▲P<0.01 vs 72 h.

2.3 支氣管上皮細(xì)胞中CXCR4表達(dá)

NC組與MC組之間比較，MC組CXCR4表達(dá)量較NC 組升高（t=2.8271、P=0.0222）。BMSCs 移植及Notch 抑制劑干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，與NC 組、MC 組比較，BMSCs組、BMSCs+Notch抑制劑組CXCR4表達(dá)量均顯著升高（t=2.6021、P=0.0315，t=5.8649、P=0.0004）。與BMSCs組比較，BMSCs+Notch抑制劑組CXCR4表達(dá)量升高（t=3.254、P=0.0116，圖4）。

圖4 支氣管上皮細(xì)胞中CXCR4表達(dá)Fig.4 CXCR4 expression in bronchial epithelial cells (immunofluorescence staining,×200).A:NC group;B:MC group;C:BMSCs group;D:BMSCs+Notch inhibitor group;E:Comparison of relative expression of CXCR4 among the groups.*P<0.05,**P<0.01 vs NC group;ΔP<0.05,ΔΔP<0.01 vs MC group;▲P<0.05 vs BMSCs.

2.4 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察

NC組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，支氣管管腔無狹窄，管腔壁無增厚紊亂，周圍無明顯炎癥細(xì)胞浸潤。MC組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)受損明顯，支氣管管腔狹窄，平滑肌增生明顯，周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤，以嗜酸性粒細(xì)胞為主，成團(tuán)聚集。BMSCs組及BMSCs+Notch抑制劑組肺組織受損、管腔狹窄及炎癥細(xì)胞浸潤情況均較模型組有不同程度減輕（圖5）。

圖5 各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察Fig.5 Observation of pathologies of rat lung tissue in each group (HE staining,×200).A:NC group;B:MC group;C:BMSCs group;D:BMSCs+Notch inhibitor group.

2.5 肺組織Th1、Th2細(xì)胞因子表達(dá)

ELISA結(jié)果顯示，與NC組比較，MC組IFN-γ表達(dá)降低（t=5.2001、P=0.0008），IL-5、IL-13表達(dá)升高（t=4.2173、P=0.0029，t=3.7989、P=0.0052）。

與MC組比較，BMSCs組、BMSCs+Notch抑制劑組IFN-γ表達(dá)升高（t=2.653、P=0.0291，t=5.4014、P=0.0006）；BMSCs+Notch抑制劑組IL-5、IL-13降低（t=2.5386、P=0.0348，t=3.7295、P=0.0058）。BMSCs組IL-5（t=1.8189、P=0.1064）、IL-13（t=1.1298、P=0.2913）表達(dá)降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

與BMSCs組比較，BMSCs+Notch抑制劑組IFN-γ表達(dá)升高（t=2.7269、P=0.0260），IL-13降低（t=2.9032、P=0.0198，表2）。

表2 肺組織Th1/Th2細(xì)胞表達(dá)Tab.2 IFN-γ,IL-5 and IL-3 expressions in the lung tissue(Mean±SD,pg/mL,n=5)

表3 肺組織Th1、Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)Tab.3 Expression of Th1 and Th2 cell-specific transcription factor proteins in the lung(Mean±SD,n=5)

2.6 肺組織Th1、Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)

免疫印跡結(jié)果顯示，與NC組比較，MC組肺組織Th1 細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet 蛋白表達(dá)降低（t=5.3118、P=0.0007），Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3蛋白表達(dá)升高（t=5.9062、P=0.0004）。經(jīng)BMSCs移植及Notch1 通路阻滯劑后，與MC 組比較，BMSCs 組、BMSCs+N抑制劑組T-bet蛋白表達(dá)升高（t=4.2132、P=0.0029，t=5.9316、P=0.0003），BMSCs組、BMSCs+N抑制劑組GATA-3 蛋白表達(dá)降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表4，圖6）。

圖6 肺組織Th1、Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)Fig.6 Th1 and Th2 cell specific transcription factor protein expression in lung tissue.

2.7 肺組織Notch1/Jagged1表達(dá)

RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，與NC 組比較，MC 組Notch1、Jagged1 mRNA和蛋白表達(dá)升高（P<0.01）。與MC組比較，BMSCs組Notch1、Jagged1 蛋白表達(dá)降低，BMSCs+Notch抑制劑組Notch1、Jagged1mRNA和蛋白表達(dá)降低（P<0.05或P<0.01）。與BMSCs組比較，BMSCs+Notch抑制劑組Notch1mRNA表達(dá)降低（P<0.05，表5，圖7）。

圖7 肺組織Notch1、Jagged1蛋白表達(dá)Fig.7 Expression of Notch1 and Jagged1 protein in lung tissue.

表5 肺組織Notch1/Jagged1表達(dá)Tab.5 Expression of Notch1/Jagged1 in lung tissue(Mean±SD,n=5)

3 討論

哮喘作為免疫相關(guān)的疾病，是以Th1/Th2失衡誘發(fā)的Th2型免疫炎癥占主導(dǎo)［15］。骨髓反應(yīng)機(jī)制參與了哮喘炎癥的發(fā)生發(fā)展。在過敏原刺激下，Eos/B祖細(xì)胞自骨髓釋放量增多，經(jīng)外周循環(huán)周轉(zhuǎn)至肺，在Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5等調(diào)控下分化成熟，出現(xiàn)以嗜酸性粒細(xì)胞氣道浸潤為主的哮喘病理變化［16-17］。哮喘氣道炎癥反應(yīng)是多種炎癥細(xì)胞及細(xì)胞組分相互作用的結(jié)果［18］。過敏原刺激下，細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能下降，導(dǎo)致Th1/Th2平衡向Th2“漂移”，Th1細(xì)胞因子（IFN-γ等）分化受抑制，Th2炎癥因子（IL-5、IL-13等）大量產(chǎn)生，通過促進(jìn)肥大細(xì)胞募集，IgE合成，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤等方式，促進(jìn)哮喘炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展［19-20］。本研究結(jié)果顯示，與NC組比較，MC組IFN-γ表達(dá)降低，IL-5、IL-13表達(dá)升高。而Th1、Th2轉(zhuǎn)錄因子亦隨之變化，同時(shí)大量Th2型炎性因子分化并對相關(guān)炎癥介質(zhì)的調(diào)控作用，致使慢性氣道炎癥發(fā)生及加劇。此研究結(jié)果與Abdolreza等［21］的研究結(jié)果相似。

源于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化能力，增殖性高且具有良好的免疫調(diào)節(jié)性和免疫相容性。BMSCs通過調(diào)節(jié)免疫炎癥可有效改善哮喘［22］。哮喘發(fā)作時(shí)，BMSCs通過調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞功能，抑制相關(guān)炎癥細(xì)胞的分泌，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)劑的作用［23］。本次研究發(fā)現(xiàn)，將間充質(zhì)干細(xì)胞注射入哮喘大鼠體內(nèi)后，支氣管上皮細(xì)胞中CXCR4表達(dá)隨之升高，且肺組織病理形態(tài)學(xué)改善。說明BMSCs可有效緩解哮喘炎癥損傷。而改善的前提是“歸巢”，“歸巢”使得骨髓中休眠的BMSCs被炎癥損傷部位分泌的趨化因子“喚醒”，遷移至受傷的肺組織，免疫調(diào)節(jié)炎癥環(huán)境和修復(fù)受損肺組織，從而改善哮喘癥狀。Th1/Th2“漂移”即Th2型反應(yīng)模式是哮喘氣道炎癥的重要特征，也是哮喘炎癥形成的始動和維持因素。BMSCs具有免疫相容性和免疫調(diào)節(jié)的特征［24］。免疫相容性使得BMSCs不易被機(jī)體的免疫細(xì)胞識別，有效逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊排斥，為異體應(yīng)用提供可能［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)BMSCs 干預(yù)后，BMSCs 組、BMSCs+Notch抑制劑組IFN-γ表達(dá)升高，IL-5、IL-13表達(dá)降低。提示在機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時(shí)，受損部位釋放趨化因子與

BMSCs表面的趨化因子受體（CXCR4）結(jié)合，沿著趨化軸，BMSCs歸巢至炎癥損傷部位，調(diào)節(jié)免疫內(nèi)環(huán)境，發(fā)揮抑制炎癥和組織修復(fù)作用，從而改善哮喘大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。研究表明［26］，在哮喘的炎癥反應(yīng)中，BMSCs可通過分泌和調(diào)節(jié)生長因子、細(xì)胞因子、抗纖維化因子等實(shí)現(xiàn)旁分泌效應(yīng)，抑制T細(xì)胞的過度活化，改變Th1/Th2平衡，緩解哮喘氣道炎癥。

Notch信號通路廣泛參與多種組織細(xì)胞的信號識別、增殖、分化和凋亡等功能活動［27］。在哺乳動物中，Notch通路由Notch配體和Notch受體組成，它們都是I型跨膜蛋白［28］。受體與配體結(jié)合，在受體Jagged1觸發(fā)后由γ-分泌酶介導(dǎo)的蛋白水解機(jī)制釋放Notch胞內(nèi)域（NICD），通過與DNA 結(jié)合蛋白（DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄阻遏物）關(guān)聯(lián)介導(dǎo)了Notch信號的傳導(dǎo)［29］。這種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用可激活下游的基因［30］。Notch信號通路參與了對BMSCs的調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)［31］，Notch信號通路可抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用Jagged1處理BMSCs后，BMSCs中下游的基因mRNA水平顯著增加，BMSCs中的白蛋白表達(dá)被阻斷。研究還發(fā)現(xiàn)［32］，通過γ-促分泌酶抑制劑阻斷Notch 信號傳導(dǎo)或敲除BMSCs 中Notch 信號的轉(zhuǎn)錄因子RBP-J 可導(dǎo)致CXCR4表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)BMSCs在體外和小鼠肝臟缺血/再灌注模型體內(nèi)肝臟組織中對SDF-1的反應(yīng)，說明通過阻斷Notch信號傳導(dǎo)可上調(diào)BMSCs中的CXCR4表達(dá)以達(dá)到增強(qiáng)BMSCs歸巢能力的目的。本次研究結(jié)果顯示，與NC組比較，MC組Notch1mRNA、Jagged1mRNA表達(dá)升高，Notch1、Jagged1蛋白表達(dá)升高。說明哮喘發(fā)生時(shí)存在Notch信號通路受體和配體表達(dá)的變化。而通過BMSCs 植入歸巢后發(fā)現(xiàn)，BMSCs 組、BMSCs+Notch抑制劑組Notch1mRNA、Jagged1mRNA表達(dá)降低，且BMSCs+Notch抑制劑組Jagged1蛋白降低更明顯，說明抑制Notch通路過激活可促進(jìn)BMSCs歸巢，從而影響哮喘的進(jìn)展。

綜上所述，哮喘存在Th1/Th2平衡向Th2“漂移”，且BMSCs向哮喘肺組織歸巢對Th1/Th2“漂移”產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，而Notch1/Jagged1通路可能參與其過程，通過抑制Notch1/Jagged1通路過激活可改善哮喘炎癥的發(fā)作。